全 文 ：第 51 卷 第 4 期
2 0 1 5 年 4 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 4
Apr．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150414
收稿日期: 2013 － 12 － 20; 修回日期: 2014 － 11 － 24。
基金项目: 林业公益性行业科研专项“重大森林病虫灾害防控技术的关键理论基础”(201204501) ; 中国林业科学研究院院部基金“林木
病害和病原标本及病原体的收藏保存和评价”(CAFYBB2011005 － 4) ; 科技部基础性工作专项“中国树木溃疡病原多样性及其生态地理分布
和危害调查”(2009FY210100)。
* 张星耀为通讯作者。
杨树受溃疡病菌感染后转录因子的应答变化*
张秀英1 宋瑞清2 张星耀3
(1. 长春工业大学化学与生命科学学院 长春 130000; 2. 东北林业大学林学院 哈尔滨 150040;
3. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 北京 100091)
摘 要: 【目的】研究杨树受溃疡病菌感染后转录因子的应答变化。【方法】提取诱导前后的毛白杨树皮
mＲNA，反转录生成 cDNA，构建接种溃疡病菌 72 h 后的 SSH － cDNA 库，从库中获得 ESTs，将 ESTs 注释到
Unisequences，挑选出与转录相关的 Unisequences，利用 ＲT － qPCＲ 对转录基因作进一步的分析。随机挑选 199 个阳
性克隆进行测序，测序结果经与 NCBI 基因库中序列进行比较，发现 172 个 EST 同源序列，对这些 EST 在 dbEST 数
据库进行同源检索分析。【结果】有 10 个序列与转录相关，占 5． 8%，分为 4 类，即:锌指蛋白，含 EAＲ 转录区域;类
CONSTANS 转录因子，编码核蛋白;普通转录因子，调节转录;WＲKY21 转录因子，参与防御信号转录。通过 ＲT －
qPCＲ 对其中 3 类(锌指蛋白、类 CONSTANS 和 WＲKY21)转录因子做进一步分析发现，Z 锌指蛋白(Cys /His － rich)
在接种溃疡病菌后，在诱导初期增长缓慢，48 h 后逐渐升高，144 h 达到最高，表达量是未接种时的 50 倍;WＲKY21
表达量先升高(12 ～ 24 h)，然后降低(24 ～ 96 h)，144 h 时，表达量是未接种时 0. 94 倍;类 CONSTANS 表达量一直
处于缓慢升高的趋势，直到诱导 144 h，是未接种时 2 倍。【结论】毛白杨被溃疡病菌感染后与防御相关的转录因
子表达量明显上升，这可为毛白杨抗溃疡病重要功能基因的克隆和鉴定提供理论基础。
关键词: 葡萄座腔菌; 毛白杨; 抑制消减杂交; 实时定量 PCＲ (qＲT-PCＲ); 转录因子
中图分类号: S763. 11 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)04 － 0110 － 06
Ｒesponse of Transcription Factors of Populus tomentosa
to Inoculation with Botryosphaeria dothidea
Zhangxiuying1 Songruiqing2 Zhangxingyao3
(1. Changchun University of Technology Changchun 130000; 2. College of Forestry，Northeast Forestry University Harbin 150040;
3. Ｒesearch Institute of Forest Ecology，Environment and Protection，CAF Beijing 100091)
Abstract: 【Objective】This study aims at investigating the response of transcription-related genes of Populus tomentosa
induced by Botryosphaeria dothidea infectation．【Method】The suppression subtractive hybridization ( SSH) technique was
used to construct a cDNA library，and the bioinformatics were used to analyze the expression of transcription related gene of
Populus tomentosa infected with Botryosphaeria dothidea． The bark mＲNA was purified and transcribed into cDNA． A
poplar-pathogen interaction cDNA library of inoculated poplar bark 72 h post-inoculation (hpi) was constructed． Expressed
sequence tags (ESTs) were obtained，which were assembled into unisequences prior to their annotation． The unisequences
related to transcription were selected，and were further analyzed by quantitative real-time PCＲ (qＲT-PCＲ) ． The randomly
selected 199 positive clones were sequenced，and compared with the sequences of NCBI gene pool，among which 172 EST
sequences were found homologous． The homologous analysis for these EST was conducted in dbEST database retrieval，
【Ｒesult】The result showed that 10 sequences were associated with transcription，and accounted for 5． 8% of the total
sequences． They were divided into four categories，i． e． Zinc finger protein ( Cys / His-rich )，containing the EAＲ
transcriptional repressor; CONSTANS-like protein，Encoding a nuclear protein; ordinary transcription factor，regulating
transcription and WＲKY21 transcription factor，participating in the plant defense． Through further ＲT-qPCＲ analyses on
three kinds of transcription factors，the result showed that the expression amount of Zinc finger protein (Cys / His-rich)
after inoculation was 50 times of the non-inoculated; The WＲKY21 expression amount was 0． 94 times of the non-inoculated;
第 4 期 张秀英等: 杨树受溃疡病菌感染后转录因子的应答变化
The CONSTANS-like protein expression amount was 2 times of the non-inoculated．【Conclusion】The expression of these
transcription factor genes was significantly increased in Populus tomentosa infected by Botryosphaeria dothidea．
Key words: Botryosphaeria dothidea; Populus tomentosa; suppression subtractive hybridization; real time PCＲ (qＲT-
PCＲ); transcription factors
杨树(Populus)是林木中的模式树种，溃疡病是
杨树的一种重要病害。转录因子受到多种生物和非
生物胁迫的调控，尤其是在植物抵御病原物侵害的
抗病反应中具有重要的调控作用。当植物受到不同
病原，如病毒、细菌、真菌和卵菌侵染时，其基因的转
录、蛋白合成及结合活性都有显著变化，从而调节不
同的抗性反应。在烟草花叶上被烟草花叶病毒诱导
的部位，有 WＲKY 基因表达 ( Yoda et al．，2002 );
WＲKY33 在拟南芥 ( Arabidopsis thaliana)抗病反应
中发挥重要作用 ( Lai et al．，2011 ); 杨祥燕等
(2009)在研究菠萝锌指蛋白基因的克隆与表达时，
指出锌指蛋白作为转录因子参与植物的抗逆境代谢
调控; Aoun 等(2010)利用 SSH-cDNA 研究病原菌
( Ophiostoma novo-ulmi ) 诱 导 美 国 榆 ( Ulmus
americana)时，共获得 638 个克隆，其中转录因子
占 3%。
目前关于杨树溃疡病的研究还主要集中在溃疡
病菌的鉴定、防治以及诱导后 microＲNA 的鉴定、与
病程相关的一些差异蛋白的表达等(崔晓琦，2012;
高瑞岐，2010; 陈磊，2012; 理永霞，2011)，为了更
好地了解杨树抗病防御的分子机制，必须鉴定抗性
信号途径中的转录调控成分，阐明它们在抗病机制
建立中的调节作用。本文运用 SSH-cDNA 文库、生
物信息学和 ＲT-qPCＲ 技术研究杨树溃疡病致病菌
侵染后转录因子及其相关基因的表达响应，探讨转
录因子在杨树抗病防御反应中的功能，为阐明杨树
对溃疡病的抗性机制提供线索，为杨树优良抗病品
种的选育提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
1. 1. 1 植 物 材 料 及 培 养 毛 白 杨 ( Populus
tomentosa): 高抗树种，15 年生，感病指数为 0 ～ 6. 0
(杨俊秀等，1990)，生长于中国林业科学研究院院
内。采集 1 年生、外观无病无损伤的健康毛白杨枝
条进行扦插。扦插后 1 个月左右苗木基本生根，挑
选生长良好，生长状态较为一致的幼苗进行定植。
幼苗长至 7 月龄时选择 100 株用于试验，此时毛白
杨苗高 105. 87 cm ± 2. 90 cm，地径 0. 75 cm ±
0. 03 cm。
1. 1. 2 病原菌及接种方法 试验菌株: 葡萄座腔
菌( Botryosphaeria dothidea)菌株，菌株号 CXY001，
分离于北京杨 (P． beijingensis)溃疡病斑，然后经单
孢培养鉴定，再回接，以此确认致病性 (致病力中
等)。菌株保存于中国林科院菌种保藏中心。
试验前，先将病原 菌活 化，参考赵 仕 光等
(1999)的接种方法并稍加修改。采用针刺菌饼接
种法对温室内盆栽的 7 月龄毛白杨干部进行接种。
对照采用接种无菌培养基。接种在苗木根颈处向上
15 cm 左右，每株苗木选 3 个接种点，间隔大约 30
cm，每个样本重复 3 次。
接种 72 h 后取样，采用锋利的无菌刻刀截取接
种点周围 0. 5 cm × 1 cm 长条形树苗干部树皮(带形
成层)，约每 500 mg 样品用锡铂纸包好后，迅速投入
液氮中，保持样品的新鲜，于 － 80 ℃贮存备用。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 总 ＲNA 提取及 mＲNA 的纯化 采用鼎国公
司的植物 ＲNA 提取试剂盒对杨树树皮的总 ＲNA 进
行提取，用该公司的 Plant ＲNAzol 试剂盒提取真菌
的总 ＲNA。
通过微量紫外分光光度计测出 ＲNA 量，利用
Promega 公司提供的分离纯化试剂盒［PolyA Tract
SystemsⅢ ( Z5300)］从 总 ＲNA 中 分 离 并 纯 化
mＲNA，然后电泳检测 mＲNA 的完整性。
1. 2. 2 构建抑制消减文库及重组子的鉴定 按照
Clontech 公司提供的试剂盒 PCＲ-SelectTM cDNA
Subtraction Kit 进行构建。以真菌处理的毛白杨树
皮作为试验方，参照方一部分来源于培养基处理的
毛白杨树皮的 mＲNA，另一部分来源于培养的真菌
mＲNA，建立正向差减 cDNA 文库。
将正向差减的所有 PCＲ 产物与 pMD － 19T 载
体连接，导入感受态细胞，进行克隆。在所有的克隆
中将白色克隆挑取出来，加入 96 孔细胞培养板中
(含有 Amp /LB 液体培养基)，摇床培养。吸取菌
液，扩增，检测插入片段的大小。
1. 2. 3 Ｒeal-time PCＲ 使用 7 月龄苗木进行试验。
试验分对照和测试方，把不接种溃疡病菌作为对照，
而接种溃疡病菌的作为测试方。分别于接种后 12，
24，48，72，96 和 144 h 取样，剪取对照和接种材料的
树皮置于液氮中，－ 80 ℃保存备用。每个接种时间
处理 5 株毛白杨，重复 3 次。
以 Elongation factor 1 alpha(EF － 1α)作为内参，
111
林 业 科 学 51 卷
根据内参基因设计特异性引物，依此来设计 PCＲ 反
应的循环数及目的基因扩增的模板量。荧光实时定
量 ＲT-PCＲ 采 用 SYBＲ GＲEEN PCＲ MasterMix
(TOYOBO)试剂盒，在 7500 循环仪上(Biorad)进行。
Ｒeal-time PCＲ 反 应 体 系 包 括 2 × SYBＲ Green
Supermix(Qiagen Inc． )15 μL，正向和反向引物各 0. 5
μL，cDNA 2 μL。PCＲ 反应条件: 95 ℃ 10 min，
94 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，在 72 ℃采集荧
光信号，45 个循环; 循环结束后进行溶解曲线分析，
每个样品做 3 个平行样，每次试验设置阴性对照。
1. 2. 4 测序及序列分析 由鼎国(北京)测序公司
完成。测序完成后，将获得的 EST 序列进行 EST 前
处理，剔除不符合要求的序列，然后递交 NCBI，通过
NCBI 上的 BLAST(或者 BLASTN)序列比对工具，在
GenBank 的 dbEST 数据库上对 EST 序列进行同源
检索分析。
2 结果与分析
2. 1 ＲNA 提取与 mＲNA 分离
从总 ＲNA 中分离纯化得到 mＲNA (图 1 － a，
b)。经微量紫外分光光度计计算可知 28S ∶ 18S 接
近2∶ 1; 经琼脂糖电泳检测，没有 DNA 污染且未被
降解，完整性较好。因此，所获得的 mＲNA 可以用
于差减文库的构建。
图 1 总 ＲNA 及 mＲNA 电泳
Fig． 1 Electrophoresis of total ＲNA and mＲNA preparation
J:真菌 Fungi; D:对照 Control; T:处理 CK; M: Marker DL2000．
2. 2 差异表达的 SSH 结果分析
2. 2. 1 差异筛选差减 cDNA 文库 经 2 轮抑制 PCＲ
后，在 tester 与 Tester Control 二者的样品中都扩增出
弥散条带，消去了 tester 与 driver 共有的转录产物，只
有 tester 特有的基因或表达增强的基因被选择性留
下。因此，经过消减杂交后，PCＲ 扩增的条带要比未
经消减杂交时扩增的条带亮度弱，表明抑制差减杂交
的效果较好，可以进行产物的克隆和转化(图 2)。
2. 2. 2 抑制差减杂交后产物的克隆及转化 将
图 2 经 2 次抑制的 PCＲ 产物电泳
Fig． 2 Secondary PCＲ products electrophoresis
E1:第 1 次正向差减 PCＲ;1-c:第 1 次正向未差减 PCＲ;E2:第 1 次反
向差减 PCＲ;2-c:第 1 次反向未差减 PCＲ。pE1 第 2 次正向差减
PCＲ;p1-c:第 2 次正向未差减 PCＲ;pE2:第 2 次反向差减 PCＲ;p2-c:
第 2 次反向未差减 PCＲ。
E1:Forward subtractive first PCＲ product; 1-c:Forward not subtractive
first PCＲ product; E2: The reverse subtractive first PCＲ product; 2-c
Ｒeverse is not subtractive first PCＲ product; pE1: Forward subtractive
second PCＲ products; p1-c: Forward not subtractive second PCＲ
products; pE2: Ｒeverse subtractive second PCＲ products; p2-c: Not
reverse subtractive second PCＲ products．
PCＲ 产物与 pMD － 19T 载体连接，导入感受态细
胞，进行克隆(图 3)。克隆的插入片段大小均有差
异，由标准分子量(DL2000)可知，插入片段 300 ～
500 bp。因此，与四碱基内切酶(ＲsaⅠ理论酶切片
段小于 600 bp)的理论酶切结果相符。
图 3 差减 cDNA 文库部分克隆的 PCＲ 扩增结果
Fig． 3 PCＲ amplification results of cDNA library
partial clones subtractive
M: Marker DL2000
2. 2. 3 EST 序列测定与分析 在 GenBank 的
dbEST 数据库上对 EST 序列进行同源检索分析，分
析显示有 10 个 ESTs 与 GenBank 现有的已知植物基
因(蛋白)的转录因子具有不同程度的相似性，同时
还发现 3 个 ESTs(NAD 激酶、DGDG 合酶 2 和甘油
醛 － 3 －磷酸脱氢酶)与转录因子紧密相关(表 1)。
经过多系列比对结果，发现杨树的锌指蛋白与
辐射松( Pinus radiata)锌指蛋白具有较高的同源
性，达 到 94%，都 有 一 个 半 胱 氨 酸 富 含 区;
CONSTANS-like protein 与欧洲云杉( Picea abies)中
该蛋 白 同 源 性 为 91% ; WＲKY21 与 ［Populus
tomentosa × P． Bolleana］ × P． tomentosa 中 的
WＲKY21 具有较高同源性。已有研究证实，有很多
211
第 4 期 张秀英等: 杨树受溃疡病菌感染后转录因子的应答变化
植物来源的转录因子在抗逆信号中发挥着重要功能
(Ｒyu et al．，2006; van Verk et al．，2008; 彭喜旭等，
2011; 刘志伟等，2010)。因此，在接种溃疡病菌
后，这些转录因子作为调控因子在抗病信号传导途
径中起重要作用。
表 1 溃疡病菌侵染毛白杨 SSH-cDNA 文库中筛选出的转录及相关基因
Tab． 1 Transcription related gene during the interaction with Botryosphaeria dothidea based on differential screening
毛白杨 EST
P． tomentosa EST
总数
Total number
功能预测
Putative function
E 与转录相关
Implication in transcription
CXY1421
CXY0118
CXY0147
CXY0543
CXY0134
CXY1218
CXY0113
3
3
3
1
1
1
1
锌指蛋白 Zinc finger protein
(Cys /His-rich)［辐射松 Pinus radiata］
类 CONSTANS 蛋白
CONSTANS-like protein［欧洲云杉 Picea abies］
普通转录因子
Transcription factor［蓖麻 Ｒicinus communis］
WＲKY21 转录因子 WＲKY 21
［(Populus tomentosa × P． bolleana) × P． tomentosa］
NAD 激酶
NAD kinase［Ｒicinus communis］
DGDG 合成酶 2
Digalactosyldiacylglycerol synthase 2
甘油醛 － 3 －磷酸脱氢酶
GAPDH
2E － 29
2E － 39
3E － 06
8E － 13
5E － 07
8E － 27
2E － 139
含 EAＲ 转录区域
Containning the EAＲ transcriptional repressor
编码核蛋白
Encoding a nuclear protein
调节转录
Ｒegulate transcription
参与防御信号转录
WＲKY participate in the plant defense
催化 NAD 和 NADH
Catalyzing NAD and NADH
DGDG 合酶基因
DGDG synthase genes
细胞死亡信号
Cell death signalling pathway
2. 2. 4 Ｒeal-time PCＲ 分析 对 6 个基因在 6 个时
间点(12，24，48，72，96 和 144 h) 的 Ｒeal-time PCＲ
验证结果如表 2 所示。
表 2 6 个时间点不同基因的表达量变化
Tab． 2 Expression change of the 6 time
points of different genes
基因 Gene 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h
CXY1421 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑(50 倍 50 times)
CXY0118 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑(2. 5 倍 2. 5 times)
CXY0543 → ↓ → ↓ ↑ ↓(0. 94 倍 0. 94 times)
CXY0134 ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ ↑(2 倍 2 times)
CXY1218 ↓ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓(0. 8 倍 1. 8 times)
CXY0113 ↑ ↓ ↓ ↓ ↑ ↑(2 倍 2 times)
由此可见，CXY1421［zinc finger protein ( Cys /
His-rich)］基因在溃疡病菌诱导初期，表达量下降，
随后表达量升高，当诱导 144 h 后，表达量是初始量
的 50 倍(图 4)。
CXY0543(WＲKY21)基因未诱导时有一定量的
本底表达，溃疡病菌诱导 12 h 后，表达量基本没变;
在以后时间内其表达量有升有降，始终接近本底表
达量，诱导 144 h 后，表达量仅为初始量的 0. 94 倍
(图 5)。
当溃疡病菌诱导 12 h 后，CXY0113(GAPDH)表
达水平缓慢升高; 诱导 24 ～ 96 h 内，随着诱导时间
的延长，基因表达量呈下降趋势; 诱导 96 h 后，表
达水平升高; 诱导 144 h 后，表达量是初始量的
2 倍。
当溃 疡 病 菌 诱 导 12 h 后，CXY0134 ( NAD
kinase)基因的表达量下降; 诱导 24 h 后，表达量有
逐渐升高的趋势; 诱导 48 h 后，表达水平又下降;
诱导 72 h 后，表达水平迅猛升高; 诱导 96 h 后，表
达水平基本保持不变。基因的表达量在诱导 72 h
内，一直在本底水平上下浮动; 72 h 后升高，直至
144 h，表达水平处于平稳状态，是初始量的 2 倍。
图 4 基因表达与诱导时间的关系
Fig． 4 CXY1421 Gene expression and relationship
between induction time
图 5 WＲKY21 基因表达与诱导时间的关系
Fig． 5 Gene expression and relationship
between induction time
CXY1218 ( Digalactosyldiacylglycerol synthase 2 )
基因在溃疡病菌诱导 12 h 后，表达量开始下降; 诱
导 24 h 后，表达水平又有升高的趋势; 诱导 48 h
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林 业 科 学 51 卷
后，随着诱导时间的延长，表达量逐渐下降，直至诱
导 144 h，表达量是初始的 1. 8 倍。
CXY0118(CONSTANS-like protein)基因在溃疡
病菌诱导初期有一定量的本底表达，整个诱导过程
的表达量一直处于升高的趋势，直到诱导至 144 h，
表达量达到初始量的 2. 5 倍(表 2)。
本研究表明:上述 6 个基因的表达都受到溃疡
病菌的诱导，表达量最高的增至 50 倍。因此，这些
基因可响应溃疡病菌诱导并且在诱导过程中起潜在
的重要作用。
3 讨论
转录因子在植物防卫反应基因的表达调控中起
关键作用，特别是单个植物防御反应基因的超表达
可增强植物对特定病原物的抵抗能力，而一个转录
因子基因的超表达能够激活多个下游抗病基因的表
达。因此，利用防御反应相关转录因子基因来改良
植物的综合抗病性，是一条很有潜力的分子育种途
径(李蕾，2006)。
目前，锌指蛋白(CXY1421)主要集中用于逆境
研究(Martin et al．，2012; Huang et al．，2008; 李晓
君等，2011)，抗病研究应用比较少。本试验中，毛
白杨树皮经溃疡病原菌感染后，CXY1421 接受了溃
疡病原菌传递的胁迫信号，并同时调控溃疡病菌基
因的表达。CXY1421 基因的表达水平随诱导时间延
长而提高，在诱导初期增长缓慢，诱导 48 h 后逐渐
升高，到 144 h 达到最高，此时毛白杨抗溃疡病反应
可能达到最高潮。
当植物受到病原菌侵染后，会启动自身免疫应
答系统来防卫病原菌的侵害，这个过程中涉及一系
列抗病相关基因的转录表达，其中 WＲKY 起了重要
的转录调节作用 (李冉等，2011)。在植物抗病方
面，Dong 等(2003)研究了 72 个拟南芥 WＲKY 的作
用，发 现 其 中 的 49 个 WＲKY 会 受 到 病 原 菌
Pseudomonas syringae pv． tomato 和 SA ( salicylis
acid)的诱导，从而使表达产生变化，进而调节相关
基因来参与拟南芥的抗病过程。本研究中 WＲKY
(CXY0543)转录因子随着诱导时间的延长，表达量
先升高(诱导 12 ～ 24 h)，然后降低 (诱导 24 ～ 96
h)，可能是因为诱导 96 h 时后，WＲKY 参与的抗溃
疡病防御反应逐渐结束，表达水平又逐渐回到初始
状态，即接近本底表达量。
NAD 激酶 ( CXY0134)，NAD 是 NADK 作用的
底物，NADK 催化 NAD 与 ATP 生成 NADP，NAD 与
NADP 是细胞溶质中起关键作用的氧化剂，二者含
量的改变不仅引起细胞氧化还原状态的改变，而且
引起细胞信号转导途径的改变 ( Graham，2006 )。
GAPDH(CXY0113)属于结合酶，需要 NAD 或 NADP
辅酶的参与才有活性。Tien 等 (2012)首次分析了
水稻(Oryza sativa)胞质 OsGAPDH 晶体结构，并通
过对 菠 菜 ( Spinacia oleracea ) 叶 绿 体 GAPDH
(SoGAPDH)晶体结构的比较研究，提出了高等植物
中 GAPDH 与 NAD 或 NADP 特异性互作的机制。
GAPDH 除了与抗氧化有关系，还与抗病性有关，如
马铃薯( Solanum tuberosum)的 GAPDH 基因受病原
物侵染诱导表达 ( Laxalt et al．，1996 ); 大豆疫霉
(Phytophthora sojae)的 PsGapdh 在病原菌侵染早期
转录水平提高了 3 倍，表明该蛋白可能参与了大豆
疫霉的早期侵染过程(曾娟等，2006)。由于在植物
与病原菌互作过程的早期，氧暴发是最重要的事件
之一，GAPDH 可能参与了溃疡病菌对氧化压力的抵
抗过程。
CONSTANS-like protein(CXY0118)的基因编码锌
指蛋白，是拟南芥光周期调控开花途径的关键性组分
( Putterill et al．， 1995 ); Digalactosyldiacylglycerol
synthase 2 在拟南芥中促进花的器官发育( Botté et
al．，2011)。
由此可见，植物防御侵染的过程不单一基因的
调节过程，而是多种基因参与、相互交叉又相对独立
的复杂过程，表现了生物体生命活动协调性和完整
性的统一。
参 考 文 献
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(责任编辑 朱乾坤)
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