全 文 ：第 51 卷 第 2 期
2 0 1 5 年 2 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 2
Feb．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150209
收稿日期: 2014 － 02 － 26; 修回日期: 2014 － 04 － 22。
基金项目: 国家高技术研究发展计划 (863 计划)课题 (2011AA100201 ) ; 林木遗传育种国家重点实验室基本科研业务费专项资金
(TGB20130092014)。
* 胡建军为通讯作者。
杨树新品种的 SSＲ指纹图谱构建和倍性检测*
贾会霞1，2 姬慧娟1 胡建军1 卢孟柱1，2
(1．林木遗传育种国家重点实验室 国家林业局林木培育重点实验室 中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091;
2．南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室 南京 210037)
摘 要: 【目的】对 24 份杨树种质进行指纹图谱构建、系谱关系鉴定和遗传多样性分析，并进行倍性检测，
为杨树新品种鉴定和知识产权保护提供科学的理论依据，同时为杨树的育种工作奠定坚实的基础。【方法】
利用 TP-M13-SSＲ 技术对 24 份杨树种质进行指纹图谱构建和系谱关系鉴定。从杨树 SSＲ 数据库中选取 200
对 SSＲ 引物，利用遗传背景差异大的 4 份杨树种质进行引物筛选，选出 19 对扩增条带清晰、具有多态性且重
复性好的引物对 24 份杨树种质进行扩增，利用 GeXP 毛细管电泳对 PCＲ 荧光产物进行检测，采用非加权组
平均法 ( UPGMA)进行聚类分析，利用流式细胞术( FCM )进行倍性检测。【结果】19 对 SSＲ 引物共扩增出
102 条条带，多态性条带 97 条，占 95 ． 10% ，每个位点的等位基因数为 2 ～ 11 个，平均每对引物为 5 ． 37 个。
19 对 SSＲ 引物均未检测到中林 2025 杨、中红杨和全红杨的条带差异，这 3 份种质相对于其他 21 份种质有特
异的共同指纹条带 ;3 对高效引物 OＲPM_103，OＲPM_180 和 GCPM_1255 可以将剩余 21 份杨树种质完全区
分开。SSＲ 标记构建的指纹图谱与其系谱关系基本一致。对 24 份种质进行聚类分析，相似系数在 0. 50 ～
1. 00 之间。当相似系数为 0 ． 56 时，可分为 5 大类 :第 1 类包括 50 号杨、中怀 1 号、中怀 2 号、I-69、帝国杨、中
林 2025 杨、中红杨和全红杨;第 2 类包括青杨、森海 1 号和森海 2 号 ;第 3 类包括 36 号杨、丹红杨、南杨、
239、1-116、中成 1 号、中成 2 号、中成 3 号、中成 4 号和中豫 1 号 ;第 4 类包括北抗杨和创新杨;第 5 类只有中
林 46 杨。SSＲ 检测发现中怀 1 号、森海 1 号、森海 2 号、青杨和中林 46 杨扩增出 3 个不同等位基因位点，其
余 19 份杨树种质只出现 1 个或 2 个等位基因位点 ;FCM 检测结果证实这 5 份种质均为三倍体，与 SSＲ 检测
结果一致。【结论】本研究对 24 份杨树种质进行指纹图谱构建、遗传多样性分析和倍性测试，证实用 SSＲ
标记可有效地检测亲本与子代之间的系谱关系，并准确地反映植物的倍性。筛选出 3 对快速鉴别其中 21
份杨树种质的 SSＲ 引物，发现 5 个杨树种质为三倍体。本研究结果可为杨树新品种鉴定和知识产权保护
提供理论依据。
关键词: 杨树; TP-M13-SSＲ; 指纹图谱; 系谱分析; 倍性检测
中图分类号: S718. 46; S718. 49 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)02 － 0069 － 11
Fingerprints of SSＲ Markers and Ploidy Detection for New Populus Varieties
Jia Huixia1，2 Ji Huijuan1 Hu Jianjun1 Lu Mengzhu1，2
(1 ． State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration
Ｒesearch Institute of Forestry，CAF Beijing 100091; 2 ． Key Laboratory of Forest Genetics ＆ Biotechnology of Ministry of Education
Nanjing Forestry University Nanjing 210037)
Abstract: 【Objective】Genus Populus，with many species and a long history of cultivation and utilization，is widely
used for afforestation，shelterbelt and timber production． In recent decades，with rapid progress in Populus breeding in
China，a large number of new varieties with fast growth and superior characteristics have been developed． However，the
genetic basis of these new varieties were narrow and genetic differences among parental trees for hybridization was small，
and morphological differences among Populus varieties is becoming increasingly smaller，leading to difficulties in variety
identification and protection of plant breeders’ rights ( PBＲ) ． How to distinguish accurately and quickly new Populus
varieties has become the top priority． This study was aimed to construct fingerprints，identify pedigree relationships，
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analyze genetic diversity and detect ploidy of 24 accessions of Populus germplasms． 【Method】Fingerprint construction and
pedigree relationships of 24 accessions of Populus germplasms were analyzed using TP-M13-SSＲ ( simple sequence repeat
with tailed primer M13) ． 200 pairs of SSＲ primers were selected from Populus SSＲ database and screened by 4 accessions
of genetically distant Populus germplasms． 19 pairs of primers with clear amplification bands，high polymorphism and
stable repeatability were selected and used for PＲC amplification of the 24 accessions of germplasms． PCＲ products
labeled fluorescent were detected by using GeXP capillary electrophoresis． UPGMA ( unweighted pair group method
arithmetic averages) were used for clustering analysis． FCM ( flow cytometry) was used to detect the ploidy． 【Ｒesult】102
fragments were generated from 19 pairs of SSＲ primers，including 97 polymorphic fragments，accounting for 95． 10% of
the total． The number of alleles at each locus was between 2 and 11，with an average of 5． 37 alleles for each pair of
primers． No differences were detected among varieties P． deltoides‘2025’，‘Zhonghong’and‘Quanhong’by the 19
pairs of SSＲ primers． These 3 accessions of Populus germplasms had a unique fingerprint pattern relative to other 21
accessions of germplasms． The rest 21 accessions of Populus germplasms could be completely distinguished by 3 efficient
pairs of SSＲ primers，OＲPM _103，OＲPM _180 and GCPM _1255． The fingerprints constructed by SSＲ markers were
basically in consistence with the pedigree relationships． Cluster analysis by NTSYS-pc 2． 10e software showed that the
similarity coefficient ranged from 0． 50 to 1． 00． When the similarity coefficient was 0． 56，24 accessions of Populus
germplasms were divided into five categories: the first category included P． deltoides ‘55 /56’，‘Zhonghuai 1’，
‘Zhonghuai 2’， I-69，‘Imperial’，‘2025’，‘Zhonghong’ and ‘Quanhong’; the second category included P．
cathayana，‘Senhai 1’ and ‘Senhai 2’; the third category included ‘2KEN8’，‘Danhong’，‘Nan’，‘239’，
‘1-116’，‘Zhongcheng 1’，‘Zhongcheng 2’，‘Zhongcheng 3’，‘Zhongcheng 4’and‘Zhongyu 1’; the fourth category
included‘Beikang’and‘Chuangxin’; the fifth category included‘Zhonglin 46’． Loci with 3 different alleles were
amplified in‘Zhonghuai 1’，‘Senhai 1’，‘Senhai 2’，P． cathayana and‘Zhonglin 46’，while loci with only 1 or 2
alleles were amplified in the rest 19 accessions of Populus germplasms． The result of FCM confirmed that these 5
accessions of germplasms were triploid， consistent with the result of SSＲ detection． 【Conclusion】 In this study，
fingerprint construction，genetic diversity and FCM analysis were carried out for 24 accessions of Populus germplasms．
SSＲ markers could effectively detect pedigree relationships between parents and offspring，and accurately reflect the ploidy
of plants． 3 pairs of SSＲ primers were found to be able to identify 21 accessions of Populus germplasms． 5 accessions of
Populus germplasms were found triploid． The results provided a theoretical basis for variety identification and protection of
plant breeder’s rights for Populus．
Key words: Populus; TP-M13-SSＲ; fingerprint; pedigree analysis; ploidy detection
杨树 ( Populus)物种丰富，栽培和利用历史悠
久，是重要的绿化和防护树种，也是重要的能源、纸
浆、胶合板等用材树种(胡建军等，2010)。近几十
年来，我国的杨树育种工作发展迅速，培育出大量速
生优良新品种;但是，由于杨树的生物学特性易受生
长发育周期的限制和外界环境的干扰，且新品种遗
传基础狭窄，品种之间形态学差异越来越小，给杨树
新品种的鉴定和知识产权保护增加了困难。所以，
如何对杨树新品种进行准确、快速的区分已成为当
务之急。此外，在杨树杂交育种过程中，通常采用套
袋隔离授粉，子代系谱关系比较清楚，但不排除杂交
繁育过程中由于授粉组合多、育种工作量大使操作
人员出现失误造成花粉污染或者材料混淆的可能，
在申请和鉴定新品种时，建议提供新品种的亲本信
息，并鉴定其系谱关系，以便更准确地鉴别和保护新
品种。
随着分子生物学快速发展，DNA 指纹图谱作为
一种遗传种质分析的新方法，可以直接反映植物遗
传物质在 DNA 分子水平上的差异，具有高效、准确、
经济、便捷、不受季节和环境影响等优点(王忠华，
2006; Guichoux et al．，2011)，可有效解决杨树品种
鉴定中的困难。构建 DNA 指纹图谱的分子标记方
法有多种，其中简单重复序列 ( simple sequence
repeat，SSＲ)标记具有多态性高、重复性好、共显性、
多等位点基因变异等优点，为杨树新品种鉴定、系谱
分析和遗传多样性分析等提供了有利的工具
(Powell et al．，1996; 黄秦军等，2002; Guichoux et
al．，2011)。Dayanandan 等(1998)利用基因组文库
鉴定分离了美洲山杨(P． tremuloides)的 SSＲ 位点，
其中 4 个 SSＲ 位点在 36 个美洲山杨中共检测到 29
个等位基因，该研究是 SSＲ 标记在杨树中的首次利
用。2006 年，毛果杨(P． trichocarpa)全基因组测序
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第 2 期 贾会霞等: 杨树新品种的 SSＲ 指纹图谱构建和倍性检测
工作顺利完成，大量的杨树 SSＲ 引物信息公布于国
际杨树基因组委员会的官方网站上，解决了 SSＲ 标
记的关键技术。随后，SSＲ 标记在杨树的品种鉴定、
杂交子代鉴定、指纹图谱构建和遗传多样性分析等
方面得到了广泛应用 (王辉等，2008; 卫尊征等，
2008; 张亚东等，2009; 刘春英等，2013); 冯锦霞
等(2011)利用 SSＲ 标记鉴定杨树转基因与非转基
因无性系的 SSＲ 位点差异，证实 SSＲ 标记也可用于
鉴别基因工程手段获得的品种差异。TP-M13-SSＲ
( simple sequence repeat with tailed primer M13)毛细
管电泳自动检测法是基于自动荧光测序技术的 SSＲ
检测体系(Schuelke，2000)，该技术只需 1 条荧光标
记的 M13 通用引物，极大降低了检测成本，同时，相
比于常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术，毛细管
电泳自动检测具有操作简便、高通量、高分辨率和自
动统计数据等优点。
流式细胞仪( flow cytometry，FCM)是 20 世纪 70
年代发展起来的一种集光电测量技术、激光技术、计
算机技术和流体力学理论为一体的新型细胞检测技
术，可以快速测定细胞中的 DNA 含量并进行倍性分
析(Loureiro et al．，2005; Doleel et al．，2007)，近年
来，在中华猕猴桃 ( Actinidia chinensis) (朱道圩等，
2007)、杜 仲 ( Eucommia ulmoides ) ( 张 海 凤 等，
2008)、柑橘 ( Citrus ) ( Aleza et al．，2010 )、咖啡
(Coffea arabica) (Clarindo et al．，2012)等多种植物
中得到广泛的应用。
本研究采用 TP-M13-SSＲ 毛细管电泳自动检测
法对 24 份杨树种质进行指纹图谱构建和遗传多样
性分析，并利用 FCM 进行倍性检测，为杨树新品种
鉴定和知识产权保护提供科学的理论依据，同时为
杨树的育种工作奠定坚实的基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试的 24 份杨树种质(表 1)于 2012 年 7 月采
自中国林业科学研究院苗圃，每份种质均随机选取
2 个单株，取幼嫩的叶片放入自封袋中，用冰盒带回
实验室，于 － 80 ℃冰箱中备用。
1. 2 DNA 的提取
采用 CTAB 法(Allen et al．，2006)提取幼嫩叶
片中的 DNA，0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的完
整性，紫外分光光度计测定样品 DNA 的浓度和纯
度，将浓度稀释至 50 ng·μL － 1，置于 － 20 ℃冰箱中
备用。
1. 3 SSＲ 引物的筛选
从国际杨树基因组委员会官方网站( http:∥
web． ornl． gov / sci / ipgc / ssr _ resources． htm ) 的杨树
SSＲ 数据库中选取 200 对 SSＲ 引物，对遗传背景差
异大的 4 份杨树材料进行引物筛选，选出 19 对扩增
条带清晰、具有多态性且重复性好的引物对 24 份供
试材料进行 SSＲ-PCＲ 扩增。
1. 4 PCＲ 扩增和 GeXP 毛细管电泳检测
采用 TP-M13-SSＲ 毛细管电泳荧光检测法进行
PCＲ 扩增和产物检测。设计 3 条引物［分别为 5端
带 有 Cy5 荧 光 标 记 的 M13 引 物 ( 5-
TGTAAAACGACGGCCAGT-3)、5端接有 M13 序列
的 SSＲ 正向引物( F + M13 引物)和 SSＲ 反向引物
(Ｒ 引物)］进行 PCＲ 扩增。PCＲ 反应体系: 10 ×
PCＲ buffer 2 μL，dNTP 1. 6 μL，MgCl2 1. 2 μL，rTaq
0. 2 μL，F + M13 引物 0. 4 μL，Ｒ 引物和 M13 引物各
1. 6 μL，水 11. 4 μL，共 20 μL。PCＲ 反应程序为:
94 ℃ 5 min→(94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s)，
30 个循环→(94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s)，8
个循 环 → 72 ℃ 10 min → 4 ℃ 保 存。采 用
GenomeLabTM GeXP 遗传分析系统检测带有荧光标
记的 SSＲ 扩增产物，检测依照贾会霞等(2013)中的
毛细管电泳法进行。
1. 5 倍性测试
利用 FCM 对 24 份杨树种质进行倍性测试。取
供试种质刚展开的嫩叶用刀片在滴有裂解液的培养
皿中切碎，用 300 目尼龙网过滤，将滤液放入离心
机，1 500 r·min － 1离心 5 min，倒掉上清液，加入 200
μL 碘化丙啶( propidium iodide，PI)染液，置于 4 ℃
冰箱染色30 min，利用美国 BD 公司的流式细胞仪
FACSCalibur 进行倍性鉴定。
1. 6 数据分析
本研究进行了 2 次生物学重复和 2 次技术重
复，以确保试验的准确性和可靠性。GeXP 系统中
的 Fragments 分析软件可以自动处理收集的原始数
据，根据分子量内标得出片段大小。按 Nei 等
(1979 ) 方 法 计 算 品 种 间 的 相 似 系 数 ( genetic
similarity，GS)和遗传距离 ( genetic distance，GD):
GS = 2Nij /(Ni + Nj)，GD = 1 － GS; 式中: Ni和 Nj为
i 和 j 品种的谱带数，Nij为 i 和 j 品种共有的谱带数。
利用 NTSYS-pc 2. 10e 软 件对 各 供试 材料 采用
UPGMA ( unweighted pair group method arithmetic
averages)法进行聚类分析。
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林 业 科 学 51 卷
表 1 试验材料
Tab． 1 Experimental materials
编号 Code 品种 Variety 遗传背景 Genetic background
1 50 号杨 P． deltoides cl． ‘55 /56’♀ 国外引种无性系 Introduced from foreign
2 36 号杨 P． deltoides cl． ‘2KEN8’♂ 国外引种无性系 Introduced from foreign
3 丹红杨 P． deltoides cl． ‘Danhong’♀ 50 号杨 × 36 号杨 P． deltoides cl． ‘55 /56’ × P． deltoides cl． ‘2KEN8’
4 南杨 P． deltoides cl． ‘Nan’♂ 50 号杨 × 36 号杨 P． deltoides cl． ‘55 /56’ × P． deltoides cl． ‘2KEN8’
5 239 P． deltoides cl． ‘239’♀ 50 号杨 × 36 号杨 P． deltoides cl． ‘55 /56’ × P． deltoides cl． ‘2KEN8’
6 1-116 P． deltoides cl． ‘1-116’♀ 丹红杨 × 南杨 P． deltoides cl． ‘Danhong’ × P． deltoides cl． ‘Nan’
7 中成 1 号 P． deltoides cl． ‘Zhongcheng 1’♂ 丹红杨 × 南杨 P． deltoides cl． ‘Danhong’ × P． deltoides cl． ‘Nan’
8 中成 2 号 P． deltoides cl． ‘Zhongcheng 2’♀ 丹红杨 × 南杨 P． deltoides cl． ‘Danhong’ × P． deltoides cl． ‘Nan’
9 I-69 /55 P． deltoides cv． ‘Lux’♀ 国外引种无性系 Introduced from foreign
10 创新杨 P． deltoides cl． ‘Chuangxin’♂
南抗杨 1B 34-135 ( I-69 /55 × I-63 /51) ×帝国杨
P． deltoides cl．‘Nankang 1B 34-135’(P． deltoides cv．‘Lux’ × P． deltoides
cv． ‘Harvard’) × P． deltoides cv． ‘Imperial’
11 中豫 1 号 P． deltoides cl． ‘Zhongyu 1’♀ 丹红杨 × 创新杨 P． deltoides cl．‘Danhong’ × P． deltoides cl．‘Chuangxin’
12 中成 3 号 P． deltoides cl． ‘Zhongcheng 3’♂ 丹红杨 × 创新杨 P． deltoides cl．‘Danhong’ × P． deltoides cl．‘Chuangxin’
13 中成 4 号 P． deltoides cl． ‘Zhongcheng 4’♀ 丹红杨 × 创新杨 P． deltoides cl．‘Danhong’ × P． deltoides cl．‘Chuangxin’
14 北抗杨 P． deltoides cl． ‘Beikang’♂
南抗杨 1A 34-17 ( I-69 /55 × I-63 /51) × D175
P． deltoides cl． ‘Nankang 1A 34-17’(P． deltoides cv． ‘Lux’ × P． deltoides
cv． ‘Harvard’) × P． deltoides cl． ‘D175’
15 青杨 P． cathayana 我国乡土树种 Native tree species
16 森海
1 号
P． deltoides × P． cathayana cl． ‘Senhai 1’♂
50 号杨 × 青杨 P． deltoides cl． ‘55 /56’ × P． cathayana
17 森海
2 号
P． deltoides × P． cathayana cl． ‘Senhai 2’♂
50 号杨 × 青杨 P． deltoides cl． ‘55 /56’ × P． cathayana
18 帝国杨 P． deltoides cv． ‘Imperial’♂ 从美国引种的无性系 Introduced from America
19 中怀 1 号 P． deltoides cl． ‘Zhonghuai 1’♂ 50 号杨 × 帝国杨 P． deltoides cl． ‘55 /56’ × P． deltoides cv． ‘Imperial’
20 中怀 2 号 P． deltoides cl． ‘Zhonghuai 2’♂ 50 号杨 × 帝国杨 P． deltoides cl． ‘55 /56’ × P． deltoides cv． ‘Imperial’
21 中林 2025 杨 P． deltoides cl． ‘2025’♂
I-69 /55 × 美洲黑杨(意大利罗马农林研究中心提供)
P． deltoides cv． ‘Lux’ × P． deltoides ( provided by the Center of Agriculture
and Forestry Ｒesearch in Ｒome，Italy)
22 中红杨 P． deltoides cl． ‘Zhonghong’♂
中林 2025 杨的芽变品种
Variety from bud mutation of P． deltoides cl． ‘2025’
23 全红杨 P． deltoides cl． ‘Quanhong’♂ 中红杨进一步选育的品种 Improved variety from P． deltoides cl．‘Zhonghong’
24 中林 46 P． × euramericana cl． ‘Zhonglin 46’♀
以美洲黑杨为母本，钻天杨和俄罗斯杨混合花粉为父本杂交培育
Hybridization breeding by crossing P． deltoides as female parent and the mixed
pollen of P． nigra var． italica and P． russkii as male parent
2 结果与分析
2. 1 SSＲ 引物的多态性分析和指纹图谱构建
利用筛选出的 19 对 SSＲ 引物对 24 份杨树种质
的基因组 DNA 进行扩增，共检测到 102 个片段，其
中多态性片段 97 个，占 95. 10%，每个位点的等位
基因数为 2 ～ 11 个，平均每对引物为 5. 37 个。其中
引物 OＲPM_158，OＲPM_180 和 GCPM_1454 的等位
基因数最少(2 个)，引物 GCPM_1255 的等位基因数
最多(11 个)。19 对 SSＲ 引物的扩增信息见表 2，构
建的指纹图谱见表 3，图 1 是引物 OＲPM_247 在部
分(10 份)杨树种质中的扩增图谱。中林 2025 杨是
以 I-69 杨为母本、以意大利罗马农林研究中心提供
的美洲黑杨为父本，经过杂交选育得到的优良无性
系; 中红杨是中林 2025 杨的芽变品种; 全红杨是在
中红杨的基础上进一步选育而来。19 对 SSＲ 引物
均检测不到中林 2025 杨、中红杨和全红杨的条带差
异。除了这 3 个品种外，3 对高效的引物 OＲPM _
103，OＲPM_180 和 GCPM_1255 可以将 21 份杨树种
质完全区分开。
2. 2 新品种及其亲本系谱指纹鉴定
2. 2. 1 50 号杨、36 号杨以及其杂种一代和二代的
SSＲ 鉴定 以从意大利引进的美洲黑杨无性系 50
号杨为母本、36 号杨为父本杂交，从子代中选育出
了 3 个优良无性系，分别为丹红杨、南杨和 239; 其
中丹红杨和南杨速生杨树新品种，适合速生丰产林、
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第 2 期 贾会霞等: 杨树新品种的 SSＲ 指纹图谱构建和倍性检测 37
林 业 科 学 51 卷47
第 2 期 贾会霞等: 杨树新品种的 SSＲ 指纹图谱构建和倍性检测
图 1 引物 OＲPM_247 在 10 份杨树种质中的扩增图谱
Fig． 1 Polymorphic fingerprints detected by OＲPM_247 for 10 Populus germplasms
农田防护林和四旁绿化。以丹红杨为母本、南杨为
父本杂交，从子代中选育出 3 个优良子代，分别为
1-116、中成 1 号和中成 2 号。对这 8 份杨树种质进
行 SSＲ 分析鉴定，19 对引物中有 15 对能够鉴别这
8 份种质的差异条带(表 3)。其中引物 OＲPM_409，
GCPM_1599 和 PMGC_93 在杂交子代中出现不符合
亲本信息的条带，以引物 OＲPM_409 扩增的条带为
例，丹红杨和南杨分别为 212 bp /216 bp 和 200 bp，
1-116为 212 bp /216 bp，未出现父本南杨 200 bp 的
条带。
2. 2. 2 帝国杨、创新杨、丹红杨以及其杂种子代的
SSＲ 鉴定 以 I-69 杨和 I-63 杨杂交得到的南抗杨
1B 34-135 为母本、帝国杨为父本杂交，从子代中选
育出了优良子代创新杨; 以丹红杨为母本、创新杨
为父本杂交，选育出 3 个优良子代，分别为中豫 1
号、中成 3 号和中成 4 号。对帝国杨、创新杨、丹红
杨、中豫 1 号、中成 3 号和中成 4 号进行 SSＲ 分析鉴
定，19 对引物中有 18 对能够鉴别这 6 份种质的差
异条带 (表 3 )。引物 OＲPM _ 149，OＲPM _ 446，
GCPM_ 1177，GCPM _ 1255，GCPM _ 1454，GCPM _
1599，GCPM_1663 和 PMGC_2020 在检测创新杨时，
创新杨出现与帝国杨不相符的条带。引物 GCPM_
1599 在检测中成 4 号时，154 bp 的条带在亲本中均
未出现。
2. 2. 3 50 号杨、帝国杨以及其杂种子代的 SSＲ 鉴
定 以 50 号杨为母本、帝国杨为父本杂交，从子
代中选育出了 2 个优良无性系，中怀 1 号和中怀 2
号; 对这 4 份杨树种质进行 SSＲ 鉴定分析，19 对
引物中有 16 对能够鉴别这 4 份种质的差异条带
(表 3)。经检测，所有的条带信息均符合系谱关
系。其中引物 OＲPM_241，GCPM_1255 和 PMGC_
93 对中怀 1 号进行检测时，均扩增出 3 条差异条
带，且这些条带均有父本帝国杨杂合的等位基因
位点; 推测在培育中怀 1 号时，50 号杨的卵细胞
与帝国杨未经减数分裂的二倍体花粉受精，得到
了三倍体植株。
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林 业 科 学 51 卷
2. 2. 4 50 号杨、青杨以及其杂种子代的 SSＲ 鉴定
以 50 号杨为母本、青杨为父本杂交，从子代中选育
出了 2 个优良子代，森海 1 号和森海 2 号; 对这 4
份杨树种质进行 SSＲ 分析鉴定，19 对引物中有 17
对能够鉴别这 4 份种质的差异条带(表 3)。检测青
杨时，引物 OＲPM _241，OＲPM _247，GCPM _1177，
GCPM_162 和 PMGC_2020 扩增出 3 条带; 检测森海
1 号时，OＲPM_446，GCPM_1177，GCPM_162，GCPM_
2571 和 PMGC_2020 扩增出 3 条差异条带，检测森
海 2 号时，引物 OＲPM_241，OＲPM_247，OＲPM_446，
GCPM_1177，GCPM _ 1414，GCPM _ 162 和 PMGC _
2020 扩增出 3 条差异条带; 推测青杨、森海 1 号和
森海 2 号是三倍体，本研究中的青杨种质并非是森
海 1 号和森海 2 号的真正父本，所以子代的条带与
其存在较大的差异。
图 2 基于 SSＲ 结果的 24 份杨树种质的聚类
Fig． 2 Dendrogram of 24 Populus germplasms based on SSＲ data
2. 3 聚类分析
将 19 对 SSＲ 引物扩增出的条带转换为 0、1 矩
阵，用 NTSYS-pc 2. 10e 软件进行遗传多样性分析，
得到聚类分析图(图 2)，相似系数在 0. 50 ～ 1. 00 之
间。聚类结果显示，在相似系数为 0. 56 时，24 份杨
树种质可分为 5 大类。
第 1 类包括 50 号杨、中怀 1 号、中怀 2 号、I-69、
帝国杨、中林 2025 杨、中红杨和全红杨。中怀 1 号
和中怀 2 号是 50 号杨和帝国杨的杂交后代，中怀
1 号的遗传信息偏向父本，中怀 2 号的遗传信息偏
向母本。中林 2025 杨的母本是 I-69，2 个品种相似
系数较高，为 0. 86; 未测到中林 2025 杨、中红杨和
全红杨的条带差异。
第 2 类包括青杨、森海 1 号和森海 2 号。森海 1
号和森海 2 号是 50 号杨和青杨的杂交子代，遗传信
息均偏向于青杨。
第 3 类包括 36 号杨、丹红杨、南杨、239、1-116、
中成 1 号、中成 2 号、中成 3 号、中成 4 号和中豫 1
号。50 号和 36 号杨杂交得到丹红杨、南杨和 239，
丹红杨和南杨杂交得到了 1-116、中成 1 号和中成 2
号，聚类结果显示这些品种在相似系数为 0. 73 时聚
为一类，与其杂交系谱关系相符合。中成 3 号、中成
4 号和中豫 1 号的杂交亲本为丹红杨和创新杨，其
遗传信息偏向母本。
第 4 类包括北抗杨和创新杨。北抗杨是南抗杨
1A 34-17 ( I-69 × I-63)与 D175(引自美国的美洲黑
杨) 的 杂 交 子 代，创 新 杨 是 南 抗 杨 1B 34-135
( I-69 × I-63)和帝国杨的杂交子代，2 个品种都包含
南抗杨的遗传信息，在相似系数为 0. 74 时聚在
一起。
第 5 类中只有中林 46 杨。中林 46 杨是以美洲
黑杨为母本、钻天杨和俄罗斯杨的混合花粉为父本
得到的杂交子代，与其他 23 份杨树种质亲缘关系
较远。
2. 4 倍性测试结果
利用流式细胞仪 FACSCalibur 对 24 份杨树种
质进行倍性测试，图 3 是其中 12 份杨树的倍性测试
结果。从图 3 可以看出，当所测种质的 G1 期和 G2
期 DNA 相对含量分别位于 50 和 100 附近时，为二
67
第 2 期 贾会霞等: 杨树新品种的 SSＲ 指纹图谱构建和倍性检测
倍体; G1 期和 G2 期 DNA 相对含量分别位于 75 和
150 附近时，为三倍体。研究结果表明，中怀 1 号、
森海 1 号、森海 2 号、青杨、中林 46 均为三倍体，其
他 19 份杨树种质均为二倍体，与 SSＲ 鉴定推测的
结果一致。本研究说明 SSＲ 标记检测可以很好地
反映植物的倍性情况。
图 3 12 份杨树种质的倍性测试
Fig． 3 Ploidy pattern of 12 Populus germplasms
3 结论与讨论
目前由于许多杨树新品种的遗传基础狭窄以及
杂交组合亲本间差异较小，培育出的新品种之间形
态学相似，所以很难从表型差异方面进行准确区分，
DNA 指纹图谱被认为是快速鉴别新品种的重要技
术手段。本研究采用 TP-M13-SSＲ 技术利用 3 对高
效引物 OＲPM_103，OＲPM_180 和 GCPM_1255 可将
其中的 21 份杨树种质完全区分开，为新品种申请和
育种者权利保护等提供了科学准确的理论依据。中
林 2025 杨、中红杨和全红杨 3 份种质相对于其他
21 份种质，有特异的共同指纹条带，但是它们三者
之间并没有差异条带，可能是由于中红杨和全红杨
是中林 2025 杨的基础上选育来的新品种，在基因组
水平差异较小或者没有差异。本研究得到的指纹图
谱与其系谱关系基本一致。但是，在个别种质中出
77
林 业 科 学 51 卷
现了与亲本不相符的条带，推测原因如下: 一是杂
交子代 SSＲ 标记的个别基序(motif)重复数目发生
变化，如 1-116 仅有 1 个不相符的位点; 二是在杂交
过程中，亲本种质混淆，如创新杨出现许多与帝国杨
不相符的位点，推测其父本不是帝国杨。
与已报道的研究结果不同，冯锦霞等(2011)对
50 号杨、青杨及其杂交子代森海 1 号和森海 2 号进
行 SSＲ 分析鉴定时，未检测到 3 个等位基因差异位
点，例如引物 GCPM_1177 在青杨、森海 1 号和森海
2 号中只检测到 127 bp 和 135 bp 2 个位点; 而本研
究中多对引物检测到青杨、森海 1 号和森海 2 号有
3 个不同等位基因位点，例如引物 GCPM_1177 在青
杨、森海 1 号和森海 2 号中均检测到 3 个等位位点，
分别为 127，135，139 bp。在梁海永等 (2005)和王
辉等(2008)的文献中，利用 SSＲ 标记未检测到中林
46 有 3 个等位基因差异位点，本研究中引物 OＲPM_
103，OＲPM_241 和 PMGC_2020 均检测到 3 个不同
等位基因位点。
在进行 SSＲ 检测时，除了发现青杨、森海 1 号、
森海 2 号和中林 46 出现 3 个不同等位基因位点外，
还发现中怀 1 号也出现 3 个不同位点，其余 19 份杨
树种质只出现 1 个位点或 2 个位点。利用 FCM 对
24 份杨树种质进行倍性测试，发现扩增出 3 个位点
的 5 个杨树种质均为三倍体，与 SSＲ 标记检测结果
一致。Hu 等(2012)对中林 46 进行染色体观察计
数，发现其为三倍体，与本研究结果相符。Yagi 等
(2009)利用 SSＲ 标记和 FCM 对香石竹 ( Dianthus
caryophyllus)进行倍性检测分析，2 种方法得到了一
致结果。本研究同样证实了 SSＲ 标记检测能较好
地反映植物的倍性情况，可以作为检测植物倍性的
重要依据。
在读取 SSＲ 检测结果的电泳图谱时，经常会发
现有一些标记中出现大于或小于真实等位基因条
带，称之为“影子带”。“影子带”大多数发生于双核
苷酸重复序列中，由于 DNA 复制过程中双核苷酸重
复序列发生滑动错配导致生成各种不同长度的片段
(Hauge et al．，1993)。“影子带”会严重干扰对真实
等位基因的识别，在进行 PCＲ 扩增时，可以通过
touchdown-PCＲ 的方法来减少“影子带”的产生，但
该方法不能真正地避免该问题 ( Testolin et al．，
2000)。因此，在进行 SSＲ 指纹图谱构建时，应挑选
稳定性高和特异性好的引物进行扩增，同时应利用
系谱材料对“峰”与“等位基因”进行一一对应确证，
避免错误识别等位基因。
本研究利用 TP-M13-SSＲ 技术对 24 份杨树种
质进行了指纹图谱构建、遗传多样性分析和倍性测
试，证实了用 SSＲ 标记可以检测亲本与子代之间的
系谱关系，并很好地反映植物的倍性，为杨树新品种
鉴定和知识产权保护提供科学的理论依据，同时给
杨树育种工作奠定坚实的基础。但是本研究未对
24 份杨树种质进行染色体压片镜检，在今后的工作
中将采用此方法进一步确定染色体倍数并进行核型
分析。
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