全 文 ：上海农业学报 199 2 , 8 ( 2 ) : 8 8一 9 0
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聚乙二醇沉淀法部分提纯香石竹斑驳病毒 ’
张 爱 平
(上海市园林科学研究所 , 上海 2 0 0 2 32)
摘 要 接种香石竹斑驳病毒四周后的高雪轮病叶用 2 倍体积磷酸缓冲液匀浆 . 滤液用氛仿
和正丁醉澄清 , 二轮聚乙二醇 ( P GE )沉淀 , 得到具有侵染活性的部分提纯的香石竹斑驳病毒 。 提纯制剂的 A 26 o / 2 8 0 值为 1 , 6 1 2 .病毒含 t s . g m g / ml 。与等t 福氏不完全佐剂乳化后 , 4 次肌肉注射家
免 , 得到双扩散效价为 l : 2 0 4 8 的专化抗血清 。 结果表明 , P GE 沉淀结合高速离心 ,是部分提纯香石
竹斑驳病毒的可行方法 。
关键词 香石竹斑驳病毒 , P E G 沉淀 ;部分提纯 ;抗血清制备
为了制备某种植物病毒抗血清 ,必须先得到纯度较高的浓缩病毒制剂 ,即必须提纯该种植
物病毒 。 香石竹斑驳病毒 ( ca r M v ) 的提纯一般采用一次聚乙二醇 ( P E G ) 沉淀结合差速离心的
方法 , 可以获得高纯度的病毒制剂厄’ ·么 3〕。 但因条件所限 ,很多科研机构和技术部门尚不备超速
离心机 ,给制备抗血清带来困难 。 为克服这一困难 ,本研究参考国内外有关单位用 P E G 沉淀法
粗提纯其它植物病毒的资料 仁`」, 对 ca r M v 的部分提纯方法进行了摸索 。
1
. 材料与方法
1
.
1 毒源 为本研究所分离鉴定的 C v 一 68 分离物 。 繁殖在高雪轮 ( is ha 。 二 1n , 必 )植株上 。
1
.
2 提纯程序 用接种四周后的高雪轮病 叶组织 , 以 2 倍于其体积的磷酸缓冲液 (P B )匀
浆 ( P B 0 . 5 m o一, 内含 0 . 0一 m o z抗坏血酸 , 0 . 1% 琉基 乙酸 , 1 0%蔗糖 , 0 . 0 1 m o l E D T A 一 N a , p H 7 .
2)
, 于 4℃冰箱过夜 ,再用双层尼龙纱布挤出病汁 。 病汁加 25 %氯仿 v( / V) ,搅拌 30 m in 。 冰箱
中静置分层后 ,上 层水相加 8%正 T 醇 ( V / V ) , 搅拌 1 5 m i n 。 4 o o o r / m i n 离心 l o m i n (转头 为
R P R 1 6
一
5 6 9
, 下同 ) ,取水相 , 加 1 0%聚乙二醇 ( P E G , M W 6 0 0 0 )和 3% N a e l ( w / V ) ,搅溶 l h , 冰
箱过夜 , 8 0 0 0 r / m 主n 离心 3 o m i n , 保留沉淀弃上清液 。 沉淀用少量 0 . o l m o l P B (含 0 . 0一m o 1E o -
T A 一 N a) 重悬浮 ,冰箱过夜 。 8 0 0 r / m in 离心 10 m in ,保留上清 ,沉淀再用 0 . 01 m of P B 重悬浮洗
2 次 。 3 次上清液合并后约为原病汁液体积的 1/ 5 。 这是第一轮 P EG 沉淀 。 合并上清液再加
1 0% P GE 和 3% N a cl ( w / V ) , 搅溶后冰箱过夜 , 然后 , 8 OO0 r / m in 离心 30 m in ,沉淀用相当于合
并液体积 1 / 1 0的 0 , 0一 m o l p B 重悬浮于冰箱过夜 , 8 0 0 0 r / m i n 离心 1 0 m i n ,弃沉淀 ,上清液即为
部分提纯的香石竹斑驳病毒制剂 。 离心机为日立 s c R 20 B A 。 用岛津 u v Z 1 0 0 紫外分光光度计
测定制剂纯度并计算其中的病毒含量 。
1
.
3 抗血清制备 部分提纯的病毒制剂与等量福氏不完全佐剂 (9 份液体石蜡加 l 份羊毛
脂 ,高压灭菌 )在玛瑙研钵中充分乳化 (标准为 ,乳化液滴在冰冷的蒸馏水表面基本不扩散 )后 ,
肌 肉注射体重 3 K g 左右的雄性家免 。 分 4次注射 ,每次间隔一周 。 末次注射后一周耳静脉采血
并测定效价 。 抗血清加等量甘油和少许 N a N : 后低温下保存 。
本文于 1 9 9 0年 8 月 6 日收到 , 1 9 9 1年 4 月 2 4 日收到修改稿 。
, 本研究为上海青年科学基金资助项目 。
工作中得到中国科学院上海生物化学研究所沈菊英女士 、 沈学仁先生的热情帮助 ,特致谢意 。
2期 张爱平 : 聚乙二醇沉淀法部分提纯香石竹斑驳病毒
2
. 结 果
2
.
1 病毒提纯 30 0克高雪轮病叶组织部分提纯得到 1 2ml 病毒制剂 。 紫外光谱吸收测定 ,
得到典型的病 毒核蛋白吸收曲线 (图 1 ) ,最高吸收峰在 2 6 0 n m ,最低吸收峰在 2 4 2 n m 。 A 2 6 0 /
2 8 0 为 1 . 6 1 2 ,病毒含量约为 5 . 9 m g / m l〔病毒含量 = ( A 2 6 0 / 4 . 9 ) x 2 0 , A 2 6 0 为制剂在 2 6 0 n m
处的吸收值 , 4 . 9 为 cI m 光程 aC r M v 的光密度值 , 20 为稀释倍数 5[] 〕。 提纯物在 H 一 30 0 电镜下
观察到大量的病毒粒体 ( 图 2 ) 。 制剂接种昆诺慕 (` 加肋网她1n 卯 i。 。 ) ,表现出 ca r M V 一 C v 一 68 的
典型症状 。 经昆诺黎为繁殖寄主进行重复试验 ,得到 A 2 6 0 / 2 8 0为 1 . 6 4 ,病毒含量为 .3 8 m g /m1
的提纯制剂 。
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图 I 部分提纯制剂紫外光谱吸收曲线
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图 2 部分提纯制剂中的病毒粒体 (标尺 : 240 nl )
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( E泊r r e沐已犯n st 2 4 0 nm )
2
.
2 抗血清分离及效价 分离获得的抗血清倍比稀释后分别用部分提纯样品和病汁液进
行琼脂双扩散反应测定效价 ,效价均达到 1 : 20 48 。
3
. 讨 论
获得纯净的病毒制剂是制备高质量抗血清的关键 。近几年来 , 国内有关单位采用差速离心
方法提纯了 aC r M v , 得到了 A 2 6 0 / 2 8 0分别为 .1 54 〔月和 1 . 6 9闭的病毒制剂 。 本研究参考提纯其
它植物病毒的资料川 ,结合本所的实际条件 ,采用二轮 PE G 沉淀加高速离心的方法 ,分别从高
雪轮和昆诺黎这两种繁殖寄主中成功地部分提纯 了 arC M v ,获得的病毒制剂的 A 2 6。 / 2 8 。值
分别为 1 . 6 1 2 和 1 . 6 4 4 。 制备的抗血清双扩散效价高达 1 , 2 0 4 8 。 国内已报道约有 l : 2 0 4 81 〕
和 1 , 5 12 zI[ 。 这说明 ,二轮 P E G 沉淀法用于 aC r M v 的部分提纯是可行的 ,所制备的抗血清质
量是可靠的 。 在 P E G 沉淀法提纯病毒的过程中 ,保证 PE G 足够的作用时间和掌握好高速离心
时间是重要环节 。 今后拟用相似的方法进行另一种香石竹病毒的提纯 ,并将抗血清用于生产单
位的种苗带毒状况的检测 。
9 0 上 海 农 业 学 报 8 卷
参 考 文 献 ( R ef r ea e n e e)
[l 〕于嘉林 . 刘 仪. 我国发生的一种香石竹斑驳病毒株系的研究· 病毒学杂志 , 1 9 8 , ( 3 ) 3 0 0一 305
〔2〕于善谦 , 等 . 香石竹斑驳病毒抗血清制备及检初 . 华东植病分会二届年会论文集 , 1 9 8 7
[ 3〕 H o l l in , , 0 . M . , S t o n e , o · M · ca r n a t i on m o t t l e v i r u s , c M I /A人卫 D es c r i . p lan r v i r us es , 1 9 7 0 , No . 7
[ 4〕胡伟贞 , 由雪娟 ,等 · 用聚 乙二醇沉淀法粗提纯植物病毒 . 植物检疫 , 19 89 , 3 ( 3) 173 一 1 76
[ 5〕 田波 , 斐美云 · 植物病毒研究方法 . 北京 ,科学出版社 , 19 87 , 1 85 一 1 91
P A R T I A L P U R I F I C A T I O N O F C A R N A T I O N M O
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【成果摘要】
塑料大棚蔬菜生理障碍及其防治研究
施秀珠 奚振邦 朱建萍 蒋小华
(上海市农业科学院土壤肥料研究所 .上海 20 1 1 0 6)
本项研究系上海市科委下达的课题 。 自 1 9 8 8年开始 ,对蔬菜大 (中 )棚中土壤的水盐动态机理及相应的施
肥 、 灌溉 、 耕作技术开展了系统的调查和试验研究 .
通过 3年多的调研 、 对比试验 、 生产性示范和定点连续测定 , 已对大棚条件下 , 土壤水盐和养分的土层分布
和动态 ;不同棚龄土壤次生盐演化的聚盐特征 ,不同栽培管理措施 ,特别是灌排水 、 施肥 、 盖揭膜等对棚内作物
生育和土壤聚盐的影响等取得了一定的进展 .
经多点试验 ,采用综合性防治措施的期望棚比对照棚增产 10 . 2 % ,增值 1 5 . 6% 。 1 9 8 9 年后采取边试验边
示范的方法 , 示范推广 2 x l护 耐左右 ,按期望棚比对照棚增值 258 元 / 66 6 . 7 砰 、 节约人工费 40 元 / 66 6 . 7砰
计 , 合计约增值 30 0 元 / 6 6 6 . 7 m气共获社会经济效益 9 x l少 元 。 郊区各县蔬菜生产技术推广部门 , 已于 1 9 9 1年
秋全面推广上述行之有效的措施 , 如本市能在 2年内推广 6 6 . 7 x 1 0’ m , , 按每 6 6 . 7 m 2 增值 30 元计 ,预计可
增值 3 x lo “ 元 ,本项研究的潜在社会效益巨大 。