全 文 ：第 3 卷 第 1 期
1 9 9 0 午 2 月
林 业 科 学研 究
FO R E ST R卫SEA R CH
V o l
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3
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1
1 9 9 0
小叶杨 X 旱柳属间杂交
实验胚胎学研究 ‘
徐 涵 . 带 李文铀
(中国林业科学研究院林业研究所 )
摘要 旱柳花粉能够萌发 , 花粉管能进入 小叶杨柱头。 受精过程基本正常。 杂
交障碍主要表现在 : 花粉管在花柱基部生长受胆 , 花粉管在子房腔 中缠绕 , 受精频
率低 , 胚和胚乳发育不协调 , 胚 出现异常发 育、 停滞 发育和败育现 象。 本文支持以
不 协调性模型解释杂交障碍的机制 。 报道 了旱柳和小叶杨属间杂交原胚期胚珠培养
的成功 。
关键询 小叶杨, 旱柳, 杂交 , 胚珠培养
杨属和柳属树种是重要的造林树种 , 根据前人育种工作 , 此两属间杂交极难成功 , 但杂交
障碍情况不明。 本文以小叶杨 (P叩 : lu s : io on fi)和旱柳 (S a lix 二a ts u d a : a )为材料 , 对杂交胚
胎学问题进行探讨 , 以期揭示杂交障碍 , 并寻求克服障碍的途径 。
一 、 材料和方法
小叶杨雌枝和旱柳雄枝均采自北京西郊 , 按常规杂交育种法进行人工杂交 〔‘一 “了。 授粉时
室温 25 ℃ 。 花柱枯萎后将隔离袋脱去。 从授粉至果实成熟 , 温室日平均温度 25 ℃ , 夜平均
温度 10 ℃ 。
石蜡切片厚 8 卜m , 苏木精固绿或 PA S 苏木精染色 , 荧光及扫描电镜方法同以往报道[ 艺]0
胚和胚珠培养以 M S 或 1 / ZM S 为培养基 , 培养温度 25 士 2 ℃ , 日光灯补充照明 1 2 h /天 。
二 、 观 察 结 果
(一 ) 对亲本特性的观察
1
. 小叶杨和旱柳雌蕊和花粉的比较(表 1 )
2
. 早柳花粉的活 力检验 用离体萌发率表示花粉活力 , 培养涅度与杂交授粉时的 温 度
均为25 ℃ 。 统计不同条件下培养花粉的平均萌发率 、 萌发速度和平均生长速度。 实验表明 ,
旱柳花粉在 2 . 5 %一 7 . 5 %纯蔗糖液中就可萌发 , 5 % 最适 ; p H 4~ 9 , 以 p H 7 最适 , 授
本文于1 98 9年 5 月 12 日收到。
* 国家自然科学基金资助项目 。 扫描电镜工作承徐炳文先生协助 , 谨致谢意。
* * 本文由徐涵硕士论文修改而成。 徐涵现在地 址 : 中国科学技术出版社。
林 业 科 学 研 究 3 卷
表 1 小叶杨和早柳雌慈和花粉有关性状的比较
一尸一一, . . , . ~ 一 一 ~ 」 一 , ~ . ,曰一一 r . . , ‘. . . , . . , r, . . 曰 . 曰. , , . . , 一 , 州. . 侧. . . . . 口 . . . . 月 .。 , ⋯ ,] 、 叶 杨 }
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雌蕊 长度¹ ⋯ , : 。。。rn 飞。。。。m
心 皮 数 一 2 2
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_ _ 南竺 珠 ⋯ 倒 生 · 平均 10 枚 一 , 如 ; ,竺‘ 不 } 侧 脱 . _ _ _ _ _ _ 幕 _ _ 底枉 头 一 “裂 , 接受面大 , 接受面细胞圆 顶状 连裂 , _ 接受面 ,]. _ 接及面 细饱乳哭竺_ . ‘ _花 柱 ⋯ _ 短 、 乡叭 分离 , 墓部组织排列 紧 . 并贮 ’ 刻、叶杨的灿 买心 , 合生 , 组织排列 觅松
1 藏组织化
珠 被 数
心囊珠胚
成熟花粉 画球型 , 无 沟无孔 , 顺粒纹饰 , 平均直径
28
.
!卜m c3 )
椭 圆球状 , 三沟 , 网状纹饰 , 平均直径 15 . 93 协m »
传粉煤介 风 媒 虫 媒
¹ 2 。个雌蕊的 平均俄 , » 2。个子房的平均位 , À 10 0个花 粉的平均值 。
粉前按上述条件确定花粉活力 , 活力 < 90 %的不用于杂交授粉。
3
. 种 内授扮对照
旱柳 x 早柳 授粉后半小时花粉水合膨胀 , 部分开始萌发。 授粉后 l h , 绝大多数花粉
萌发。 授粉后 Z h , 大量花粉管进入柱头 。 花粉管在柱头上很少爬行 , 一般生长不超过 30 ; m
即进入柱头 。 花粉管在子房腔中生 长相对平直 , 一子房内胚 珠一般都能发育为种子 。
小叶杨 X 小卜1杨 对种内传粉的胚胎学研究已有报道 I ’; 。 本实验对所采小叶杨雌株的自
然传粉子房进行了统计 , 平均每子房含饱满种子1。枚 。
( 二 ) 小叶杨 又 旱柳花粉 I 行为
旱柳花粉在小叶杨柱头上都能水合 , 授粉后 l h (1 H A P) 开始萌发 , 2 H A P 萌发达最大
值 , 并大量向柱头内生 一民。 萌发率 60 % (花粉活力 90 % ) , 进入柱头的花粉管数占授粉量的
30 %一 40 % 。 部分花粉管在住头表面爬行、 扭曲 , 不能进入柱头 。柱头无拼胀质反应 。 5 H A P
花 粉管达花柱基部 , 21 . 5 H A P 花粉管开始进入子房(图版 工一4 , 5 , 7 ) 。
大量花粉管到达花柱基部后停滞不前 , 管内沉积脱眠质 , 只有少量花粉管能够进入子房 ,
这与旱柳和小叶杨种内传粉的情形迥异 。 对小叶杨和旱柳花柱基部进行解剖比较 , 发现旱柳
花柱组织疏松 , 花柱较短 (图版 工一 3) , 小叶杨花柱较长 , 花柱组织较紧密 , 子房腔在花柱基
部稍有延 一长(图版 工一 1) , 腔壁为一层排列紧密的表皮细胞 , 这层表皮细胞及附近的花柱细胞
贮藏组织化 , 富含淀粉粒 (图版 卜 2 ) 。
除个别花粉管在 30 H A P 到达距花柱最近的胚珠外 , 一般是在 57 ~ 94 H A P 进入子房腔 。
在观察的近 10 个子房中 , 只有约一半出现花粉管 (图版 工一7 ) 。 进入子房腔的花粉管又有一
些在子房腔上方缠绕 , 不能 向胚珠生 长( 图版 工一 6 ) 。 已接近胚珠的花粉管生长平滑 , 在珠孔
旁可急转弯向珠孔生长( 图版 1 一 8 , 9 ) 。
( 三 ) 杂交受精作用和胚与胚乳的发育
受粘作用发生在授粉后第 8 天 。 出现受精作用的子房 , 一般进入子房腔的花 粉管有限 ,
1 期 徐涵等 : 小叶杨 x 旱柳属间杂交实验胚胎学研究
达 4 ~ 6 条 , 而且有时部分花粉管在子房腔上部缠绕。 由于进入子房的花粉管有限 , 绝大多
数胚囊没有机会接受花粉管 , 因而受精频率很低 ; 但如果花粉管进入胚囊 , 受精作用可正常
进行(图版 亚一1 ~ 4 )。
一般初生胚乳核比合子早 3 天分裂 , 授粉后 n 天 (n D A P) 出现 2 细胞原胚 (图版 卫芍 )。
杂种胚多在 13 ~ 1 5 D A P 发育到球形期 , 但有些胚已发育到心形期至鱼雷期 , 而有的只处于
2 细胞期或合子期。 在合子期至心形期 , 杂种胚出现败育 (图版 l 一 2 , 3) 和异常现象 (图 版
1 一 6一 8 )。 在鱼雷期一些胚的子叶细胞出现大量小核 , 多的每细胞 5 一 6 个 , 这些小核分散
在细胞质中(图版皿飞 )。
胚乳游离核数在合子期为 2 ~ 32 个 , 2 一 3 细胞原胚期为 7 ~ 61 个 , 4 ~ 6 细胞原胚期
为 17 一6 个 , 7 一 8 细胞原胚期为 3 一 14 。个。 由此可见 , 在相同的胚发育时期 , 胚乳游离核
的数目差异很大 。 同时 , 在授粉后同一天中 , 各胚囊的胚乳游离核数差异更大 , 达数十至数
百个 。
胚乳游离核或细胞在发育期间都能进行正常的有丝分裂 (图版 l 一 5 , 6 )。 特别是在胚败
育时 , 旁边的胚 乳仍可进行正常的有丝分裂(图版 五一2 )。 胚乳多核仁的情况时有发生 , 但胚
不因此而败育 (图版 1 一 9 , 1的 。 胚乳细胞化最早发生在 15 D A P , 与亲本的时间相同 , 这时
胚处于球形期至鱼雷期 , 或发育良好 , 或败育 。
在相同条件下 , 未授粉的小叶杨和旱柳雌花枝都没有任何成熟或发育的果实 , 花序相继
枯萎脱落 。 该对照显示本实验无花粉污染。
(四 ) 通过离体培养获得杂种试管苗
在授粉后第 n 天 , 以 1 / ZM S + 0 . 01 m g / L IA A + o . l m g / L BA + o . 01 m g / L G A 培养墓
对原胚期杂种胚珠进行培养 , 1 0 天后获得了 5 株试管苗 (出苗率 14 . 7 % ) (图版 W 一 1 ~ 7 )。
在这一培养中 , 杂种苗可由两种方式产生 : ¹ 合子胚长出子叶 (图版 W 一 3一6 ) ; º 下胚轴先伸
出并分化芽丛 (图版万 一 2 ) 。 另有一个芽丛来源不明 , 是由珠被内直接长出芽丛 (图版 IV 一 1) 。
无论子叶能否长出 , 顶芽都不易发育而被下胚轴基部分化的芽丛取代 (图版 Iv 一4一 6 ) 。
在杂种胚发育后期的各阶段对胚和胚珠进行离体培养都获得了试管苗 , 出苗率 约49 % 。
附加0 . 01 m g / L IA A 、 。. 1一。. 4 m g / L BA 和 (或) o . 01 m g / L G A 的 l/ ZM S 和 M S培养基对
杂种胚和胚珠是普遍适宜的。 在近成熟期 , 培养基不加激素就能满足杂种胚和胚珠的离体生
长需要 ( 图版 皿 一 7 ~ 9 ) 。
三 、 讨 论
(一 ) 杂交障碍及其克服途径
尽管旱柳花粉在小叶杨柱头上有不能萌发、 爬行、 盘绕等障碍 , 但因为大量花粉管可以
进入柱头 , 故杂交的主要障碍不发生在柱头上 , 而在于 : ¹ 大量花粉管无力通 过 花 柱 。 花
粉管在花柱中生长速度最初与亲本的情形相似 , 但在花柱基部受到贮藏组织化的质密区的阻
碍。 º 进入子房的花粉管数不多 , 而约有一半 (有的为全部 )花粉管在子房腔上方缠绕成团 ,
进一步减少了受精的机会 。 » 胚停滞发育和败育 。 本实验对杨属和柳属属间杂交的胚和胚珠
进行培养都获得了试管籽苗 , 这证明胚和胚珠培养是克服杂种胚败育 , 特别是拯救停滞发育
林 业 科 学 研 究 3 卷
胚的有效途径 。 这次对杨属和柳属属间杂交原胚期胚珠培养的成功 , 使远缘杂交受精后障碍
的克服范围提前到了早球形胚期。
(二 ) 远缘杂交降碍的机制
本实验结果表明 : ¹ 旱柳花粉管不能大量进入子房或到达胚囊 , 主要是由小叶杨雌蕊的
结构及生理状况与旱柳的差异造成的。 只有具足够活力的旱柳花粉管才有可能穿越小叶杨花
柱进入子房腔。 º 杂种胚和胚乳发育不同步的实质是一部分胚或胚乳发育 , 而另一部分发育
迟缓或停止 , 胚和胚乳各按自己的遗传状况进行其生理进程。 虽然 _ 匕述两个方面障碍的发生
位点不同 , 但都显示了一种不协调关系 , 即在抱子体与配子体之 间、 杂种胚与胚乳之间 , 缺
乏协调 的匹配关系 。
许多研究者发现胚的败育与胚乳有 关 〔’ , ‘l。 在本杂交中 , 胚乳整体败育极少 , 胚乳能正
常有丝分裂 , 细胞化的时间也与种 内传粉的情形相同 , 特别是在败育的胚奔可以伴有完全正
常的胚乳 , 因此 , 本杂交中胚败育的原因不在于胚乳败育而切断了胚 的营养 , 而主要是杂种
细胞内远缘基因组的不协调表达 , 杂种后 代自身失去了正常协调的生长代谢功能。 杂种胚和
胚乳细胞中出现大量小核 , 这是远缘基因组互相排斥的结果 , 杂种胚和胚 乳发育的不协调是
这种基因基础的反映。
在解释远缘杂交障碍 , 追踪其基因基础时 , 部分人将解释自交不亲和性的 S 等位基因模
型推延到杂交障碍的解释中 t“ 1, 对此 , rfo g e n b沁m ( 19了5) 提出不同见解 , 认为远缘杂交障碍
的主要机制是不协调性 , 即由于杂交双方缺乏匹配的遗传信息而被动拒绝 , 造成杂交无效。
识 别的不亲和性随着杂交双方亲缘关系的疏远而变为次要的〔’] 。本实验结果支持 H o g en bo m
的不协调性模型 , 但是 , 认为该理论忽略了植物及其细胞作为一个有机的整体可 能 发 生 的
随机生理活动对不协调性障碍的影响 , 同时 , 该模型 也未能解释组培条件可拯救杂种胚的事
实 。
作 为对这一理论的扩展和修改 , 本文将杂交障碍 .钓 “多位点性 ”和植物体内的“随机过程”
引入不协调性理论 。 多位点性是指杂交障碍在杂交有 叹过程和杂种 F ; 代 发 育中可以在多个
位点发生 。 即在同一个杂交中 , 杂交障碍在受精前 、 交杯、和受精后的诸阶段 『户能 够 出 现 多
次 , 只要存在杂交双方遗传信 自、不 匹配的地方 , 毛怡交障碍就可能在那里发生 。 小叶杨 “ 旱柳
的杂交障碍就具有这一 性质 。 随机过程是指当杂交障碍发生时 , 植物体内可出现某些随机的
生理活动 。 这些活动有些是无益的 , 有些则对 克服障碍有益 , 能替代或弥补某个缺失基因的
功能 、 或甚至领顽 一桨个远缘不协调基因的作用 , 以缓解障碍造成的损失 。 当障碍发生时 , 如
果体内没有这种保护性随机活动 , 则有性过程或个体发育就不能继续进行 , 当这种活动的作
用较强时 , 不协调性就被相应地克服 , 不 一再成为杂交的主要障碍 。 在 小叶杨 义 早 柳 的 杂交
中 , 旱柳花粉管对扩大了的小叶杨子房脸不适应 , 生长呈随机状态 , 但当花粉管在随机生长
中进入雌配子休吸引的有效半径时 , i丛趋向珠孔生长。 在受精后障碍中 , 当杂种胚在发育过
程中远缘基因组的表达不能满足胚 的发育需要时 , 有的胚可产生一些保护性随机活动 , 如甩
掉部分不协调的染色体片断 (如在杂种胚和吓乳细胞中看到的小核 ) , 或由正常的细胞进行分
裂 , 取代败育的细胞, 有的胚叨在这一 价点无法凭自身或借助胚乳物质克服不协词性 , 出现
发育停滞 、 趋 于收育的借形 , 这时用离体培养方法提洪胚生 民均必要物质就成为克服杂种胚
败育的重要途径 。 组织培养可以起类似植物体随机过程的作用 , 如果培养环境包含了胚发育
1 期 徐涵等: 小叶杨 x 旱柳属间杂交实验胚胎学研究 3 3
所需要的条件 , 该离体培养就能帮助杂种后代渡过不协调阶段。 但这里产生了一个重要的生
物技术问题 , 即由于不协调性的表现形式和出现的阶段各不相同 , 所以理论上在同一培养条
件下 , 一般不可能使杂种胚全部得到拯救。 因此 , 离体培养所要做的只是 : ¹ 找到大多数杂
种胚发育所需要的培养条件, º 扩大杂种败育胚的拯救范围。
参 考 文 献
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12 t 233~ 256
、
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n o ”一 fu n e t i o n i n g o f i n t im a t e P a r t n e r r e lat i o n s h玉P s , P ; 0 0 . R . 夕 o e . L o 界 d . B . , 15 5 : 56 1~ 37 5 .
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in t o t h e st ig m a w i th no s er io us b a r r i er s
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ar e : ¹ Mos t o f th e P{) lle n tu be s e ease t o g r o w a t th e b a s a l p a r t o f t h e 3ty le
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PO llen tu b es w h ie h h a v e en t e r e d t h e o v ar i a n e a v i ty e o i l a n d fa i l t o r ea e h th e
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r yos e ve n abo r t b e fo r e 服tu r a tio n . I 拜 口玄t : 0 e u ltu r e o f i丈n 幻Qa tur e em b ry o s o r
o v u les 15 Pr ove d to b e e fle e t i ve to o v er e om e p os tfe r t i liza t io n b a rr i e rs
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m o d e l fo r inco
n g r u it y 15 d is e u ss e d h e r e
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A s a n im Pr o v em e n t , t比 e o n c e Pts o f
r a n d o m P r o e es s a n d P o lyPla e it y a r e i n tr o d u e e d in t o th e m o d e l
.
K e y w or d s P叩林I彩5 5加乙n订; S a l1’x 优“‘: “d‘”a ; c ro 阳 ; e m b ry o e u ltu r e