全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (3): 249~255 249
收稿 2010-10-14　　修定 2011-01-19
资助 国家自然科学基金面上项目(30872006)和中央高校基本科
研业务费专项资金项目(DL09EA01)。
* 通讯作者(E-mail: chengyuxiang@nefu.edu.cn; Tel: 13766884170)。
毛果杨NADP-苹果酸酶基因家族分析
程玉祥1,*, 杨茹1,2
东北林业大学1林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 2园林学院, 哈尔滨150040
摘要: 本文分析C3树木毛果杨NADP-苹果酸酶(Populus trichocarpa NADP-malic enzyme, PtNADP-ME)基因家族及其表达特
性。NADP-ME同源性检索表明, 毛果杨基因组上存在5个PtNADP-ME基因, 其中PtNADP-ME4编码区不完整。RT-PCR及
DNA测序结果表明, PtNADP-ME家族5个基因均转录表达。进化树构建显示, 毛果杨PtNADP-ME家族5个成员分属于植物
NADP-ME家族的3个进化分枝。半定量RT-PCR表明, 5个PtNADP-ME家族基因没有明显的组织特异表达模式。然而, 不同
的PtNADP-ME基因转录表达对NaCl、PEG及甘露醇3种逆境胁迫应答与否以及应答方式存在明显的差异。
关键词: 毛果杨; NADP-ME; 基因家族; 逆境
Analysis of NADP-Malic Enzyme Gene Family in Populus trichocarpa Torr. &
Gray
CHENG Yu-Xiang1,*, YANG Ru1,2
1Key Laboratory of Forestry Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, 2College of Landscape Archi-
tecture, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: NADP-malic enzyme (NADP-ME) gene family in Populus trichocarpa, a C3 tree, and its expression
pattern were analyzed in this study. Homologous searches of NADP-ME suggest that five PtNADP-ME genes
exist in the genome of P. trichocarpa and the coding sequence of PtNADP-ME4 is incomplete. RT-PCR and
DNA sequencing show that five PtNADP-MEs are all expressed genes in P. trichocarpa. Construction of phylo-
genetic tree displays that five PtNADP-ME members belong to three evolutional branches of plant NADP-ME
family. Semi-RT-PCR analysis suggests that all of PtNADP-ME genes have no tissue-specific expression pat-
terns. However, there are observable differences in whether and how transcriptional expression of PtNADP-ME
genes responds to NaCl, PEG and mannitol stresses, respectively.
Key words: Populus trichocarpa; NADP-ME; gene family; stress
苹果酸酶根据结合辅酶因子NAD或NADP的
不同, 分为NAD-苹果酸酶(NAD-malic enzyme,
NAD-ME; EC1.1.1.39)和NADP-苹果酸酶(NADP-
malic enzyme, NADP-ME; EC1.1.1.40)两类(Artus
和Edwards 1985; Edwards和Andreo 1992)。NADP-
ME在二价金属离子存在下催化苹果酸氧化脱羧
生成丙酮酸、CO2和NADPH, 是生物体内苹果酸
代谢的关键酶之一(Edwards和Andreo 1992)。根据
行使功能的不同, 植物的NADP-ME分为光合型和
非光合型(Drincovich等2001)。光合型NADP-ME
定位在C4植物维管束鞘细胞叶绿体(bundle sheath
chloroplast)或景天酸代谢(crassulacean acid metab-
olism, CAM)植物的细胞质中, 它催化苹果酸氧化
脱羧生成的CO2用于Rubisco酶的光合碳固定, 并且
光合型NADP-ME基因表达被光照显著地诱导
(Honda等2000; Rothemel和Nelson 1989)。过量表
达玉米光合型NADP-ME改变了转基因烟草气孔
导度(stomatal conductance), 提高转基因植株对水
分的利用效率(Laporte等2002)。非光合型NADP-
ME普遍存在于C3、C4和CAM植物中, 根据其在细
胞质或质体的不同定位分为质体型和细胞质型。
它们参与植物的多种生理功能, 包括调节细胞内
pH、促进果实成熟及参与脂肪酸合成等(Davies
1986; Edwards和Andreo 1992; Martinoia和Rentsch
1994; Drincovich等2001; Shearer等2004)。最近, 一
些研究报道非光合型NADP-ME参与植物对创
植物生理学报250
伤、病原体侵袭、UV-B辐射等多种逆境因子导致
的防御反应(Schaaf等1995; Pinto等1999; Casati等
1999)。另外, 非光合型NADP-ME在植物适应高
盐、高渗透环境逆境中也起重要作用(Liu等2007;
Cheng和Long 2007)。因此, NADP-ME是植物体内
一个重要的代谢酶, 参与植物的多种生理功能。
NADP-ME在高等植物中的编码基因是一个
小基因家族(small gene family)。研究表明, C4植
物玉米中存在1个光合型、1个质体型和1个细胞
质型NADP-ME (Detarsio等2008)。Honda等(2000)
用Western分析技术从CAM植物芦荟中检测到3个
NADP-ME同工酶。全基因组信息分析显示, C3植
物拟南芥、水稻NADP-ME基因均是1个质体型、
3个细胞质型(Wheeler等2005; Chi等2004)。另外,
还有一些植物的NADP-ME基因家族的部分基因
被克隆(Fu等2009; Muller等2008; Casati等1999;
Cushman等1992)。然而, 人们对树木中NADP-ME
基因信息及其功能了解甚少。本文以全基因组信
息已解读的毛果杨为对象, 从基因组水平鉴定和
分析毛果杨NADP-ME (PtNADP-ME)基因家族, 并
探讨高盐、渗透胁迫几种环境逆境下毛果杨Pt-
NADP-ME家族基因表达的情况。这些工作为研
究树木NADP-ME家族的生理功能提供基础信
息。
材料与方法
1 材料
毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & Gray)无菌
苗由中国科学院上海生命科学研究院李来庚博士
赠与, 无菌苗的组培扩繁按照Kang等(2009)方法进
行。选用同一批株高基本相同的组培无菌苗, 种
植于装有土壤基质的16 cm营养钵中, 置于人工气
候室中培养。培养条件为: 24~28 ℃, 光照强度150
μmol·m-2·s-1, 光周期16/8 h, 相对湿度60%。每5 d浇
1次Hoagland营养液, 生长至90 d时, 分别取幼苗的
各种组织器官。另外, 逆境处理用200 mmol·L-1
NaCl、300 mmol·L-1甘露醇和8% PEG8000溶液分
别浇灌盆栽幼苗, 对照组用水浇灌。每种逆境处
理3盆幼苗, 每盆幼苗浇灌500 mL的处理溶液, 处
理时间分6和12 h两种。处理后收集毛果杨材料,
液氮速冻后用于总RNA的分离。
2 方法
2.1 PtNADP-ME家族基因的获得
用拟南芥NADP-ME (At1g79750)氨基酸序列
进行Pfm (http://pfam.sanger.ac.uk)分析得到其
NADP-ME典型结构域, 在毛果杨基因组数据库
(http://genome.jgi-psf.org/Poptr1_1/Poptr1_1.home.
html)中进行BLASTp同源检索, 得到候选基因。用
Clustal X 1.83进行比对去除冗余序列, 得到的序列
在毛果杨基因组数据库中初步确定其功能注释。
对以上得到的基因结构不完整的基因在Softberry
服务器上用FGENESH程序重新预测(http://www.
soflberry.corn/berry.phtml)。以Phytozome (http://
www.phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/poplar/)提供
的基因相关信息确定其染色体定位。
2.2 基因的结构序列分析及进化树构建
用毛果杨基因组数据库中NADP-ME家族基
因编码区序列(CDS)和对应的全基因组序列在
Gene Structure Display Server (http://gsds.cbi.pku.
edu.cn)中绘出基因结构图。利用Clustal W (http://
align.genome.jp)对获得的5个PtNADP-ME家族蛋
白氨基酸序列进行同源序列比对, 参数为默认。
用BioEdit生物学软件分析其保守或相似的氨基酸
序列。以序列比对的结果为基础, 利用MEGA 4软
件进行进化树校验, 生成NADP-ME家族蛋白的无
根进化树。进化树生成用邻接法(neighbor-joining),
由1 000次自举值(bootstrap)重复抽样组成。
2.3 毛果杨总RNA的提取和cDNA的合成
用pBiozol Plant Total RNA试剂(博日科技公
司)分离各种毛果杨材料的总RNA, 具体步骤按照
其说明书操作。总cDNA的合成使用PrimeScript
RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa公
司)。
2.4 基因的表达分析
合成的cDNA用于PtNADP-ME家族各基因
CDS的DNA片段扩增, 所用基因的引物如表1所
示。扩增产物回收后连接到载体pENTR/SD/D-
TOPO (Invitrogen公司)上, 进行DNA测序鉴定。半
定量RT-PCR时 , 以相同量总RNA (1 μg)合成
cDNA, 合成的cDNA稀释5倍后作为模板, 以毛果
杨Actin2基因作为内标进行半定量RT-PCR, 所用各
基因的引物如表1所示。
程玉祥等: 毛果杨NADP-苹果酸酶基因家族分析 251
结果与讨论
1 PtNADP-ME基因鉴定及在染色体上的分布
用拟南芥NADP-ME (At1g79750)的NAD(P)
(171~352)和Malic-M (362~615)两个典型结构域氨
基酸序列作为检索词, 在毛果杨全基因组数据库
中分别进行BLASTp同源检索, 得到的检索结果相
同。两种检索词都检索到9个同源蛋白, 且氨基酸
一致性高低的排序也相同(数据未列出)。其中与
拟南芥NADP-ME同源性较低的4个基因分别是
estExt_fgenesh4_pg.C_LG_II1218、estExt_Gene-
wise1_v1.C_LG_XVIII2568、eugene3.00021450和
estExt_Genewise1_v1.C_LG_XIV1110, 用它们的核
酸和蛋白质序列在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/guide/sequence-analysis)分别进行BLAST同源
检索分析, 结果表明这4个基因属于NAD-ME基因
家族。
与拟南芥NADP-ME同源性程度较高的蛋白
有5个, 它们的基因名称、蛋白ID、推测氨基酸长
度如表2中所列, 属于NADP-ME基因家族, 分别命
名为PtNADP-ME1、2、3、4、5, 这显示C3木本植
物毛果杨基因组中存在5个NADP-ME基因。根据
一些已知全基因组信息的植物物种及其相关文献
表明, C4植物玉米中存在3个NADP-ME, CAM植物
芦荟中被检测到3个NADP-ME同工酶, C3草本植
物拟南芥、水稻的NADP-ME基因均是4个(Detar-
sio等2008; Wheeler等2005; Chi等2004; Honda等
2000)。这暗示树木NADP-ME家族成员及其生理
功能可能复杂于草本植物的NADP-ME。另外, 由
于杨树基因组测序片段被组装成22 136个骨架
(scaffold), 共计473.1 Mbp, 其中143个骨架已定位
到遗传图谱上(Tuskan等2006), 可以把一些基因定
位到相应的染色体位置上。我们检索分析毛果杨
NADP-ME家族5个基因在染色体上的定位分布,
结果显示5个PtNADP-ME基因分布在第18、6、
18、1及3条染色体上(表2)。
2 PtNADP-ME家族基因的结构
用Gene Structure Display Server软件绘出毛果
表1 PtNADP-ME基因CDS扩增及半定量RT-PCR所用引物序列
Table 1 The sequences of primers for amplifying the CDS and semi-RT-PCR of PtNADP-MEs
基因 CDS扩增引物(5→3) Semi-RT-PCR引物(5→3)
PtNADP-ME1 CACCATGGAGAGCACGCTGAAGGAGAT TTGGCTGACAGATTCAAAGGGT
CCGGTAGTATCTATAGGCGGGACTG TCTGCGTGCTTCACAAGGTTTT
PtNADP-ME2 CACCATGATGAACGGAGTGGAGAAAAC GGAGCCTTGGCGGACCATAGATT
ACGATAGCTTCGGTAGACTGGGCT CAACAGGGTCAAATGGGCTTCCGC
PtNADP-ME3 CACCATGATGAACGGAGTGGAGAAAAC TTTACGAAGGAGGTGGTTGAGGC
ACGATAGCTTCGGTAGAGCGGGCTG CTTTGGGACGAGGGAGACGAGAT
PtNADP-ME4 CACCATGATGTCCTTGAATAGAAGCAT GCCCTTGAGATTTCCAAACAGAC
ACGGTAGCTTCGATAAGCAGGGCTGTA TTATCAAAGTTCTCCTGGGTCAC
PtNADP-ME5 CACCATGGAGAGCACGTTCAAGGACGT ATGTTTACGGTGAGGATACTGCC
CCGGTAGCTTCGATAAGCAGGGCTG GTTTGTCCCCACATCAATGGTTAC
PtActin2 AGGCAGGTTTCGCAGGAGATGA
TCCATCACCAGAATCCAGCACA
表2 PtNADP-ME家族成员
Table 2 The members of PtNADP-ME family
毛果杨基因组数据库中基因 基因名称 染色体定位 氨基酸长度 蛋白ID
estExt_Genewise1_v1.C_LG_XVIII2568 PtNADP-ME1 LG_XVIII: 8825431~8831934 591 737670
eugene3.00061692 PtNADP-ME2 LG_VI: 15885561~15889828 569 561733
estExt_fgenesh4_pg.C_LG_XVIII0238 PtNADP-ME3 LG_XVIII: 3639699~3643713 569 825669
gw1.I.387.1 PtNADP-ME4 LG_I: 14194220~14199411 595 171787
estExt_Genewise1_v1.C_LG_III0888 PtNADP-ME5 LG_III: 5791821~5797971 596 711993
植物生理学报252
杨、拟南芥及水稻NADP-ME家族基因的结构图。
毛果杨NADP-ME家族4个基因PtNADP-ME1、2、
3、5的外显子数目分别为18、18、18和19 (图1)。
然而, PtNADP-ME4在毛果杨基因组数据库中其基
因的转录本没有检索到起始密码子, 这可能是毛
果杨基因组数据库的信息错误所致。因此, 我们
在Softberry服务器上用FGENESH程序重新预测
PtNADP-ME4, 得到PtNADP-ME4新的基因结构(图
1)。原毛果杨基因组数据库中PtNADP-ME4基因
的预测少了两小节外显子, 在图1中用星号标出,
其推测氨基酸长度由原数据库中的595增长至
649。拟南芥NADP-ME家族4个基因AtNADP-
ME1、2、3、4的外显子数目均为18, 水稻的3个
NADP-ME基因的外显子数目都在18~20之间(图
1)。这些结果显示, 毛果杨、拟南芥及水稻3个物
种的NADP-ME基因的结构是类似的, 原因可能与
图1 毛果杨、拟南芥及水稻的NADP-ME家族基因外显子/内含子结构示意图
Fig.1 Sketch map of the extrons and introns of NADP-ME family genes in P. trichocarpa, Arabidopsis thaliana and Oryza sativa
它们在进化上的保守程度是分不开的。
3 PtNADP-ME家族成员序列及进化分析
设计基因的特异引物(表1), 通过RT-PCR扩增
PtNADP-ME1、2、3、4和5基因的CDS。将这些
片段分别连到pENTR/SD/D-TOPO载体上, 得到重
组质粒, DNA测序显示重组质粒中插入片段与理
论预测的PtNADP-ME基因CDS完全一致。这些结
果表明, 上述毛果杨NADP-ME家族5个基因的结构
分析及我们对毛果杨数据库中PtNADP-ME4基因
结构的重新预测都是正确的。
分析PtNADP-ME家族推测氨基酸的同源
性、保守区域及进化关系显示, PtNADP-ME1、
2、3、4和5任意两个成员之间的推测氨基酸序列
一致性均大于64% (图2), 同源性最高的PtNADP-
ME2和PtNADP-ME3氨基酸序列一致性高达91%
(资料未列出)。另外, 氨基酸序列一致性比对还显
示, 毛果杨PtNADP-ME家族每个成员均有NADP-
ME保守的5个氨基酸区域(图2)。这5个保守的氨
基酸区域是植物体中NADP-ME蛋白典型的特征,
其中氨基酸保守区域I、II、V是NADP的结合区
域, 但III和IV的功能尚不清楚(Fu等2009; Chi等
2004; Chang和Tong 2003; Drincovich等2001)。
结合单子叶水稻和双子叶拟南芥NADP-ME
家族所有成员, 我们分析毛果杨NADP-ME家族成
员的进化位置。构建的进化树显示, 进化分枝分
为4组(图3)：(1)双子叶植物细胞质NADP-ME型
(标注菱形), 包括毛果杨PtNADP-ME2、PtNADP-
ME3和拟南芥AtNADP-ME2、AtNADP-ME3; (2)
双子叶植物质体NADP-ME型(标注正三角形), 包
括毛果杨PtNADP-ME4、PtNADP-ME5及拟南芥
AtNADP-ME4; (3)单子叶植物NADP-ME型, 仅有3
个水稻NADP-ME(标注圆形); (4) NADP-ME其他
类型(标注倒三角形)。另外一些研究报道, 植物的
NADP-ME从系统进化关系上分为4组: 双子叶植
物细胞质NADP-ME型、双子叶植物质体NADP-
ME型、单子叶植物NADP-ME型及其他类型NA-
DP-ME (Wheeler等2005; Drincovich等2001)。我们
的结果表明, 木本植物毛果杨NADP-ME家族成员
程玉祥等: 毛果杨NADP-苹果酸酶基因家族分析 253
4 PtNADP-ME家族基因的组织表达模式
以Actin2内标基因作为对照, 用半定量RT-
PCR分析毛果杨PtNADP-ME基因家族在叶、顶
芽、幼茎(未木质化)、老茎(木质化)、木质部等组
织中的表达水平。结果显示, PtNADP-ME1、4、5
的转录表达模式相似, 除PtNADP-ME5在成熟叶中
转录水平稍低, 在本实验所选的其余组织中这3个
基因转录水平均较高, 无明显的特异性表达器官;
PtNADP-ME2和PtNADP-ME3的表达模式也较类
似, 在顶芽和成熟叶中表达量相对较高(图4)。这
些结果表明, PtNADP-ME基因家族没有明显的组
织特异表达模式, 且表达上存在明显的冗余。旺
盛次生生长形成的木材是树木重要的生物学性状,
也是树木体内碳水化合物合成、运输、再分配的
结果。NADP-ME是C4、CAM植物碳固定和碳水
化合物代谢的一个重要酶(Drincovich等2001)。然
而在C3植物毛果杨的顶芽、幼茎、老茎、木质部
等与木材形成相关的组织中, NADP-ME基因表达
图2 PtNADP-ME家族蛋白序列同源性及保守结构域分析
Fig.2 Analysis of homologous sequences and conservative sites of PtNADP-ME protein family
图3 NADP-ME家族蛋白的系统进化树
Fig.3 Phylogenic tree of PtNADP-ME protein family
所处的进化分枝仍符合植物NADP-ME进化关
系。另外, 构建的进化树显示毛果杨基因组中质
体型NADP-ME有2个成员, 而同为双子叶草本植物
拟南芥和烟草都只有1个质体NADP-ME (Muller等
2008; Wheeler等2005)。这可能是木本植物NADP-
ME家族不同于草本植物的差别所在。
植物生理学报254
均未显示显著的差异表达或与其木质化程度同步
表达。这暗示NADP-ME在C3木本植物中可能不
参加碳的固定或不直接参与树木木材形成的生理
活动, 而是存在其他方面的功能。
5 盐和渗透胁迫下PtNADP-ME家族基因表达变
化
用半定量PCR方法分析NaCl、甘露醇和PEG
不同逆境胁迫下PtNADP-ME基因表达变化, 结果
如图5所示。PtNADP-ME1的表达轻微地受NaCl盐
诱导, 但甘露醇和PEG渗透处理均持续地诱导其表
达。在NaCl盐胁迫下PtNADP-ME2的转录水平先
升后降, 甘露醇处理没有改变其表达, 而PEG处理
显著下调其表达。PtNADP-ME3在NaCl胁迫下转
录表达先升高后恢复到对照水平, 甘露醇处理诱
导其转录表达。质体型PtNADP-ME4和PtNADP-
ME5的转录表达均显著地被NaCl、PEG及甘露醇3
种不同处理所诱导: 在NaCl处理下二者的mRNA
水平持续诱导升高; 而在甘露醇胁迫下随着处理
时间延长二者转录水平均有所下降, 但仍比对照
的增加数倍; PEG处理时二者转录表达均先显著升
高后恢复到对照水平。这些结果显示, 毛果杨Pt-
NADP-ME家族基因的表达受高盐、高渗透逆境胁
迫所诱导, 并且不同基因对NaCl、PEG及甘露醇
逆境胁迫应答的方式也有所差别。De Aragao等
(1997)报道, 盐逆境显著地诱导桉树叶中NADP-
ME酶活性。另一些研究报道, C3植物的NADP-
ME参与UV-B照射、割伤逆境因子的防御反应
(Lai等2002; Casati等1999; Pinto等1999)。为了确
定PtNADP-ME家族基因在防御这些逆境中的生理
功能及功能的差异, 下一步我们将分析PtNADP-
ME家族各基因启动子活性与这些逆境胁迫因子的
应答关系, 鉴定各基因的过量表达能否提高其转
基因植株对这些逆境胁迫的防御能力以及揭示Pt-
NADP-ME防御逆境胁迫的分子机制。
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图4 PtNADP-ME基因组织特异性表达
Fig.4 Tissue-specific expression patterns of PtNADP-ME
1: 幼茎; 2: 老茎; 3: 成熟叶; 4: 老叶; 5: 顶芽; 6: 韧皮部; 7: 木
质部。
图5 NaCl、甘露醇和PEG不同逆境胁迫下
PtNADP-ME表达分析
Fig.5 Analysis of PtNADP-ME gene expression under
NaCl, mannitol and PEG stresses, respectively
1: 对照; 2: 6 h NaCl处理; 3: 12 h NaCl处理; 4: 6 h甘露醇处理;
5: 12 h甘露醇处理; 6: 6 h PEG处理; 7: 12 h PEG处理。
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