全 文 ：第 3 卷 第4 期
1 9 9 0 年 8 月
林业 科 学研 究
FO R E S T R ES EA R CH
V o l
.
3
,
N o
。
4
A u g
. , 1 9 9 0
四种限制性内切酶对美国白蛾核型
多角体病毒D NA酶解分析关
韩一侬 杨 玲 于在林
(中国林业 科学研究院林业研究 所)
摘要 从H c NPV 中直接分离提纯的D N A 证明具有典型的紫外吸收光谱 。 经琼
脂糖 电泳后 呈一条带谱。 用限制性内切酶 五池。R 工、 Ps t l 、 B gl 丑、 PV U 丑酶解 ,
经琼脂糖平板 电泳分别产生19 、 2 、 18 、 2 条核酸片段 。 以 入D N A 一Ec oR 工和 入D N A -
H ind 皿片段作参考 , 计算出各片段 分子量 大小 , 积加得平均值为94 . 04 4 s x 10气
关健词 美国白峨 ; 核型多角体病毒; 限制性 内切 酶
美国白蛾(H如han tri 。 ‘如ea D r u ry) 属鳞翅目灯蛾科 , 是一种重要的世界性检疫害虫 。
从19 7 9年起 , 该虫先后在我国的辽宁省东部、 山东半岛和陕西省被发现 , 对树木的危害极大 。
何介田等利用病虫体上分离到的核型多角体病毒 (H eN PV ) 来防治幼虫效果明显山 。 但
有关H c N PV- D N A 的生化特性和酶切图谱 , 迄今未见报道。 为此 , 对 H c N Pv- D N A 进行了
分离和提纯 , 并用四种限制性内切酶进行酶解分析 。 现将结果报道如下 。
一 、 材料和方法
(一) 多角体的提纯
主要按于在林等文献 Iz] 中所述方法进行 。
(二) H cN p v- D N A 的分离纯化
提纯 的多角体用 0 . 5 M N a 0 H 碱解 , 碱解后 , 用0 。 S N H CI调至 pH s~ 9 , 加 Pr o刀a se
K 至2 0 卜g / m l, 3 7 ℃保温 3 h , 加10 % SD S 至终浓度为 i % , 6 5 ℃水浴 s m 址 , 冷却至室
温 。加等体积0 . 1 M T 一E 配制的饱和酚 , 轻轻摇动脱蛋白 15 m in , 1。。。0 r p m 5 m in , 吸取
上层清液 , 用饱和酚反复脱蛋白 , 离心 , 直至无蛋白层为止 。 上层清液再用氯仿 : 酚(1 : 1) 拍
取一次 , 氯仿 : 正丁醇(3 : D 抽取 1 ~ 2 次 。 吸取上层清液后 , 加 3 M Na A e 调至终浓度 0 . 5
M
, 混匀 , 加入 2 倍体积的预冷无水乙醇, 轻轻混匀 , 冰盒中过夜 。 1 4 0。。rP m 5 m in , 月
70 %预冷无水乙醇漂洗一次 , 离 心 , 沉 淀溶于0 . 02 M T . E中 , 置 4 ℃保存备用 。
(三) D N A 的热熔曲线及增色效应
主要按于在林等文献 [s1 中所述方法进行。
本文于1 9 88年 1 月 2 日收到。
今 武汉大学病毒学 与分子生物学 系1 9 8 8年毕业生杨书礼 、 钟海波于1 9 8 8年 3 ~ 6 月在本所生化实 验室实 习 , 并参与部
分工作。
感4云 林 业 科 学 研 究 3 卷
(四 ) D N A 的酶解反应
供试限制性内切酶 Ec o R 工 ,
试剂厂 。
酶解系统 : E e o R 工: T r is 一 l‘C I
P s t l , T r is
一
H C I
7
.
5
.
PV U I
:
T r is
一
I压C I
Ps t 工、 B g ln 、 PV U 兀均购自中国科学院生物物理所生化
1 0 0 m M
一 N a C I 5 0 m M , M g CI : i o m M , Pl玉7 . 5 。
1 0 m M , N a C I 1 0 0 m M
,
M g C I
: 1 0 m M , 牛血清 自蛋 白1 00 “g / m l, p H
6 m M , N a C I 6 o m M , M g C I: 6 m M , 2
一琉基 乙醇 7 m M , T r ito n X -
1 0 0 0
.
0 1 % (V / V )
, PH 7 一
B g l l
: 甘氮故一N a O H 2 0 m M , M慈C I: 1 0 m M , 2 一琉基乙博 7 m M , p H 0 . 5
D NA i “g 用酶量为 2 ~ 1 0单位 , 以 入D N A 为标准 D N A 。
D N A 的酶解反应 : 酶解反应系统总体积 30 司, 37 ℃反应 3 h , 加终止液 (5 O % 甘油、
0
.
1 M E D T A
一
N a
、
0
.
5 %澳酚蓝 ) 2 协l, 6 5 ℃水浴 5 m in , 立即置冰浴中 , 备电泳用 。
(五 ) 琼脂精电泳
用缓冲液配制 1 %琼脂糖凝胶 , 进行平板电泳 。 缓冲液为 89 m M T ri s , 89 m M硼酸 ,
25 m M E D T A
一
N a
,
p H S
.
3
。 样品 中加澳酚蓝指示剂 。 泳动电压为50 V , 室温下电泳 5 ~
6 h
。 电泳结束后用。. 5 “g / m l的澳化乙锭 (E tB r) 染色 30 m in , 紫外分析仪下观察 , 加红
色滤光片照相 。
用H in d l 及 E coR 工酶解 入D N A 的片 段作为分子量标准 , 根据各片段的分子量对数和
迁移率成反比的关系 , 绘制成标准曲线 , 以此测定各酶解片段的分子量 。
二 、 结果与讨论
(一) 多角体的提纯
提纯的多角体经扫描电镜观察 , 都比较均一 , 表明提取的纯度是满意的(图 1 ) 。
(二) H cN P v 一D N A 的分离纯化
实验表明 , 分离纯化后 的 工Ic N PV 一D N A 具有典型的紫外吸收曲线(图 2 )。 1 %琼脂糖凝
胶平板电泳后 , 用紫外分析仪观察 , 呈一条带。
吕 0 · 4
‘一兹厂茄犷扁爪杯代茄六
图 1 提纯的多角体 图 2 1王c N PV 一 D N A 的紫外 吸收光谱
(三) D N A 的热熔曲线及增色效应
H c N P砰D N A 溶于。. 1 x SSC中 , 测定其热熔曲线 (图3) 。 D N A 的T 二值为 7 8 . 6 ℃ , 根据Ma :
nd l
e等的公式: (G + C) % 二 (T 二 一 5 3 . 9 ) x 24 4 ,计算得He N P不D N A的(G + C )含量为 6 1% 。
4 期 韩一侬等 : 四种限制性内切酶对美国白蛾核型多角体病毒D N A酶解分析 3 4 3
/ 厂
(四 ) H cN P V- D N A 的醉解反应
H c N P V- D NA 的酶解物经 1 %琼脂糖平板 电泳
后 , 观察到这几种酶分别切割 D N A 分子为19 、 2 2 、
1 8 、 2 2个D NAI 片段 。 用 入D N A 的 E e o R I 、 H ind 皿
‘,O.0州x芝
、‘一 ,
7 0 8 0
;爪l之〔℃ )
9 0 1 0 乃
图 3 H c N P V 一D N A 在O . l x S SC中的热变性曲线
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图 4
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5
O冈A 迁移距离(c。 )
测定D N A 分子量工作曲线
酶解片段为标准分子量 , 用其对数值和相应各片段电泳迁移距离作图 (图 4 ) , 得一工作曲线 ,
再量取同一电泳条件下 H c N P从D N A 酶解后各片段电泳距离 , 从工作曲线纵轴上求出 各片
段分子量 。 四组 D N A 片段分子量分 别 为 E e o R 1 9 4 . 6 1 7 x 2 0 6 、 Ps t x 9 2 . 2 3 6 X lo 6 、 P V U
亚 9 4 . so7 x i o s 、 B g l亚9 4 . sls x zo . , 其平均值为9 4 . 0 4 4 x i o 8 , 具体见图 5 及表 1 。
￡ D C B 裹 1 H e NPV
一
D NA经四种醉切后
得各片段分子母 (又 1 0已)
片段号 E e o R I P s t l ⋯Pv U ,
}
B g ll
1 0
.
2 3 3
1 0
.
0 0 0
9
.
5 50
8
.
31 8
8
.
1 2 8
7
.
9 4 3
7
.
7 09
6
.
4 56
5
.
1 2 9
4
.
5 7 0
3
.
9 8 1
3 2 3 6
2
.
8 1 8
1
.
9 50
1
.
4 7 9
1
.
1 7 5
0
.
9 7 7
0
.
87 1
0
.
7 2 4
8
.
3 1 8
7
.
9 43
7
.
0 79
6
‘
6 07
6 4 56
6 3 1 0
6
.
16 6
6
.
0 26
5
.
2 48
4
.
7 86
4
.
0 73
3
.
9 8 1
3 3 8 8
3 2 36
2
、
88 4
2
.
4 00
1
‘
9 9 5
1
.
3 1 8
1
.
2 02
1
.
09 6
1
.
0 0 0
0
。
7 2 4
8
.
1 2 8
7
。
9 43
7
.
4 1 3
6
.
6 0 7
6
.
3 1 0
6
.
1 6 6
5
.
8 88
5
.
6 2 3
5
.
0 1 2
4
.
7 8G
4 3 6 5
3
.
9 8 1
3 8 0 2
3
.
6 3 1
3
.
2 36
2
.
5 12
2
.
2 39
1
.
9 0 5
1
.
6 2 2
1
.
5 8 5
1
.
2 5 9
0
.
7 9 4
1 0
.
2 3 3
1 0
.
0 0 0
9
.
55 0
8
.
3 1 8
7
.
9 4 3
7
.
C7 9
6 3 1 0
5
,
2 48
5
.
01 2
4
.
46 7
3
.
9 8 1
3
.
5 4 8
3
.
1 6 2
2
.
5 7 0
2
.
4 00
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.
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原图谱 示意图
1一
图 5 H c N PV 一 D N A 限制性内切酶酶切 图谱
A : 标准 D N A 林 D N A )经E e o R I 、 H in d l 酶解图 谱
B : H e N P V
一
D N 八经E e o R I作用后 呈1。条带
C : H e N P V
一
D N A 经P s t l 作用后呈 2 2条带
D : H eN P V
一
D N A 经 B g ll 作用后呈1 5条带
E . H eN P V
一
D N A 经P V U I 作用后呈2 2 条带 总分子盈 } “4
·”17
平均值
{
9 2
.
2 3 6 匀4 . 8 0 7 9 4 。 5 1 8
9 4
.
0 44 5
344 林 业 科 学 研 究 3 卷
从美国白蛾N Pv- D N A 的分子量来看 , 与多数核型多角体杆状病毒 D N A 比较 , 属较高
的一类 , 而且由这些酶切电泳图谱可以看出该病毒基因组是相当复杂的。
利用对N P V 一D N A 酶切片段的积加可以估算N PV 一D N A 的分子量 。 此方法简便 、 快速 ,
接近于该D N A 的自然分子量 。 此外 , 以 入D N A 的 E co R I 和 H ind l 的酶切片段为分子量标
准所绘制的工作曲线呈直线, 且酶解后的样品 D N A 片段在工作曲线上查得的相应的分子量
值均在直线范围内 , 3 次重复试验结果基本一致 , 故其测定结果是可靠的。
核酸是遗传信息的携带者 , 并参与这些信息在细胞内的表达 , 从而促进代谢过程及其控
制 。 利用限制性内切酶作用点的碱基特异性 , 酶解 D N A 就可得到具有一定序列的片段。 不
同的 D N A 经 同一内切酶作用产生的酶解片段的数目和大小都不相同。 利用限制性内切酶酶
解图谱可以研究杆状病毒的同源性 。 本项研究首次采用 4 种限制性内切酶对美国 白蛾 N PV -
D N A 进行酶解分析 , 得到了特征性的单酶解谱型 , 为今后进一步在分子、 亚分子水平上研
究该病毒D N A的结构与功能作了良好的开端 。
今 考 文 献
〔1 〕 何介田等 , 1 9 81 , 美国白蛾研 究初报 , 林 业科技通讯 , ( 5 》: 27 ~ 3 0.
〔2 〕 于在林等 , 1 9 8 7 , 杨尺筑核型多角体病毒的提纯及某些理化性质的分析 , 林业科学 , 2 3 ( 2 ) : 2 21 ~ 2 25 .
〔3 〕于在林等 , i , 3 6 , 杨尺峨核型多角体病毒的D N A特性 , 病毒学报 , 2 (弓 ) : 3 一峨~ 3 5 0 -
R E ST R !CT 10 N E NDO NUC LEASE ANALYSIS OF
H Y尸H A N T R IA C U N E A NPV
H a n Y in o n g Y a n g Lin g Y u Za ilin
(T h e R e se a r c h 1 0 5 一‘t o te o j F o r e str , C A F )
A bs tr . et V ira l D N A w a 3 iso la te d d ir e e tly fr o m the n uc lea r po lyhed r储is
v ir u s o f H 夕pha n tria c “刀e a 。 V ir al D N A sho w e d a s in g le 加nd o n the a郎r o日e
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,
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T he m o le e u la r w e ig h ts o f the fra g m e n ts a re d e te r m ine d w ith 入D N A 一Ec o R I
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, a n d u s in g th is m e tho d the m ea n
m o lec u la r w e ig ht o f H eN P胜D NA 15 ca le u la te d t o be abo u t 9 4 . 0 4 4 x 1 0 a da ltons .
K ey w o r d s H 夕Pha 九tr i口 c “”e a : n uc lea r Po lyh记ros is v irus : res tr ie t io n e n do -
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