全 文 ：第 7 卷 第 6 期
1 9 9 4 年 1 2 月
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1 9 9 4
四Jl恺木根瘤主要氮素同化酶活力
及其超微结构研究 ‘
吴祖洪 周国璋
摘要 四川恺木 (A ln 。 ‘re 。。lo gy ne B盯ki l )当年幼苗的根瘤平均固氮活力和硝酸还原酶
(N R )活力 5 月底出现高峰 , 分别达 1 1 . 0 3 拌m o l G ZH ‘ / (g Fw · h )和 0 . 5 9 拌m o l N O 牙/ (g Fw · h ) 。 当
6 月份根瘤开始衰败时 , 则迅速下降 , 而根瘤平均谷 酞胺合成酶(G S) 活力有所上升 。 2 年 生幼苗成
年瘤和老瘤超过单株瘤重的 70 % 。 成年瘤占总瘤重的百分比 5 月底达最大值 , 为 51 . 4 % 。 而老瘤在
6 月份达最大值 , 为 82 . 1 % 。 随着根瘤由幼瘤发育到成年瘤和老瘤 , 固氮活力递减 , G S 活力递增 , 而
N R 活力在成年瘤中最高 , 老瘤次之 , 幼瘤最小 。 根瘤超微结构观察表明 :随着根瘤的形成和发育 ,
宿主细胞线粒体数递减以致消失 , 泡囊变小且数 目递增 , 彼此排列成一紧密有序的结构 。 本文还讨
论了根瘤超微结构特征与 N R 、 G S 和固氮活力的关系 。
关键词 四川恺木 、固氮活力 、硝酸还原酶 (N R ) 、谷酞胺合成酶 (G S ) 、根瘤细胞 、超微结构
四川恺木 (A ln us c re m as lo gy n 己 B盯ki l )是非豆科固氮树种 , 也是我国南方重要的造林树
种 。 作者曾对四川恺木固氮活力 , N R 和 G S 活力对生长的影响以及不同氮素形态对酶的调节
作用作了初步研究” 。 但对根瘤中这 3 种氮素同化酶的综合分析研究 , 目前尚未见报道 。 对根
瘤超微结构的研究 , 过去多集中在根瘤菌 、 F ra 欣 la 的侵染过程 、根瘤结构及 N : a s e 厌氧机理
的探讨〔, 〕。 本文以四川恺木为试材 , 研究在生长过程中其根瘤活力 、 N R 和 G S 活力变化及不同
瘤龄根瘤的分布动态 。 并对不同瘤龄根瘤的超微结构与固氮活力 、N R 和 G S 活力的关系进行
了初步探讨 , 为氮素同化酶的固氮机理的深入研究提供依据 。
1 材料和方法
1
.
1 材料
取 2 年生恺木扦插苗 , 移植到相同土质的苗圃地里 , 经过 1 个 月恢复后 , 每隔 15 d 取样测
定 , 每次取 3 株 , 3 个重复 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 峭酸还原酶 (N R , N A D H : E . C . 1 . 6 . 6 . 1) 活 力测 定 按苏梦云等川体 内法 , 测定前不
进行诱导处理 。
1
.
2
.
2 谷酞胺合成酶 (G S : E . C . 6 . 3 . 1 . 2) 活 力 N.] 定 按黄维南闭描述的方法 , 稍有改进 。
2
.
3
2
.
4
酶蛋 白测定 按 F ol in 一酚法 。
固氮活 力浏定 按乙炔还原法 。
1 9 9 3一 1 1一 1 1 收稿 。
昊祖洪研究实习员 , 周国璋(中国林业科学研究院亚热带林业研究所 浙江富阳 31 1 40 0) 。
, 本文为第一作者研究生论文的部分内容 。
1) 吴祖洪 , 周 国璋 . 四 川恺木主要氮素同化酶活力的研究 . 1 9 9 3.
林 业 科 学 研 究 7 卷
1
.
2
.
5 根瘤电镜样品 的制备 在大 田摘取同株恺木根瘤 , 根据少(小 、 色洋 , 将很瘤分成幼年 、
成年 、老年 3 种 , 保存在 。℃以下 。 2 . 5 %多聚 甲醛一戊二醛固定 30 m in , 0 . I M 磷酸缓冲液清洗
2 次 , 每次 1 5 m in , 5 0 % 、 7 0 % 、 8 0 % 、 9 0 % 乙醇 , l , 1 和 1 , 3 的 9 5 % 乙醇 : 丙酮 , 9 5 %及 1 0 0 %
丙酮梯度脱水 , 每级 10 ~ 20 m in , 放置 20 m in 后 , 以 1 , 1 , 1 , 2 的丙酮 , 环氧树脂梯度浸透 3
~ 6 h
, 放置 24 h 后包埋 , 按常规超薄切片法制片 , 用透射电镜观察 , 然后拍片 。
2 结果与分析
2
.
1 恺木年生长初期根瘤主要氮素同化酶活力的变化
恺木在当地的生长期是 3一 n 月份 。 3 月份根瘤开始形成 , 5 月份根瘤发育成熟 , 固氮活力
不断上升 , 5 月底出现活力高峰 。 6 月份后可能受梅雨 、干旱气候影响 [’] , 根瘤开始衰败 , 活力下
降 (图 1 ) 。根瘤 N R 活力的变化趋势与固氮活力大体一致 , 只是 4 月底比 3 月初略有下降。 6 月
份后 N R 活力的下降不及固氮活力下降那么明显 。 从 3 月份到 5 月份 , 根瘤 G S 活力一直很
低 , 基本没多大变化 , 6 月份后才开始有所上升 。 这时正值根瘤开始衰败时期 , 估计根瘤 G S 活
力与根瘤衰败有关
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图 l 枪 本根痛固从活 )J 、 N R 十{z ( , 卜 、‘几) J的变化
2
.
2 恺木年生长初期不同瘤龄根瘤的分布及瘤重的变化
恺木 (2 年生 )在生长期存在着瘤龄的不同 , 按其色泽 , 大小分为老瘤 (必 0 . 6 ~ 0 . 8 。m , 黑
褐色 ) 、成年瘤 (必。. 3 ~ 0 . 6 。m , 黄褐色 )和幼瘤 (必< 0 . 3 C m ,淡黄色 )3 类 。 单株平均瘤重 4 月
底 比 4 月初稍有下降 , 5 月后逐月上升 。 老瘤占总瘤重百分比在 6 月份达到了最大值 , 其值为
82
.
1 %
。 成年瘤占总瘤重的百分 比从 4 月初起呈上升趋势 , 5 月底达到高峰 , 为 5 1 . 4 % , 6 月后
有所下降 。 幼瘤占总瘤重的百分比最高不超过 30 % , 4 月底 比 4 月初稍有增加 , 以后逐渐下降
(表 1 ) 。 从表 1 中还可看出 , 在单株瘤重中 , 老瘤和成年瘤始终占绝大多数 (超过 70 % ) 。 估计
根瘤的平均氮素同化能力主要由这两类根瘤决定 。
2
.
3 不同瘤龄根瘤固氮活力 、 N R 、 G S 活力比较
恺木根瘤的固氮活力随瘤龄的增长而下降 。 幼瘤固氮活力最高 , 成年瘤次之 , 老瘤明显下
降 , 根瘤 N R 活力以成年瘤为最高 , 老瘤次之 , 幼瘤最小 。 根瘤 G S 活力很小 , 随瘤龄增长稍有
增加 (表 2 ) 。 由此可见 , 固氮活力 、N R 、 G S 活力随着根瘤瘤龄的变化差异很大 , 但由于老瘤及
6 期 吴祖洪等 :四川恺木根瘤主要氮素同化酶活力及其超微结构研究
成年瘤瘤重占单株总瘤重的 70 %以上 , 至少可以初步断定根瘤的硝态氮及铰态氮同化能力
(反映为 N R 及 G S 活力)主要由老瘤及成年瘤决定 。根瘤 G S 活力变化趋势 (表 2 ) , 也与 G S 与
根瘤衰老有关的假说相一致 。
表 1 2 年生四川恺木幼苗年生长初期瘤龄 、瘤重的变化 (1 9 9 0 年 )
测定日期
(月一日 )
平均瘤重
(g / 株 )
各龄瘤重
(g / 株 )
0
.
3 9 0
各龄瘤重占总瘤重
(写)
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0 6一 10 l。 0 1 5 l:
.
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注 : O—老瘤 ; A—成年瘤 ;J—幼瘤 。
表 2 四川恺木不同瘤龄根瘤的 N R 、G S 与固氮活力
瘤龄 恶 色泽 N R 活力 G S 活力 固氮活力[ ”mo l N O 矛/ ( g Fw · h ) 〕 [ ( ) D 5 4 o / ( 9 e n z y m e · m in ) 〕 [产m o l C ZH . / ( g Fw · h ) 〕
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.
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.
8
0
.
3 ~ 0
.
6
< 0
.
3
黑褐色
黄褐色
淡黄色
0
.
70
0
。
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0
.
2 8
0
。
1 2 :
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2
.
4 恺木不同瘤龄根瘤超微结构特征
在幼瘤中 , 已看到明显的泡囊隔膜和内部共生丝状体 , 但泡囊间彼此比较疏松 。 这时可以
看到宿主细胞内集聚着许多线粒体 , 表明根瘤进行着旺盛的细胞呼吸 (图 2 一 1 ) 。 成年根瘤泡囊
变小而且数量递增 , 泡囊隔膜彼此紧挨形成致密有序的结构 。同时宿主细胞线粒体也相应减少
(图 2 一2 ) , 老瘤解剖结构中泡囊隔膜消失 , 丝状体融为一体 , 同时根瘤细胞缩小 , 宿主细胞器也
相应消失 (图 2 一 3 ) 。 将这些根瘤超微结构的变化与相应瘤龄根瘤的固氮活力 、N R 、 G S 活力相
比较 , 可 以看出 , 不同瘤龄根瘤超微结构中 , 宿主细胞线粒体的变化趋势与根瘤固氮活力相一
致 , 这暗示着根瘤的发育及其固氮能力 , 需要宿主细胞的呼吸作用提供能量和厌氧环境 , 这与
在大豆上的研究结果相一致 [s] 。 另外从照片上还可看出 , 根瘤从幼年到成年再向老年发育的过
程中泡囊结构有一个从疏松向致密有序到最终泡囊隔膜消失的变化过程 。 成年根瘤泡囊形成
一个致密有序的结构 , 也使根瘤具有较高的 N R 活力 , 这种结构有利于 N R 活力表达 。
3 结论
( l) 四川档木幼苗生长期 , 根瘤的氮素同化主要取决于固氮酶 , 但硝酸还原酶也很活跃 ,
6 期 吴祖洪等 :四川恺木根瘤主要氮素同化酶活力及其超微结构研究
成年瘤瘤重占单株总瘤重的 70 %以上 , 至少可以初步断定根瘤的硝态氮及铰态氮同化能力
(反映为 N R 及 G S 活力)主要由老瘤及成年瘤决定 。根瘤 G S 活力变化趋势 (表 2 ) , 也与 G S 与
根瘤衰老有关的假说相一致 。
表 1 2 年生四川恺木幼苗年生长初期瘤龄 、瘤重的变化 (1 9 9 0 年 )
测定日期
(月一日 )
平均瘤重
(g / 株 )
各龄瘤重
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0
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各龄瘤重占总瘤重
(写)
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注 : O—老瘤 ; A—成年瘤 ;J—幼瘤 。
表 2 四川恺木不同瘤龄根瘤的 N R 、G S 与固氮活力
瘤龄 恶 色泽 N R 活力 G S 活力 固氮活力[ ”mo l N O 矛/ ( g Fw · h ) 〕 [ ( ) D 5 4 o / ( 9 e n z y m e · m in ) 〕 [产m o l C ZH . / ( g Fw · h ) 〕
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4 恺木不同瘤龄根瘤超微结构特征
在幼瘤中 , 已看到明显的泡囊隔膜和内部共生丝状体 , 但泡囊间彼此比较疏松 。 这时可以
看到宿主细胞内集聚着许多线粒体 , 表明根瘤进行着旺盛的细胞呼吸 (图 2 一 1 ) 。 成年根瘤泡囊
变小而且数量递增 , 泡囊隔膜彼此紧挨形成致密有序的结构 。同时宿主细胞线粒体也相应减少
(图 2 一2 ) , 老瘤解剖结构中泡囊隔膜消失 , 丝状体融为一体 , 同时根瘤细胞缩小 , 宿主细胞器也
相应消失 (图 2 一 3 ) 。 将这些根瘤超微结构的变化与相应瘤龄根瘤的固氮活力 、N R 、 G S 活力相
比较 , 可 以看出 , 不同瘤龄根瘤超微结构中 , 宿主细胞线粒体的变化趋势与根瘤固氮活力相一
致 , 这暗示着根瘤的发育及其固氮能力 , 需要宿主细胞的呼吸作用提供能量和厌氧环境 , 这与
在大豆上的研究结果相一致 [s] 。 另外从照片上还可看出 , 根瘤从幼年到成年再向老年发育的过
程中泡囊结构有一个从疏松向致密有序到最终泡囊隔膜消失的变化过程 。 成年根瘤泡囊形成
一个致密有序的结构 , 也使根瘤具有较高的 N R 活力 , 这种结构有利于 N R 活力表达 。
3 结论
( l) 四川档木幼苗生长期 , 根瘤的氮素同化主要取决于固氮酶 , 但硝酸还原酶也很活跃 ,
6 期 吴祖洪等 : 四川恺木根瘤主要氮素同化酶活力及其超微结构研究 6 3 3
S tu d ie s o n th e M a in N it
r o g e n A ss im ila t io n E n z yxn e s A e tiv itie s a n d
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K ey w o r d s A ln u s ere m a st o舒n e , n it r o g e n fix in g a e tiv it y , n it r a t e r e d u e ta s e (N R ) , g lu -
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