全 文 ：第 51 卷 第 11 期
2 0 1 5 年 11 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 11
Nov．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20151108
收稿日期: 2014 － 12 － 19; 修回日期: 2015 － 05 － 12。
基金项目: 国家自然科学基金项目(31370645) ; 引进国际先进林业科学技术项目(2013 － 4 － 10) ; 中央级公益性科研院所基本科研业务
费专项资金项目(CAFＲIFEEP201415) ; 国家高技术研究发展计划项目(2012AA101501)。
* 严东辉为通讯作者。
基于杨生褐盘二孢菌 2 个专化型的 ITS2
二级结构特征分析*
孙晓明1 严东辉1，2 贺 伟3 张星耀1，2
(1．中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 国家林业局森林保护学重点实验室 北京 100091;
2． 南京林业大学南方现代林业协同创新中心 南京 210037; 3．北京林业大学 北京 100083)
摘 要: 【目的】杨生褐盘二孢菌在杨属的不同寄主上存在 2 个专化型，根据形态特征和现有的一些核酸分子序
列标记上不易区分;本文在利用盘二孢属核糖体转录间隔区( ITS)序列构建的系统发育树基础上，结合 ITS2 区分
2 个专化型的特异性。【方法】对 23 株杨生褐盘二孢菌孢子形态特征观察。以基因组 DNA 为模板进行 PCＲ 扩增，
得到 ITS 序列。对从 NCBI 数据库中下载的盘二孢属的参考 ITS 序列，分别利用最大似然法、最大简约法和贝叶斯
法构建 3 种系统发育树。同时，结合应用 The ITS2 database 预测 ITS2 二级结构模型，从分子进化角度分析杨生褐
盘二孢菌 2 个专化型的特性。【结果】在寄主叶片上挑取的病原菌孢子形态比较典型，而在培养基上培养的孢子
形态差异较大，不能依据传统的芽管萌发数有效区分 2 个专化型。3 种 ITS 序列系统发育树可区分盘二孢属的 3
个种，但无法将参考 ITS 序列准确定位到专化型中。通过比较盘二孢属 ITS2 二级结构发现: 蔷薇盘二孢菌和苹果
盘二孢菌种内的菌株以及包括参考 ITS 序列在内的杨生褐盘二孢菌同一专化型的 ITS2 二级结构模型完全相同，但
3 个种之间及杨生褐盘二孢菌 2 专化型之间，ITS2 二级结构上有多个位点的碱基差异。其中，杨生褐盘二孢菌白杨
专化型的 ITS2 二级结构中螺旋Ⅰ上第 17 位碱基为 A，螺旋Ⅱ上第 43 和 44 位碱基为 AC，螺旋Ⅲ的 CBC 位点上配
对碱基是第 76 和 114 位碱基 C 和 G，hemi-CBC 位点上是第 75 位碱基 U; 黑杨专化型的 ITS2 二级结构中螺旋Ⅰ上
第 17 位碱基为 U，螺旋Ⅱ上第 43 和 44 位碱基分别为 G 和 U，螺旋Ⅲ上 CBC 位点上配对碱基分别是第 76 和 114 位
的碱基 U 和 A，hemi-CBC 位点上是第 75 位碱基 C。杨生褐盘二孢菌 2 个专化型在这些结构上存在碱基变异。【结
论】基于 ITS 序列构建的 3 种系统发育树能将盘二孢属真菌在种间水平上进行区分，但不能在种内区分; 通过
ITS2 二级结构的比较可发现，盘二孢属内不同种和专化型的碱基存在明显差异，且种内专化型存在 CBCs 配对碱基
差异。因此，ITS2 二级结构和系统发育树是更有效地区分杨生褐盘二孢菌 2 个专化型的分子依据。
关键词: 杨生褐盘二孢菌; 专化型; 系统发育树; ITS2 二级结构; CBC 分析
中图分类号: S718. 8 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)11 － 0060 － 09
Characteristics of ITS2 Secondary Structure of Marssonina brunnea
Two Formae Speciales
Sun Xiaoming1 Yan Donghui1，2 He Wei3 Zhang Xingyao1，2
(1 ． Ｒesearch Institute of Forest Ecology，Environment and Protection，CAF Key Laboratory of
Forest Protection of State Forestry Administration Beijing 100091; 3 ． Beijing Forestry University Beijing 100083)
Abstract: 【Objective】Two formae speciales of Marssonina brunnea in Populus genus cannot be distinguished easily
based on their morphologies and some nucleic acid molecular sequence marks． In this study，we applied combination of
the phylogenetic trees with Marssonina ribosomal internal transcribed spacer( ITS) sequence and the secondary structures of
ITS2 to discriminate the specificities of the two formae speciales． 【Method】The twenty-three strains were cultured for
fungal spore morphology observation． Genomic DNA was used as a template for PCＲ amplification on their ITS sequences．
The reference ITS sequences of Marssonina were downloaded from the NCBI database． Three phylogenetic trees based on
ML，MP and Bayes methods，respectively，were constructed． The ITS2 database was applied to predict ITS2 secondary
structure model，and analyze the characterizations of the two formae speciales from the perspective of molecular evolution．
第 11 期 孙晓明等: 基于杨生褐盘二孢菌 2 个专化型的 ITS2 二级结构特征分析
【Ｒesult】The pathogen spore had a typical morphology of a forma specialis in host leaves in the field，but the spores were
quite different in morphology on culture medium． We can’t effectively distinguish two formae speciales on the basis of the
traditional number of germinated germ tubes． Three kinds of ITS sequences phylogenetic trees according to ML，MP and
Bayes approaches showed that there were three species in Marssonina genus． But reference ITS sequences with a formae
speciales from M． brunnea can’t be accurately located into the other same formae speciales with other strains． With the
ITS2 secondary structure prediction model，it was found that Marssonina ITS2 secondary structure was identical in the
three species，M． rosae，M． coronariae，and two formae speciales of M． brunnea． But the ITS2 secondary structures have
multiple bases sites different among the three species． In the ITS2 secondary structure of M． brunnea leuce biotypes，the
17th base is A in Helix I，the 43th and 44th bases are AC in Helix II． The compensatory base change(CBC) sites are the
76th C and 114th G，hemi-CBC site is the 75th U in Helix III． In the ITS2 secondary structure of M． brunnea aigeiros
biotypes，the 17th base is U in Helix I，the 43th and 44th bases are GU in Helix II． The compensatory base change
(CBC) sites are 76th U and 114th A，hemi-CBC site is the 75th C in Helix III． These base changes are distinguished in
two formae speciales in the ITS2 secondary structure．【Conclusion】The Marssonina strains can be distinguished in species
level by three phylogenetic trees base on ITS sequences，but cannot be distinguished into subspecies; With comparative
analysis of ITS2 secondary structures，the Marssonina genus is obviously different，and there are also compensatory base
changes within formae speciales． Application of ITS2 secondary structures combined with phylogenetic trees can be more
effective molecular characterizations to distinguish the two formae speciales in M． brunnea．
Key words: Marssonina brunnea; forma specialis; phylogenetic tree; the secondary structure of the ITS2;
CBC analysis
杨生褐盘二孢菌［(Marssonina brunne ( Ell． et
Ev． )Magn．］是杨树叶部的专性致病菌，引起杨树黑
斑病，在我国有广泛的分布，造成林业经济损失(李
传道，1984; 韩正敏等，1998; Zhu et al．，2012)。杨
生褐盘二孢菌在杨树上存在不同专化型(李传道，
1984;贺伟等，1991;韩正敏等，1998; Han et al．，
2000;梁伟红等，2006)，在侵染过程中根据其寄主
派系和孢子萌发时的芽管数不同分为多芽管专化型
(Marssonina brunnea f． sp． multigermtubi)和单芽管
专化型 (Marssonina brunnea f． sp． monogermtubi)。
多芽管专化型主要寄生在黑杨派( Section Aigeiros)
和青杨派(Section Tacamahaca)杨树上，孢子萌发时
有1 ～ 5个芽管，多为 2 ～ 3 个; 单芽管专化型主要寄
生在白杨派(Section Leuce)杨树上，孢子萌发时仅有
1 个芽管。杨生褐盘二孢菌 2 个专化型的划分适合
我国的大多数地区 (贺伟等，1991; 韩正敏等，
1998; Han et al．，2000)。在人工培养条件下(韩正
敏等，1998; Han et al．，2000)，分离自白杨派杨树
上的菌株在 PDA 培养基上菌落呈深褐色，并产生酱
红色的孢子堆;来自黑杨派和青杨派上的菌株在
PDA 培养基上菌落灰色，产生黄绿色孢子堆。在培
养基表面洗下真菌孢子，制取孢子悬浮液接种到杨
树叶片，结果发现白杨派专化型菌株只能使白杨品
种致病，黑杨派专化型菌株只能引起黑杨或青杨品
种致病。笔者在培养基培养条件下发现，杨生褐盘
二孢菌生长缓慢，菌株单个分生孢子形态变异幅度
较大，以芽管的萌发数区分并不明显，其专化型在培
养性状上难以区分; 而在接种寄主后，在叶组织上
产生的孢子萌发芽管数与前人的研究结果相同，即
单芽管和多芽管的区分。
利用分子手段鉴定物种种类已经应用非常广
泛，CO1、ITS、LSU、ＲPB1 等分子标记在真菌上有着
很多的应用(Schoch et al．，2012)。与其他区域的分
子标记相比，核糖体内部转录间隔区 ( ITS)由于
PCＲ 扩增成功率高、在种水平鉴定类别、技术简便
等优点在真菌的种类鉴定上被用来作为主要参考区
域 ( Kress et al．， 2005; Seifert et al．， 2009;
Hollingsworth，2011;Schoch et al．，2012)。 ITS 也可
以为一些真菌提供判别遗传距离差异程度的指标，
在系统发育方法识别真菌的系统分类单元也时常有
效。使用 ITS 研究系统发育关系已经有庞大的数据
支撑。利用 ITS 鉴定杨生褐盘二孢菌时发现，2 专
化型存在碱基信息的差异，但是这些碱基信息并不
足以将 2 个同源的分类单元很好地区分。与基本的
核苷酸序列相比，二级结构是最好的辅助系统分类
特征，有助于提高系统发育的识别能力 ( Kruger et
al．，2008)。ITS2 虽然其长度和序列是多种多样的，
但是它的二级结构中有高度保守的核心结构
(Coleman et al．，2003; Schultz et al．，2005)，同时二
级结构也增加了分类学特征和亲缘分辨能力
16
林 业 科 学 51 卷
(Kruger et al．，2008)。配对碱基变化( compensatory
base changes，CBC)分析是利用二级结构中配对碱
基的变化来分析遗传距离很近菌株的差异，在昆虫
及植物上都能很好地区分种属关系( Koetschan et
al．，2010; Ｒuhl et al．，2010; Caisová et al．，2011)，这
使 ITS2 二级结构在物种种类鉴别上的应用越来越
受到人们的关注。
笔者对分离得到的 23 株杨生褐盘二孢菌进行
测序，获得 ITS 序列，并与 NCBI 数据库中盘二孢属
的 ITS 序列合并，构建系统发育树，预测 ITS2 二级
结构模型，从分子进化角度分析杨生褐盘二孢菌 2
个专化型的区别，为真菌的种内专化型的鉴定提供
依据。
1 材料与方法
1. 1 供试菌株获取
于 2013 年 5—10 月分别在河北任丘(115°56―
116°26 E，38°33― 38°57 N)、北京海淀 (116°03―
116°23E，39°53― 40°09N)进行杨树黑斑病发生情况
调查，观察黑斑病的发病时期及危害状况。调查的杨
树品种有: 107 杨(Populus euramericana cv． 74 /76)、欧
洲黑杨(P． nigra)、毛白杨(P． tomentosa)(表 1)。
采集样本材料进行组织分离，获取黑斑病菌株。
采取刚刚发病的植物组织材料，用无菌的褐色信封
包装后带回实验室，先把杨树叶片用无菌水冲洗晾
干后，直接用消毒的剪刀剪去带有病斑的组织，将剪
好的组织片 ( 3 mm × 3 mm)先用 75% 乙醇消毒
1 次，然后用 3%次氯酸钠消毒 2 min，最后用无菌水
洗涤 3 次，接种到 PDA 抗性培养基上，培养基灭菌
后加入硫酸链霉素(50 μg·mL － 1 )以抑制细菌生长。
保证一次性培养皿中有一定的湿度，待病斑上长出
白色分生孢子角后挑取分生孢子到新的培养皿中
培养。
1. 2 杨生褐盘二孢专化性孢子形态基础
用分离得到的菌株配制孢子悬浮液，浓度稀释
为 103 个·mL － 1 后均匀涂抹到 PDA 平板上。在
25 ℃黑暗条件下培养，每隔 2 天在解剖镜下观察培
养皿中孢子的生长状况，并挑取菌丝在显微镜下观
察是否产孢。将孢子接种到寄主叶片上，待产生病
斑后，挑取分生孢子角配制孢子悬浮液浓度为 105
个·mL － 1，用移液器滴加 50 ～ 70 μL 孢子悬浮液至
盖玻片上，将凹玻片凹槽周围湿润，盖玻片倒置在凹
玻片下，放到湿润的培养皿中，在 25 ℃黑暗条件下
培养。将光学显微镜 ( OLMYMPUS BX51) 及设备
OLMYMPUS DP72 连接至计算机终端，利用软件
cellScns Entry 1. 5 在计算机上观察测量 10 个孢子
的大小及 100 个孢子的芽管萌发情况，试验重复
3 次。
1. 3 ITS 序列的获取
先利用 CTAB 法提取病原菌 DNA，然后利用真
菌引物 ITS1 / ITS4 ( 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-
3 /5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) 扩增核糖体
内部转录间隔区 ITS1-5. 8S-ITS2 序列(White et al．，
1990)。普通 PCＲ 扩增体系为 25 μL［PCＲ Mix12. 5
μL(博迈德)，引物 ITS1 / ITS4 各 1 μL，DNA 模板
1 μL，加 ddH2O 9. 5 μL］。反应程序为:94 ℃预变
性3 min;94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸
1 min，33 个循环;最后延伸 5 min。凝胶电泳检测
PCＲ 结果:取 3. 5 μL PCＲ 原液样品，加入 2 ～ 3 μL
6 × Loading buffer，以 DNA MarkerⅡ为分子量标准，
在 1%的琼脂胶中电泳 35 min，观察电泳结果。将
PCＲ 产物测序(三博远志公司)，测序所得结果通过
拼接比对校准后，在 GenBank 中 Blast，进行序列的
同源性比较。
1. 4 系统发育分析及 ITS2 二级结构模型
测 序 获 得 的 序 列 经 过 Bioedit 7. 0 和
DNAMAN6. 0 比对拼接，去除错误碱基。使用软件
sequin 整理序列信息后提交到 GenBank，获得登录
号 KM246325—KM246347，KP099198，KP099199(表
1)。从 GenBank 中下载参考菌株 ITS 序列(表 2)。
其中，Pezicula eucrita 作为发育树的外群，ITS 的
GenBank 登 录 号 AF141194. 1。序 列 比 对 使 用
MAFFT version 7(Katoh et al．，2002)，根据 Modeltest
3. 7 中的 AIC 准则构建系统发育树的模型，系统发
育关系的推断采用最大似然法 (ML)、贝叶斯法
(BI)和最大简约法(MP)。通过 ＲaxML( Stamatakis
et al．，2008)构建盘二孢属 ITS 的 ML 系统发育树，
BI 系统发育树分析利用 MrBayes3. 2. 2 (Ｒonquist et
al．，2003)，MP 系统发育树的构建利用 PAUP4. 0，
3 种方法均采用自距检验估计所构建系统树的置信
度，重复检验次数均为 1 000。
ITS2 序列的获取是在 The ITS2 database 上，首
先利用 Hidden Markov Model(HMM)在 ITS 序列中
对 ITS2 的位置进行注释(Annotate tab)，其中几个相
关的参数分别是: “fungi / Maximum E-value ＜ 0. 01 /
Minimum size of ITS2 100 or 150”，ITS2 二级结构被
限定在 5. 8S 和 28S 之间。通过完整的数据同源性
建模预测二级结构(Predict tab)，除了可预测整体结
构，在螺旋Ⅲ顶端具有的保守结构如“UGGU”和在
第 2 个螺旋上的 U-U mismatch 也可以被定位(Motif
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第 11 期 孙晓明等: 基于杨生褐盘二孢菌 2 个专化型的 ITS2 二级结构特征分析
tab)(Koetschan et al．，2010)。将获得的 ITS2 和模
型输入到软件 4SALE 中，对 ITS2 二级结构进行
CBC 分析，同时利用该软件对图形进行编辑( Seibel
et al．，2006; 2008)。
表 1 杨树叶片上分离得到杨生褐盘二孢菌供试样本
Tab． 1 The samples of Marssonina brunnea from popular leaves
菌株编号
No． of
strains
GenBank
登录号
GenBank No．
地点
Location
日期
Date
寄主
Host
B1 KM246325 北京海淀 Haidian，Beijing 2013 －08 毛白杨 P． tomentosa
B2 KM246326 北京海淀 Haidian，Beijing 2013 －08 毛白杨 P． tomentosa
B7 KM246342 北京海淀 Haidian，Beijing 2013 －06 毛白杨 P． tomentosa
B10 KM246345 北京海淀 Haidian，Beijing 2013 －07 毛白杨 P． tomentosa
B11 KM246346 北京海淀 Haidian，Beijing 2013 －07 毛白杨 P． tomentosa
H1 KM246327 北京海淀 Haidian，Beijing 2013 －08 欧洲黑杨 P． nigra
B3 KM246329 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －06 毛白杨 P． tomentosa
B4 KM246330 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －06 毛白杨 P． tomentosa
B5 KM246334 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －09 毛白杨 P． tomentosa
B6 KM246341 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －06 毛白杨 P． tomentosa
B8 KM246343 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －06 毛白杨 P． tomentosa
B9 KM246344 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －07 毛白杨 P． tomentosa
B12 KM246332 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －09 毛白杨 P． tomentosa
B13 KM246337 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －09 毛白杨 P． tomentosa
B14 KM246338 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －09 毛白杨 P． tomentosa
B15 KM246339 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －09 毛白杨 P． tomentosa
H3 KM246331 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －09 107 杨 P． euramericana cv． 74 /76
H5 KM246333 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －09 107 杨 P． euramericana cv． 74 /76
H6 KM246335 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －09 107 杨 P． euramericana cv． 74 /76
H7 KM246336 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －09 107 杨 P． euramericana cv． 74 /76
H11 KM246340 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －09 欧洲黑杨 P． nigra
H12 KM246347 河北任丘 Ｒenqiu，Hebei 2013 －09 欧洲黑杨 P． nigra
H2(cfcc5477) KM246328 中国林业微生物菌种保藏中心 China Forestry Culture Collection Center 2013 －06 黑杨 P． nigra
M1(cfcc84184) KP099198 中国林业微生物菌种保藏中心 China Forestry Culture Collection Center 2013 －06 苹果 Malus pumila
M2(cfcc6814) KP099199 中国林业微生物菌种保藏中心 China Forestry Culture Collection Center 2013 －06 月季 Ｒosa chinensis
表 2 GenBank 下载盘二孢属真菌 ITS 序列信息
Tab． 2 The ITS datea of Marssonina spp． from GenBank
种名 Organism 数量 Number GenBank 登录号 GenBank No．
杨生褐盘二孢菌
Marssonina brunnea
24
JN172909. 1，KM246325，KM246326，KM246327，KM246328，KM246329，KM246330，KM246331，
KM246332，KM246333，KM246334，KM246335，KM246336，KM246337，KM246338，KM246339，
KM246340，KM246341，KM246343，KM246343，KM246344，KM246345，KM246346，KM246347
盘二孢属 Marssonina sp． 4 AB494960. 1，AB494961. 1，AB494962. 1，AB494963. 1
蔷薇盘二孢菌 Marssonina
rosae(M2)
7 AY904059. 1，FJ493242. 1，FJ493247. 1，FJ493248. 1，FJ493248. 1，HM235978. 1，KP099199
苹果盘二孢菌
Marssonina coronariae(M1)
14
EU329732. 1， EU329733. 1， EU329734. 1， EU329735. 1， FJ606798. 1， FJ606799. 1， FJ606800. 1，
FJ606801. 1， FJ606802. 1， GQ456166. 1， HM368520. 1， HM368521. 1， JN587493. 1，
JN587494. 1，KP099198
1. 5 统计方法
试验中孢子形态观察的相关统计数据处理均使
用统计软件 SPSS(17. 0)，采用单样本 T 检验差异显
著性(P ＜ 0. 05)。
2 结果与分析
2. 1 专化型菌株的形态基础
从毛白杨上分离得到白杨专化型 15 株，欧洲黑
36
林 业 科 学 51 卷
杨和 107 杨上分离得到专化型 8 株(表 1)。2 种专
化型在 PDA 培养基上培养时显示: 初期 2 种专化
型菌株均为白色，2 周后黑杨专化性菌株菌丝颜色
逐渐加深，变为灰色直至黑色，其分生孢子为灰色，
单孢形成菌落在第 9 天产生新的孢子; 白杨专化型
菌落颜色逐渐变为褐色最后变为黑色，其分生孢子
堆为深褐色晶体状，单胞形成的菌落在培养第 7 天
观察到新产生的孢子; 黑杨专化型菌株和白杨专化
型菌株相同专化型之间孢子形态上没有显著差异，
黑杨专化型孢子大小平均为(14. 59 ± 0. 76) μm ×
(6. 94 ± 0. 3 ) μm，白杨专化型孢子大小平均为
(20. 23 ± 0. 86) μm × (7. 25 ± 0. 43 )μm; 孢子在无
菌水中萌发时绝大多数为 1 个芽管，在无菌水中
24 h孢子的萌发率，黑杨专化型为 38% ± 1. 5%，白
杨专化型为 22% ± 5. 8%。但是，当接种到对应寄
主品种上发病后，从叶组织上直接挑取的分生孢子
在无菌水中萌发时显示: 黑杨专化型有 2 ～ 3 个芽
管，24 h 孢子萌发率为 66. 7% ± 6. 8%，多个芽管的
萌发率为 23% ± 5. 5%，而白杨专化型只有 1 个芽
管，在无菌水中 24 h 的萌发率为 96. 1% ± 0. 6% ;
黑杨专化型孢子大小平均为(16. 53 ± 0. 8) μm ×
(7. 4 ± 0. 38 ) μm，白杨专化型孢子大小平均为
(15. 22 ± 0. 41) μm × (5. 74 ± 0. 26) μm。此时孢
子大小形态变得比较规整，而在培养基上培养的孢
子形态差异较大(图 1)。
图 1 杨生褐盘二孢菌菌株及孢子在 PDA 培养基上和寄主叶片上的形态
Fig． 1 The morphology of Marssonina brunnea on PDA and host leaf
a. 培养基上黑杨专化型菌株 Aigeiros biotype strains on PDA; b. 黑杨专化型菌株培养基上洗下的孢子 Spores washed from
aigeiros biotype on PDA; c. 接种后黑杨派叶片上的病斑 Symptoms of infected aigeiros leaf; d. 接种后黑杨派叶片上挑取的孢子
Spores from infected aigeiros leaf; e. 培养基上白杨专化型菌株 Leuce biotypes strain on PDA; f. 白杨专化型菌株培养基上洗下
的孢子 Spores washed from leuce biotype on PDA; g. 接种后白杨派叶片上的病斑 Symptoms of infected leuce leaf; h. 接种白杨
派叶片上挑取的孢子 Spores from infected leuce leaf． Sp:孢子 Spore;Tu:芽管 Tube;Ac:分生孢子堆 Acervulus．
2. 2 ITS 系统发育树分析
利用盘二孢属菌株的 ITS 序列构建系统发育
树，以其同科的菌株 Pezicula eucrita(CBS662. 6) 作
为系统发育树的外群，基于 ML，BI，MP 分别构建系
统发育树(图 2)，其中最小自举值 58 在 ML 树上。
系统发育树共有 4 个分支，其中 1，2 分别是盘二孢
属的苹果盘二孢菌和蔷薇盘二孢菌的发育树分支，
3，4 表示试验所分离出的杨生褐盘二孢菌菌株的发
育树分支。林业微生物菌库获取的菌株 H2，M1，M2
分别在其对应的分支内。这 3 种系统发育树的拓扑
结构在 4 分支上存在差异，菌株 H2 与 JN172909. 1
均来自黑杨，但是在 3 种系统发育树中它们却独立
分支，且在 MP 树和 Br 树中这两条序列归类到黑杨
专化型类群中，但在 ML 树它们却被归类到白杨专
化型类群中(图 2)。
2. 3 ITS2 二级结构分析
经过在 The ITS2 database 网页上的处理，获得
杨生褐盘二孢菌株的 ITS2 二级结构的预测。杨生
褐盘二孢菌及盘二孢属菌株 ITS2 二级结构均包含
4 个螺旋结构; 螺旋Ⅲ的 5 － 顶部有保守基元
(motif)，第 2 个螺旋包含嘧啶错配(U-Umismatch)。
其中，杨生褐盘二孢菌 ITS2 二级结构包含 152 个碱
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第 11 期 孙晓明等: 基于杨生褐盘二孢菌 2 个专化型的 ITS2 二级结构特征分析
基，保守基元位于第 85—99 个碱基之间，错配位于
第 22—36 个碱基与第 53—67 个碱基之间 (图 3)。
其二级结构预测模型中，相同专化型菌株之间的
ITS2 二级结构模型完全相同。以白杨专化型(B)为
本底，比较其与黑杨专化型(H)、M2 和 M1 二级结
构的碱基差异如表 3 所示，2 专化型在螺旋Ⅲ上有
1 个CBC 和 1 个 hemi-CBC。同属的 ITS2 的二级结
构预测模型上，M2 与 B 比较，有 6 个 CBCs 和 2 个
hemi-CBCs，M1 与 B 相比，有 6 个 CBCs 和 1 个
hemi-CBC。
图 2 基于 rＲNA-ITS 基因序列构建的盘二孢属系统发育树
Fig． 2 Marssonina spp． phylogenetic tree based on rＲNA-ITS gene sequences data
节点上的数字分别对应 ML / BI / MP 树和它们自举值(1 000 次重复) Numbers at node are bootstrap
values (1 000 replicates) from ML /BI /MP method，respectively．
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林 业 科 学 51 卷
图 3 杨生褐盘二孢 2 专化型 ITS2 序列及二级结构模型
Fig． 3 ITS2 sequences and secondary structure model of M． brunnea two forma specialis strains
H. 黑杨专化型菌株 Aigeiros biotypes strain;B 白杨专化型菌株 Leuce biotypes strain;CK:GenBank No．为 JN172909. 1
的参考序列 Sequence of JN172909;M1. 苹果盘二孢菌株 M． coronariae strain;M2. 蔷薇盘二孢菌株 M． rosae strain．
表 3 盘二孢属 ITS2 二级结构数据
Tab． 3 ITS2 secondary structure data of Marssonina sp．
GenBank 登录号
GenBank No．
菌种编号
No． of strains
CBCs 和 hemi-CBCs 数目
Number of CBCs and hemi-CBCs
变异碱基位点 Base changes site①
Helix Ⅰ Helix Ⅱ Helix Ⅲ Helix Ⅳ
KM246325 B 2 ACUC GCAC 97U* ，75 /76 /114-U /C /G 144 － 146-CUC
KM246336 H 2 UCUC GCGU 97U，75 /76 /114-C /U /A 144 － 146-UUU
JN172909. 1 CK 2 UCUC GCGU 97C，75 /76 /114-C /U /A 144 － 146-CUU
KP099198 M1 8 CCUU GCAC — —
KP099199 M2 7 CCUG GCUC — —
①数字为碱基的位序 Number means site No． of base．
3 结论与讨论
杨树黑斑病是杨属植物叶部的专性病害，利用
其在培养条件下的孢子形态并不能很好地区分 2 个
专化型菌株。应用 ITS 序列在真菌的种间及属间的
鉴定和分子检测上已经取得了显著的成果。Zhu 等
(2012)利用序列 JN172909. 1 和相近属种的 ITS 序
列构建系统 NJ 树，证明苹果盘二孢菌、蔷薇盘二孢
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第 11 期 孙晓明等: 基于杨生褐盘二孢菌 2 个专化型的 ITS2 二级结构特征分析
菌和杨生褐盘二孢菌属于相邻近的 3 个姐妹群。本
文也利用 3 种系统发育树说明这 3 个种的种间关
系，但是系统发育树未能很好地反映不同的专化型
分支菌株，H2 序列与参考菌株 JN172909. 1 序列在
3 种系统发育树分支上存在差异，这 2 个菌株与现
有的试验菌株来源和分离时间均不相同，仅仅依靠
ITS 序列的基本核苷酸信息，不能将二者定位到 2
个专化型中。
ITS 转录间隔区 ITS2 序列的二级结构包含更加
丰富的信息，可以为种内专化型鉴定提供依据。
ITS2 二级结构在 rＲNA 加工成熟过程中，经历 2 类
模型即螺旋模型( helices model)和指环模型( ring
model)(CT et al．，2002)。Schultz 等(2005)认为
ITS2 二级结构的核心结构具有以下特征:1)4 个螺
旋;2)螺旋Ⅲ最长;3)螺旋Ⅲ的 5 － 顶部有保守的
“UGGU”基元 (motif)或其相似的基元“UGGGU”，
“GGU”以及“UGG”; 4)第 2 个螺旋包含嘧啶错配
(U-Umismatch)。这些保守核心结构在真核生物上
通用并用来比较相近种的关系。Coleman 等(2007)
认为 ITS2 二级结构中螺旋Ⅱ和螺旋Ⅲ对 rＲNA 基
因的加工至关重要。其中，在螺旋Ⅲ上，CBCs 指发
生在配对结构位置的碱基均发生改变，改变后的碱
基保留配对，CBCS 经常用来分析密切相关物种的
区别;与 CBCs 相对应的是 hemi-CBCs，指配对碱基
中的一个碱基发生改变，且仍然维持配对 (Ｒuhl et
al．，2010)。一般 2 个 ITS2 二级结构比较时，如存在
1 个以上 CBCs，表明有很大可能来自 2 个物种
(Koetschan et al．，2010)。本研究通过比较盘二孢
属菌株的 ITS2 二级结构发现: 杨生褐盘二孢菌白
杨专化型的 ITS2 二级结构中，螺旋Ⅰ上第 17 位碱
基为 A，螺旋Ⅱ上第 43 和 44 位碱基分别为 A，C，螺
旋Ⅲ上 CBC 位点的配对碱基是第 76 位的 C 和第
114 位的 G，hemi-CBC 位点上则是第 75 位碱基 U;
黑杨专化型的 ITS2 二级结构中，螺旋Ⅰ上第 17 位
碱基为 U，螺旋Ⅱ上第 43 和 44 位碱基分别为 G，U，
螺旋Ⅲ上 CBC 位点上配对碱基分别是第 76 和 114
位的 U 和 A，hemi-CBC 位点上是第 75 位碱基 C，这
些结构上存在的碱基变异是区分杨生褐盘二孢菌 2
个专化型的主要依据。对杨生褐盘二孢 2 个专化型
菌株及其他来源的参考菌株 ITS2 二级结构进行比
较发现，在保守基元和错配区内也存在碱基位点的
变化，其中 2 个参考序列与白杨专化型(B)在螺旋
Ⅰ和螺旋Ⅱ上的碱基差异位点以及在螺旋Ⅲ上存在
的 1 个 CBC 和 1 个 hemi-CBC，这些特征与黑杨专化
型(H)相同，说明这 2 个参考菌株属于黑杨专化型。
参考序列与黑杨专化型(H)结构上的保守基元和螺
旋Ⅳ上存在相同碱基位点差异，由此可以推测在
ITS2 二级结构上保守基元和螺旋Ⅳ表现出一定的
系统进化关系。杨生褐盘二孢菌的 ITS2 二级模型
与蔷薇盘二孢菌、苹果盘二孢菌的碱基数目和 CBCs
均有较大差异。通过 ITS2 二级结构分析发现: 白
杨专化型和黑杨专化型在结构上存在固定位点的碱
基差异，这些差异是准确区分 2 个专化型的直接
依据。
虽然 ITS2 二级结构能区分开杨生褐盘二孢菌
的 2 个专化型，但是对于决定专化型的因素即控制
不同芽管数量的因素或基因，现在还不明确，ITS2
二级结构与控制因素或基因的联系也不清楚，需要
进一步研究。
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(责任编辑 朱乾坤)
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