全 文 ：第 51 卷 第 10 期
2 0 1 5 年 10 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 10
Oct．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20151008
收稿日期: 2015 － 01 － 03; 修回日期: 2015 － 03 － 17。
基金项目: 国家自然科学基金项目“MAPK 级联途径在调控毛果杨干旱、高盐胁迫信号转导中的作用及其机制的研究”(31470661) ; “干
旱、高盐胁迫耐受性相关的胡杨 PeNAC 基因的功能解析”(31570649) ; 山东省自然科学基金项目“高盐、干旱胁迫诱导的两个杨树 PtMKK 基
因的功能解析”(ZＲ2013CM018)。
* 宿红艳为通讯作者。
毛果杨中与 PtMKK4 互作的 PtMPKs的
筛选及验证*
王 磊1 宿红艳2 顾 亮3 常志远2 陈 娜2
(1． 鲁东大学生命科学学院 烟台 264025; 2． 鲁东大学农学院 烟台 264025; 3． 烟台市农业科学研究院果树研究所 烟台 265500)
摘 要: 【目的】在外界刺激传递到胞内引起细胞响应的信号转导网络中，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联
途径处于中心环节。该途径由 MAPKKK，MAPKK 和 MAPK 3 种蛋白激酶组成，各组分之间以逐级磷酸化的方式构
成信号放大途径，特异感受上游刺激，将信号放大并向下传递给靶蛋白。迄今尚未在杨树中确定一条完整的
MAPK 信号通路。毛果杨 MAPKK 成员 PtMKK4 在干旱信号转导中发挥重要作用，筛选、鉴定其进一步激活的靶标
MAPKs 将为深入理解 MAPK 级联途径调控植物逆境响应机制提供重要信息。【方法】利用酵母双杂交和双分子荧
光互补技术筛选、鉴定与 PtMKK4 互作的 MAPKs，并采用半定量 PCＲ 方法对筛选到的 PtMPKs 在干旱和高盐胁迫
处理下表达水平的变化进行分析。【结果】分别构建 pGBKT7-PtMKK4 诱饵表达载体和 pGADT7-PtMPKs 猎物表达
载体，共转化酵母 Y2H 感受态细胞。仅共转化 pGBKT7-PtMKK4 和 pGADT7-PtMPK6-1 的酵母菌可在营养缺陷型筛
选培养基 SD / － Ade / － Trp / － Leu / － His 和 SD / － Ade / － Trp / － Leu / － His /X-α-gal 中生长，且在 SD / － Ade / － Trp /
－ Leu / － His /X-α-gal 中生长的菌落显示蓝色。双分子荧光互补试验进一步证实 PtMKK4 和 PtMPK6-1 存在蛋白互
作。此外，与 PtMKK4 相似，PtMPK6-1 可被 20% PEG 和 200 mmol·L － 1 NaCl 诱导表达。【结论】在毛果杨 MAPK 级
联途径中，PtMPK6-1 可能为 PtMKK4 激活的靶标。
关键词: 毛果杨; MAPK 级联途径; 酵母双杂交; 双分子荧光互补
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)10 － 0060 － 07
Screening and Verification of PtMPKs Interacting with PtMKK4 of Populus trichocarpa
Wang Lei1 Su Hongyan2 Gu Liang3 Chang Zhiyuan2 Chen Na2
(1 ． College of Life Sciences，Ludong University Yantai 264025; 2 ． College of Agriculture，Ludong University Yantai 264025;
3 ． Fruit Institute，Yantai Academy of Agricultural Sciences Yantai 265500)
Abstract: 【Objective】Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades play central roles in the signal transduction
networks from external stimuli to the intracellular responses． A typical MAPK cascade consists of three subsequently acting
protein kinases，a MAP kinase kinase kinase (MAPKKK)，a MAP kinase kinase (MAPKK) and finally，the MAP kinase
(MAPK) ． Poplar is not only the model organism of forest research，but also the important economic tree species of China．
Thus，it is of great significance to carry out research on the MAPK signal pathways of poplar under various stress
conditions． To date，a complete MAPK signal pathway has not yet been established in poplar． PtMKK4 has been shown to
be involved in mediating the drought signal in Populus trichocarpa． It will provide insights into the molecular mechanism of
MAPK cascades regulating the plant stress responses to identify the downstream PtMPKs target of PtMKK4． 【Method】In
this study，yeast two-hybrid system and bimolecular fluorescence complementation ( BiFC) were performed to screen and
verify of the PtMPKs，which interacted with PtMKK4． Semi-quantitative ＲT-PCＲ was used to analyze the expression patterns
of the identified PtMPKs under drought and high salinity conditions． 【Ｒesult】pGBKT7-PtMKK4 bait plasmid and pGADT7-
PtMPKs prey plasmids were constructed，respectively，and co-transformed into the yeast Y2H competent cells． The results
showed that only the Y2H cells transformed with pGBKT7-PtMKK4 and pGADT7-PtMPK6-1 plasmids could grow in the
nutrient deficient media SD / － Ade / － Trp / － Leu / － His and SD / － Ade / － Trp / － Leu / － His /X-α-gal，and furthermore
第 10 期 王 磊等: 毛果杨中与 PtMKK4 互作的 PtMPKs 的筛选及验证
the yeast colonies in the SD / － Ade / － Trp / － Leu / － His /X-α-gal medium were blue． The BiFC results also confirmed
that PtMKK4 interacted with PtMPK6-1． Besides，the identified PtMPK6-1 could be induced by 20% PEG and 200 mmol
·L － 1 NaCl，which was similar to PtMKK4 ． 【Conclusion】These results above indicated that PtMPK6-1 may be the
downstream target of PtMKK4 in P． trichocarpa．
Key words: Populus trichocarpa; MAPK cascades; yeast two-hybrid system; bimolecular fluorescence complementation
逆境信号的快速传递是植物感知并主动应对外
界环境变化的主要策略之一，蛋白质可逆磷酸化在
信号从外界传递到胞内引起细胞响应的信号转导网
络中发挥重要作用，因此，促分裂原活化蛋白激酶
(mitogen-activated protein kinase，MAPK)级联途径
备受关注 ( Xiong et al．，2002; Ｒasmussen et al．，
2012; Samajová et al．，2013)。该途径在真核生物中
高度保守，由 3 种蛋白激酶组成: MAPKKK (MAP
kinase kinase kinase)，MAPKK (MAP kinase kinase)
和 MAPK，各组分之间以逐级磷酸化的方式构成信
号放大途径，特异感受上游刺激，将信号放大并向下
传递给靶蛋白。在这一过程中，MAPKK 激酶位于
MAPK 级联途径的关键环节，MAPKK 通过整合不同
MAPKKK 接受的多种信号，并将这些信号传递给下
游 MAPK(Morris，2001; Ｒodriguez et al．，2010)。
植物 MAPK 级联途径在生物及非生物胁迫信
号传递过程中发挥重要作用。目前，相关研究成果
主要来自 于 拟南芥 ( Arabidopsis thaliala )、水 稻
(Oryza sativa)、番茄 ( Solanum lycopersicum )、玉米
(Zea mays)、蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula)、烟草
(Nicotiana tabacum)等草本植物 ( Colcombet et al．，
2008; Ｒao et al．，2010)。这些研究表明，MAPK 级
联途径中的成员能被高渗、高盐、低温、干旱、机械损
伤及病原体侵染等多种生物和非生物胁迫激活，继
而引发一系列下游事件的发生，如防御基因的表达、
过敏性反应等，从而参与调控植物对这些胁迫的耐
受性(Zhang et al．，2001; Kim et al．，2004; Xie et al．，
2012; Xu et al．，2014)。但目前关于多年生林木
MAPK 的研究非常有限。
杨树(Populus)是林木研究的模式生物，同时也
是我国重要的经济树种，目前关于杨树 MAPK 信号
途径的报道甚少。毛果杨(P． trichocarpa)是首个已
破译全基因组序列的树种，其高效的遗传转化体系
有利于获得转基因植株，丰富的数据库资源为对转
基因植株开展更深入的分子生物学分析提供了必要
的平台。Nicole 等(2006)曾对毛果杨中的 PtMKKs
(P． trichocarpa MAPKKs)和 PtMPKs( P． trichocarpa
MAPKs)的结构特征、染色体定位和组织器官表达模
式进行了分析，但关于 PtMPKs 和 PtMKKs 功能的研
究尚未见报道。在前期研究中，本课题组采用实时
定量 PCＲ( quantitative real-time ＲT-PCＲ，qＲT-PCＲ)
技术分析了毛果杨的 11 个 PtMKKs 对干旱、高盐、
氧化等胁迫以及脱落酸( abscisic acid，ABA)、茉莉
酸( jasmonic acid，JA)和水杨酸( salicylic acid，SA)
等胁迫相关信号分子的响应情况，其中 PtMKK4 表
达水平在多种胁迫及信号分子处理之后均发生变
化。过量表达 PtMKK4 可提高转基因杨树的耐旱
性，表明 PtMKK4 在杨树干旱信号转导中发挥重要
作用(Wang et al．，2014)。在此基础上，本研究利用
酵母双杂交技术筛选到 1 个与 PtMKK4 互作的
PtMPK 成员 PtMPK6-1，并通过双分子荧光互补技术
( bimolecular fluorescence complementation，BiFC)进
一步验证; 进而，采用半定量 PCＲ 技术分析了
PtMPK6-1 对干旱和高盐胁迫处理的响应模式，为探
明 PtMKK4 在介导毛果杨干旱信号转导过程中激活
的靶标奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
毛果杨组培苗为本实验室保存。酵母菌株
Y2H、酵母双杂交载体 pGADT7 及 pGBKT7，X-α-gal
购自 Clontech 公司; 双分子荧光互补载体 pSPYNE-
35S，pSPYCE-35S 为本实验室保存; pGM-T 质粒载
体、T4 连接酶购自北京天根生化科技有限公司; 限
制性内切酶购自 Takara 公司; 酵母转化试剂盒及各
种营养缺陷型培养基购自北京泛基诺科技公司。引
物合成和测序由上海生工生物工程公司完成。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 PtMPKs 基因的获得 1) 材料处理 取在
生根培养基上培养 2 ～ 3 周根长至 3 ～ 4 cm 的毛果
杨组培苗，分别进行 200 mmol·L － 1 NaCl，4 ℃，20%
PEG 模拟干旱等胁迫以及 100 μmol·L － 1 ABA，100
μmol·L － 1 JA，100 μmol·L － 1 SA 等信号物质处理
8 h，液氮迅速冷冻，保存 － 80 ℃超低温冰箱备用。
2) ＲNA 的提取及反转录 各样品总 ＲNA 的提
取参照 ＲNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)说明书进
行。采用 cDNA using the PrimeScript First Strand
cDNA Synthesis K( Takara)进行反转录，合成 cDNA
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林 业 科 学 51 卷
的第 1 条链。
3) PtMPKs 基因扩增 根据在 NCBI 数据库中
搜索到的毛果杨 PtMPKs 基因 OＲF 两端的序列设计
引物，以 1. 2. 1 2)中合成的各种 cDNA 为模板，进行
ＲT-PCＲ。扩增体系为 25 μL，包括: 10 × buffer(含
Mg2 + )2. 5 μL，dNTP(2. 5 mmol·L － 1 )2 μL，上、下游
引物 ( 10 μmol·L － 1 ) 各 1 μL，模板 2 μL，Taq
0. 25 μL。PCＲ 扩增的条件为: 94 ℃ 3 min 预变性
后，94 ℃ 40 s，52 ～ 56 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，扩增 35
个循环。获得 14 条 PtMPKs 基因的相应扩增产物，
克隆到 pGM-T 载体中，进行测序，将所得序列输入
NCBI 中进行 BLAST 比对，确定为目的片段。
1. 2. 2 酵母表达载体的构建 1) 诱饵表达载体的
构建 根据 PtMKK4 OＲF 两端序列设计特异引物，
引物 5端加上相应酶切位点(表 1)，以本实验室保
存的质粒 pGM-PtMKK4 为模板，进行扩增。将目的
片段定向插入 pGBKT7 载体中，构建的 pGBKT7-
PtMKK4 重组载体经酶切和测序进行验证。
2) 猎物表达载体的构建 根据 PtMPKs OＲF
两端序列设计特异引物，引物 5端加上相应酶切位
点(表 1)，以获得的质粒 pGM-PtMPKs 为模板，进行
扩增。将目的片段定向插入 pGADT7 载体中，构建
的 pGADT7-PtMPKs 重组载体，经酶切和测序进行
验证。
表 1 构建酵母表达载体所用的引物①
Tab． 1 The primers used in constructing the yeast expression vectors
引物名称
Name of primer
序列
Sequence (5—3)
PtMKK4-EcoＲ CGGAATTCATGAAACCAGTTCAACCACC
PtMKK4-Sal GCGAGTCGACCTACCCTCTCCAGCTCTTCT
PtMPK1-EcoＲ CGGAATTCATGGCAACATGGCAACACCAGTTGAGCC
PtMPK1-BamH ATGGATCCTTAGGAGCGCACCTCGCCAT
PtMPK2-EcoＲ CGGAATTCATGGCAGCTCCAGTTGAGCC
PtMPK2-BamH ACGGATCCTTAACAGACGAGATTAGGAG
PtMPK3-1-Nde GGAATTCCATATGATGGCGAATTATGCACAGGG
PtMPK3-1-Xho CCGCTCGAGCTAGCATGCATATTCTGGAT
PtMPK3-2-EcoＲ CGGAATTCATGGCAAATTACGCACCGGG
PtMPK3-2-BamH ACGGATCCTTATGCATATTCTGGATTGA
PtMPK4-Nde GGAATTCCATATGATGACAAGCTTAGAGTCAAG
PtMPK4-Xho CCGCTCGAGTCACGAATCTGGATTGAAGT
PtMPK6-1-BamH ACGGATCCATATGGACGGTGGAGGTACGGC
PtMPK6-1-Xho CATCTCGAGCTAGTTCTGGTATTCAGGGT
PtMPK7-EcoＲ CGGAATTCATGGCAACTTTAGTGGAGCC
PtMPK7-BamH ATGGATCCCTACTTACGAGCTAACACAG
PtMPK9-1-Nde GGAATTCCATATGATGGGGTGGGAGTGGAACGCT
PtMPK9-1-Xho CCGCTCGAGCTACAAGGCTGCACCTTTT
PtMPK9-2-Nde GGAATTCCATATGATGGGGTGGGAGTGGAACGCT
PtMPK9-2-Xho CCGCTCGAGCTACAAGGTTGCAACCTTCT
PtMPK11-EcoＲ CGGAATTCATGTCCAGAGTCAAG
PtMPK11-BamH ATGGATCCTCAAGGACCTGGATTGAAGT
PtMPK14-EcoＲ CGGAATTCATGGCAACTTTAGTGGAGCC
PtMPK14-BamH GCGGATCCCTATCTATTTGCGAAAACAA
PtMPK16-1-Nde GGAATTCCATATGATGCAGCCTGATCAGCGCAA
PtMPK16-1-Xho CCGCTCGAGTTAATACCAGTGATTACCAG
PtMPK17-EcoＲ CGGAATTCATGCTTGACAGAGATTTTTT
PtMPK17-BamH GCGGATCCTCAGAGAGCATGTACCTGGC
PtMPK20-1-Nde GGAATTCCATATGATGCAGCAGCAAGATCATAG
PtMPK20-1-Xho CCGCTCGAGCTAGTACATCCTTGCCATAC
①表中下划线为相应的酶切位点。The sequences underlined are the corresponding restriction enzyme sites．
1. 2. 3 诱饵蛋白的自身激活及毒性检测 按照北
京泛基诺酵母转化试剂盒说明书制备 Y2H 酵母感
受态 细 胞，将 载 体 pGBKT7-PtMKK4 和 空 载 体
pGBKT7 分别转化感受态细胞。将转化的菌体分别
涂布于 SD / － Trp，SD / － Trp / － His 固体培养平板，
30 ℃ 培养 3 ～ 5 天，观察菌落生长情况，检测诱饵蛋
白的自身激活。
1. 2. 4 酵母双杂交筛选与 PtMKK4 互作的蛋白
将质粒 pGBKT7-PtMKK4 和 pGADT7-PtMPKs 质粒
共转 化 酵 母 Y2H 感 受 态 细 胞，菌 液 涂 布 在
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第 10 期 王 磊等: 毛果杨中与 PtMKK4 互作的 PtMPKs 的筛选及验证
SD / － Trp-Leu 固体平板上，培养 3 ～ 4 天。挑取生
长状态良好的酵母单克隆在 SD / － Ade / － Trp /
－ Leu / － His 和 SD / － Ade / － Trp / － Leu / － His /
X-α-gal平板上进行筛选培养 3 ～ 5 天，将筛选到的
阳性克隆进行菌落 PCＲ 验证。
1. 2. 5 双分子荧光互补验证 PtMKK4 与 PtMPKs 互
作 双分子荧光检测参考 Walter 等(2004)方法进
行，将 PtMKK4 和 PtMPKs 去掉终止子的 cDNA 片段
分别插入到 pSPYNE-35S 和 pSPYCE-35S 载体中，转
化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101，侵染 1
月龄本生烟 ( Nicotiana benthamiana)叶片背面，隔
2 ～ 3 天后取下表皮在共聚焦显微镜下观察荧光。
激发光为 488 nm，接收波长设为 510 ～ 540 nm，扫描
结果设为绿色。以共注射 pSPYNE-35S、pSPYCE-
35S 烟草叶片作为阴性对照。
1. 2. 6 PtMPK6-1 对干旱和高盐胁迫的响应模式分
析 利用半定量 PCＲ 分析 PtMPK6-1 在 NaCl 和
PEG 处理后表达水平的变化。按照 1. 2. 1 1)对毛
果杨组培苗进行 200 mmol·L － 1 NaCl 和 20% PEG 模
拟干旱胁迫处理，分别在处理后 1，3，6，12 h 取样，
液氮迅速冷冻。提取各样品总 ＲNA，并进行反转
录。参照 Nicole 等(2006)设计特异引物 PMK6-1-1:
5-TCCCAACTGTCCACCCGGCAGCTATTG-3 和
PMK6-1-2: 5-CATTGTGACTGGTCAGCTTGA -3，进
行 PCＲ 扩增。以 PtCDC 基因为扩增内部参照，扩增
引物为 CDCf: 5-ATTCCCCAAGTGGCCTTCTAAG-3
和 CDCr: 5-TATTCATGCTCCAAAGCACTCC-3。
PCＲ 扩增的条件为: 94 ℃ 3 min 预变性后，94 ℃
20 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，扩增 30 个循环，而
PtCDC 扩增 28 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min。
2 结果与分析
2. 1 PtMPKs 基因的扩增
分别提取毛果杨雄花序、雌花序以及用 NaCl，
PEG，ABA，JA，SA，4 ℃低温等分别处理 8 h 的组培
苗的总 ＲNA，并将其反转录成 cDNA。以上述制备
的各种 cDNA 为模板，进行 PCＲ 扩增，获得了 14 个
PtMPKs 的 扩 增 产 物，包 括: PtMPK1，PtMPK2，
PtMPK3-1，PtMPK3-2，PtMPK4，PtMPK6-1，PtMPK7，
PtMPK9-1， PtMPK9-2， PtMPK11， PtMPK14，
PtMPK16-1，PtMPK17，PtMPK20-1。测序后，将所得
到的 14 条序列与 NCBI 中的核苷酸序列进行
BLAST 比对，证实为相应的 PtMPKs 基因，BLAST 后
获取的各基因的 GenBank 登录号见表 2。
表 2 各 PtMPKs 对应的 GenBank 中的登录号
Tab． 2 The accession numbers corresponding to
each PtMPKs in GenBank
基因名称
Gene
登录号
Accession
number
基因名称
Gene
登录号
Accession
number
PtMPK1 XM_002301981 PtMPK9-1 XM_002322057
PtMPK2 XM_006383654 PtMPK9-2 XM_002317846
PtMPK3-1 XM_002313981 PtMPK11 XM_002302563
PtMPK3-2 XM_002298414 PtMPK14 XM_002310232
PtMPK4 XM_002320782 PtMPK16-1 XM_002312701
PtMPK6-1 XM_002310362 PtMPK17 XM_002314770
PtMPK7 XM_006383098 PtMPK20-1 XM_002307508
2. 2 与毛果杨 PtMKK4 互作的 PtMPKs 的筛选
将 PtMKK4 OＲF 全长和质粒 pGBKT7 经 EcoＲ I
和 Sal I 双酶切后，用 T4 DNA 连接酶连接过夜，构
建重组质粒 pGBKT7-PtMKK4，酶切及测序比对后证
实成功获得了 PtMKK4 与 BD 融合的诱饵表达载
体。将 pGBKT7-PtMKK4 转入酵母感受态细胞中，
证实 pGBKT7-PtMKK4 无自激活活性，可以用于进
一步猎物蛋白的筛选。
为了筛选与 PtMKK4 互作的 PtMPKs，进一步构
建 PtMPKs 与 AD 融合的诱饵表达载体。酶切及测
序结果证实 14 个 PtMPKs OＲF 全长已分别定向插
入到 pGADT7 载体中，所得的重组质粒命名为
pGADT7-PtMPKs。将 pGBKT7-PtMKK4 分别和 14 个
pGADT7-PtMPKs 共转化酵母。结果显示 (图 1A)，
共转化 pGBKT7-PtMKK4，pGADT7-PtMPKs 的酵母
菌均可以在 SD / － Trp / － Leu 正常生长，而仅共转化
pGBKT7-PtMKK4，pGADT7-PtMPK6-1 的酵母菌可在
营养缺陷型筛选培养基 SD / － Ade / － Trp / － Leu /
－ His和 SD / － Ade / － Trp / － Leu / － His /X-α-gal 中
生长，且在 SD / － Ade / － Trp / － Leu / － His /X-α-gal
生长的菌落显示蓝色，暗示 PtMKK4 与 PtMPK6-1 在
酵母中存在相互作用。
2. 3 BiFC 验证 PtMKK4 与 PtMPK6-1 之间的
互作
采用 BiFC 进一步验证 PtMKK4 与 PtMPK6-1
之间的相互作用。结果显示，在共聚焦显微镜下
共 注 射 pSPYNE-PtMKK4 和 pSPYCE-PtMPK6-1
的烟草表皮细胞中可观察到细胞核中有强荧光
信号，细胞质中也有微弱的荧光信号，而共注射
pSPYNE 和 pSPYCE 的对照中未检测到荧光信号
(图 1B)。
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林 业 科 学 51 卷
图 1 与 PtMKK4 互作的 PtMPKs 的筛选与验证
Fig． 1 Screening and verification of PtMPKs interacting with PtMKK4
A: 酵母双杂交筛选与 PtMKK4 互作的 PtMPKs 1: 共转化 pGBKT7-PtMKK4 和 pGADT7 的酵母菌作为对照; 2-15: 共转化 pGBKT7-PtMKK4
和 pGADT7-PtMPKs 的 酵 母 菌，pGADT7-PtMPKs 依 次 为 pGADT7-PtMPK1， pGADT7-PtMPK2， pGADT7-PtMPK3-1， pGADT7-PtMPK3-2，
pGADT7-PtMPK4，pGADT7-PtMPK6-1， pGADT7-PtMPK7， pGADT7-PtMPK9-1， pGADT7-PtMPK9-2， pGADT7-PtMPK11， pGADT7-PtMPK14，
pGADT7-PtMPK16-1，pGADT7-PtMPK17，pGADT7-PtMPK20-1。
B: BiFC 验证 PtMKK4 和 PtMPK6-1 之间的互作 箭头所指为细胞核，标尺为 25 μm。
A: Screening the PtMPKs interacting with PtMKK4 using the yeast two-hybrid system 1: The yeast co-transformed into pGBKT7-PtMKK4 and pGADT7
plasmids as control; 2 － 15: The yeast strains co-transformed into pGBKT7-PtMKK4 and pGADT7-PtMPKs plasmids． The pGADT7-PtMPKs plasmids
are pGADT7-PtMPK1，pGADT7-PtMPK2，pGADT7-PtMPK3-1，pGADT7-PtMPK3-2，pGADT7-PtMPK4，pGADT7-PtMPK6-1，pGADT7-PtMPK7，
pGADT7-PtMPK9-1， pGADT7-PtMPK9-2， pGADT7-PtMPK11， pGADT7-PtMPK14， pGADT7-PtMPK16-1， pGADT7-PtMPK17 and pGADT7-
PtMPK20-1 sequentially．
B: Verification of the interaction between PtMKK4 and PtMPK6-1 using BiFC The arrows indicate the nucleus． Bar，25 μm．
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第 10 期 王 磊等: 毛果杨中与 PtMKK4 互作的 PtMPKs 的筛选及验证
2. 4 PtMPK6-1 对干旱和高盐的响应模式分析
采用半定量 PCＲ 技术分析 PtMPK6 -1 基因
在干旱和高盐胁迫过程中表达量的变化。结果
显示 ( 图 2 ) ， 200 mmol·L － 1 NaCl 处 理 后，
PtMPK6 -1 转录水平呈现上升趋势，6 h 时达到
最高水平，之后下降。而 20% PEG 处理 1 h 后
PtMPK6 -1 迅速 上升，之 后 下 降。以 上 结 果 表
明，PtMPK6 -1 是干旱和高盐诱导条件下差异表
达的基因，暗示其在毛果杨干旱和高盐胁迫适
应过程中起作用。
图 2 PtMPK6-1 表达水平对 NaCl 和 PEG 处理的响应模式
Fig． 2 The expression pattern of PtMPK6-1 under NaCl and PEG treatments
3 讨论
植物 MAPK 的研究始于 20 世纪 90 年代后期，
鉴定出的第 1 条 MAPK 信号通路是拟南芥中的
AtMEKK1-AtMEK1-AtMPK4 通路，能传递干旱和机
械损伤信号 ( Ichimura et al．，1998)。此后，相继在
多种植物中进行了 MAPK 基因的克隆、鉴定以及上
下游事件的解析等一系列研究。研究证实，植物
MAPK 级联途径在生物及非生物胁迫信号传递过程
中发挥重要作用(Yang et al．，2010; Xie et al．，2012;
Xu et al．，2014)。但迄今关于 MAPK 调控植物逆境
信号转导的作用机制还远未阐述清楚。在今后的研
究中进一步分离鉴定 MAPK 新成员，探明 MAPK 级
联途径各组分之间的互作机制，解析 MAPK 级联途
径的上游和下游分子事件，完善现有的 MAPK 级联
途径模型，将对全面了解植物中这一精细复杂调控
方式具有重要意义。
PtMKK4 是首个从毛果杨中鉴定出的参与干旱
胁迫信号转导的 MAPKK，但对于 PtMKK4 进一步激
活的靶标 MAPKs 尚不明确(Wang et al．，2014)。前
人的研究表明，PtMKK4 在拟南芥中同源蛋白
AtMKK4 可激活 AtMPKs 传递生物及非生物胁迫信
号。例如，MKKK1-MKK4 /5-MPK3 /6 途径被一种细
菌的鞭毛蛋白 flg22 激活，最终诱导早期防卫基因的
转录( Ichimura et al．，2006; Suarez-Ｒodriguez et al．，
2007)。Kim 等 (2011 )利用凝胶激酶活性检测发
现，在 NaCl 处理条件下野生型拟南芥中的 AtMPK3
激酶活性高于 atmkk4 突变体，但低于 AtMKK4 过表
达转基因植株，表明 AtMPK3 激酶活性与 AtMKK4
表达量成正相关，AtMKK4 通过激活 AtMPK3 传递
渗透胁迫信号。本研究中，利用酵母双杂交系统筛
选到 1 个与 PtMKK4 互作的 MAPK 成员 PtMPK6-1，
双分子荧光互补技术进一步验证了 PtMKK4 与
PtMPK6-1 存在蛋白互作(图 1)。植物中的 MAPKs
被划分为 A，B，C 和 D 4 个族，PtMPK6-1 与之同源
的拟南芥的 AtMPK6 和 AtMPK3 同属于 A 族，推测
PtMPK6-1 可能被 PtMKK4 激活。进而，半定量 PCＲ
结果显示，干旱和高盐胁迫处理均能引起 PtMPK6-1
表达上调，与 PtMKK4 的表达变化情况相似，暗示其
在干旱和高盐胁迫适应过程中起作用(图 2)。在下
一步研究中，将阐明 PtMPK6-1 的生物学功能及通
过凝胶激酶活性检测 PtMPK6-1 是否可被 PtMPKK4
激活，最终确定在毛果杨干旱和高盐信号转导途径
中 PtMPK6-1 是否为 PtMKK4 激活的靶标。
已有的研究表明，MAPKK 激酶位于 MAPK 级
联途 径 的 关 键 环 节，MAPKK 通 过 整 合 不 同
MAPKKK 接受的多种信号，并将这些信号传递给下
游不同的 MAPK ( Morris，2001; Ｒodriguez et al．，
2010)。各条信号传递途径之间不是简单的线性并
列关系，而是互相交叉形成复杂的信号传递网络
( Jonak et al．， 2002; Ｒasmussen et al．， 2012;
Samajová et al．，2013 )。作者前期研究结果显示，
PtMKK4 对干旱、高盐、氧化、ABA 及 SA 处理均有响
应，暗示 PtMKK4 在多种非生物胁迫信号转导途径
中发挥重要作用。Nicole 等(2006)利用生物信息学
从毛果杨基因组中搜索到 21 个 PtMPKs 成员，但在
本研究中，从雄花序、雌花序以及不同处理的毛果杨
幼苗中仅分离到 14 个 PtMPKs，推测其余的 7 个
PtMPKs 可能在其他特定的组织器官及特定条件下
表达，而在以上材料中不表达或表达水平过低。今
后，还需进一步分离这 7 个 PtMPKs 基因，确定其与
PtMKK4 是否存在互作关系，为全面认识 PtMKK4 介
导在毛果杨非生物及生物信号转导网络中扮演的角
色提供重要资料。
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林 业 科 学 51 卷
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(责任编辑 徐 红)
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