全 文 ：第 50 卷 第 12 期
2 0 1 4 年 12 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 12
Dec．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．20141209
收稿日期: 2014 － 06 － 17; 修回日期: 2014 － 07 － 27。
基金项目: “十二五”农村领域国家科技计划课题( SQ2010AA1000687008) ; 国家自然科学基金项目(31201654)。
* 王雁为通讯作者。
云南野生黄牡丹谷胱甘肽转移酶(GST)
基因的分离及表达分析*
史倩倩 周 琳 王 雁
(中国林业科学研究院林业研究所 国家林业局林木培育重点实验室 北京 100091)
摘 要: 从已构建的云南野生黄牡丹花瓣转录组数据库中得到 10 个与花色素转运相关的谷胱甘肽转移酶
(GST)蛋白同源性高的 Unigene 序列，分别命名为 PlGST1 － 10。利用 ＲT-PCＲ 和 ＲACE 技术对 PlGST1 － 10 最大阅
读框(OＲF)序列扩增并进行氨基酸序列比较和系统进化树分析，结果显示: PlGST5 可能与花色素转运相关，包含 1
个 675 bp 的开放阅读框，编码 1 个 224 个氨基酸的蛋白，含有 2 个内含子和 3 个外显子，属于 phi 型 GST; 其氨基酸
序列与葡萄 VvGST4、矮牵牛 PhAn9、仙客来 CkmGST3、拟南芥 AtTT19、瓜叶菊 ScGST3 和香石竹 DcGSTF2 等花色素
转运 GST 具有较高的相似性。PlGST5 在不同花色的花发育时期及盛开期的不同组织的 qＲT-PCＲ 分析表明 PlGST5
在花色素积累较多的组织中高丰度表达，在黄牡丹和紫牡丹的盛开期表达量最高，而在牡丹品种‘赵粉’和‘玉板
白’的花发育早期表达量最高。推测 PlGST5 参与黄牡丹花色素转运。
关键词: 黄牡丹; 谷胱甘肽转移酶; 花色素; 基因克隆; 基因表达
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)12 － 0063 － 10
Isolation and Expression Analysis of GST Gene Encoding Glutathione
S-Transferase of Paeonia delavayi var． lutea Wild Population in Yunnan
Shi Qianqian Zhou Lin Wang Yan
(Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration
Ｒesearch Institute of Forestry，Chinese Academy of Forestry Beijing 100091)
Abstract: In this study，10 unigene sequences that share high homology with glutathione S-transferase(GST) protein
involved in plant anthocyanin transfering were obtained from previously-constructed tree peony ( Paeonia delavayi var．
lutea) petal transcriptome database and named PlGST1 － 10． Sequences of Open Ｒeading Frame (OＲF) in PlGST1 － 10
were amplified with designed specific primers using ＲT-PCＲ and ＲACE techniques，and the amino acid sequences were
compared and the phylogenetic tree was analyzed． Ｒesults showed that PlGST5 was considered to be an alternative gene
which is related to anthocyanin transferring，contained a 675 bp OＲF encoding 224 amino acid residues with 2 introns and
3 excons and belonged to phi type GST． The predicted protein sequence of PlGST5 also shared high similarity with other
GSTs that are related to anthocyanin transferring，such as VvGST4 (Vitis vinifera)，PhAn9 (Petunia hybrida)，CkmGST3
( Cyclamen persicum )， AtTT19 ( Arabidopsis thaliana )， ScGST3 ( Senecio cruentus ) and DcGSTF2 ( Dianthus
caryophyllus) ． The expression patterns of PlGST5 in different tissues and petals with different flower colors during flower
development were investigated using qＲT-PCＲ． The results indicated that PlGST5 had a higher expression level in the
tissues containing more anthocyanin． The expression level was the highest when flowers fully opened in P． delavayi var．
lutea and P． delavayi，while the expression reached the highest abundance at early developmental stage of P． suffruticosa
‘Zhao Fen’and P． suffruticosa‘Yu Banbai’． In conclusion，we inferred that PlGST5 might associate with the transfer of
anthocyanin in P． delavayi var． lutea and this would provide the basis for insight into the molecular mechanisms
underlying tree peony yellow flower pigmentation．
Key words: Paeonia delavayi var． lutea; glutathione S-transferase; anthocyanin; gene clone; gene expression
林 业 科 学 50 卷
植 物 谷 胱 甘 肽 转 移 酶 ( glutathione
S-transferases，GSTs)是由多个基因编码、具有多种
功能的超家族酶，根据蛋白质同源性和基因组结构，
分为 U( tau)、T( theta)、F( phi)、Z( zeta)、L( lamda)
5 类(Buetler et al．，1992)，在植物的初级和次级代
谢、胁迫和信号传导过程中具有许多不同的功能
(Moons，2003)。
花色作为观赏植物的一个重要观赏性状，也是
观赏植物重要的品质指标之一。因此，培育具有新
型花色的新品种一直是观赏植物育种领域的研究热
点。花色素是决定花色的主要色素(Harborne et al．，
2000)，能控制花的黄色、橘黄、红色、紫色和蓝色等
颜色的形成，其在细胞质中合成，然后转运到液泡。
花色素在液泡中的积累对花色的形成和改变具有重
要 作 用 ( Winkel-Shirley， 1999; Winkel， 2004;
Grotewold，2004)。另外，矮牵牛(Petunia hybrida)
的花色素甲基转移酶( Jonsson et al．，1983)及龙胆
(Gentiana scabra) 和紫苏 (Perilla frutescens) 的花色
素酰基转移酶 ( Fujiwara et al．，1998; Yonekura-
Sakakibara et al．，2000) 在细胞质中的定位证明了
所有花色素被转运到液泡中。
前人研究证明，谷胱甘肽转移酶家族(GSTs)的
一些成员参与了花色素的运输。例如，在玉米(Zea
mays)中，由于 BZ2 基因的敲除突变，导致了花色素
只在细胞质中积累(Mueller et al．，2001; Goodman et
al．，2004)。后来花色素转运 GSTs 基因还在其他物
种中发现，如拟南芥 ( Arabidopsis thaliana) AtTT19
(Kitamura et al．，2004 )、矮牵牛 PhAn9 ( Alfenito et
al．，1998)、葡萄 ( Vitis vinifera) VvGST4 ( Conn et al．，
2008)、紫苏 PfGST1(Yamazaki et al．，2008)、仙客来
( Cyclamen persicum ) CkmGST3 ( Kitamura et al．，
2012 )、香 石 竹 ( Dianthus caryophyllus ) DcGSTF2
(Larsen et al．，2003; Sasaki et al．，2012) 和瓜叶菊
(Senecio cruentus)ScGSTs(金雪花等，2013)等。
云南野生黄牡丹 ( Paeonia delavayi var． lutea)
作为中国西南地区特有种，是具有极高观赏价值的
特有园艺资源和极高药用价值的药材资源。因其花
为黄色，在牡丹花色改良研究中具有重要地位 (王
志芳等，2007)。目前牡丹(P． suffruticosa)品种‘彩
绘’(P． suffruticosa‘Cai Hui’)的花色素合成途径
的部分结构基因虽已被分离及验证，但黄牡丹花瓣
的研究仅局限在花色素成分的分析上(周琳，2010;
周琳等，2011)，并且关于黄牡丹的花色素代谢途径
的基因和 GSTs 基因还未见报道。本研究根据黄牡
丹转录组测序获得的 Unigene 信息设计特异性引
物，结合 ＲACE 技术和 ＲT-PCＲ 技术，克隆并筛选出
与花色素相关的候选基因 PlGST5，并对其在不同花
色不同开放时期和盛开期的不同组织中的表达模式
进行分析，为研究花色素转运机制，探讨牡丹黄色花
形成机制奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
4 月底至 5 月上旬，于滇西北香格里拉县城以
西 25 km 左右的滑雪场附近(27°57 N，99°35 E)，
采集黄牡丹和紫牡丹(P． delavayi) 5 个时期(硬蕾
期、圆桃期、透色期、初开期和盛开期)的花瓣 (图
1 A)及盛开期的叶片、茎、萼片、雄蕊和雌蕊，并剪
下盛开期花瓣的紫色斑纹，分别用锡箔纸包好，立
即用液氮速冻后于 － 80 ℃冰箱中保存备用; 采用
同样的方法于中国林业科学研究院的玉泉山牡丹
圃中采集牡丹品种‘赵粉’( P． suffruticosa‘Zhao
Fen’) (粉色 ) 和‘玉板白’( P． suffruticosa ‘Yu
Banbai’) (白色) (图 1 B)的 5 个时期(硬蕾期、圆
桃期、透色期、初开期和盛开期)的花瓣及盛开期
的叶片、茎、萼片、雄蕊和雌蕊，并保存于 － 80 ℃冰
箱中。
1. 2 总 ＲNA 提取及目的基因全长序列的克隆
采用改进的 CTAB 法(孟丽等，2006)提取试验
材料的总 ＲNA。检测质量合格后，以 1 μg 总 ＲNA
为模板，利用 Promega 公司的 M-MLV 反转录酶合成
cDNA 第 1 链; 然后根据转录组数据中的 Unigene
信息设计特异引物 (表 1 )。PCＲ 扩增产物通过
1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测、回收，然后连接到 PMD-
T19 载 体 ( Takara ) 上，再 转 化 到 大 肠 杆 菌
(Escherichia coli)感受态细胞 TOP10，经蓝白斑筛
选，由北京中美泰和科技公司进行测序。其中引物
设 计 采 用 PrimerPremier5. 0 和 DNAMAN ( ver．
6. 0. 3. 99)软件进行。除 ＲACE 试验中通用引物为
试剂盒附带以外 (序列见 SMAＲTTM ＲACE cDNA
Amplification Kit 说明书)，其余各基因扩增引物(表
1)委托上海生工生物公司合成。
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第 12 期 史倩倩等: 云南野生黄牡丹谷胱甘肽转移酶(GST)基因的分离及表达分析
图 1 试验材料
Fig． 1 The materials for this experiment
A: 黄牡丹花的 5 个发育阶段;B:不同花色的牡丹 ．
A: Five flower developmental stages of P． delavayi var． lutea; B: Tree peony with dfferent flower colors．
表 1 黄牡丹 GST 基因克隆及表达分析所用引物
Tab． 1 Primers used to isolate and analyze the expression of PlGSTs
作用
Function
基因名称
Gene name
引物序列
Prime sequence(5—3)
扩增作用
Amplication function
分离基因
Isolate gene
PlGST1 ATGGCGGAAGAGGTTATTCTGTTGGAC /CTCTATCCCGTGCTTCTTTCTCAGTCCC cDNA 全长 For the full cDNA
PlGST2 GCAGCCAACCAACTCATCAATC /CAAGTCAAATCCCGTCCACAAG 5ＲACE /3 ＲACE
PlGST3 ATTGCTCGCTTCTGGGCTGCCTATG 3 ＲACE
PlGST4 ATCAGCCAGGGAAACTTCGTCT /GCTCTTGCTCTTACCGTGTTCG 5 ＲACE /3ＲACE
PlGST5 GAAGGGCAAAGTTTCAACCCACCAAG 3 ＲACE
PlGST6 ATGAAATTGAAAGTATACGCTGATCGAATG /CAACTTTGAATGTGGTGCTGTTTTCGAGTT cDNA 全长 For the full cDNA
PlGST7 ATGCAGCTATATCATCATCCCTGCTCTTTG /ATATCTCTTCAACATACTTCGGATGCG cDNA 全长 For the full cDNA
PlGST8 TGAAGCAAGTGGGTCAAACTGGTG /GCGACAATCTAACGATGGGAGCA 5 ＲACE /3 ＲACE
PlGST9 GAAATCCAGTCTCGGAATCCCTCA 3 ＲACE
PlGST10 TGCTGCTTCTTGCTCCAACCCT /GAAATCCAGTCTCGGAATCCCTCA 5ＲACE /3 ＲACE
ＲT-PCＲ
PlGST1 CTCCGTTGTTGCCTTCTGAT /TCTCCAAGCACCTCTTAGCC
PlGST5 TTCAACCCACCAAGTTCAGC /CAACCACCTTCTTCCACGA
PlGST6 TGTTGTCTTCTTCCCTTTCCA /GTGGTCTCACTGCTCCCATC
PlGST7 TATCGGCTGTTTGTTTCCAA /GCCTCTGCTTTATCACACTCC
PlGST8 CAAGAGCAATCACGCAATACA /GCTACCCAAGCACAAACCTT
Helicase GAGTGCGGGTTGAATCGTTG /CTGGATAGGTCTGTGGCGAG
qＲT-PCＲ
PlGST5 TTCTCACCTGCCAAACACG /CATAGCAACCACCTTCTTCCA
Helicase GAGTGCGGGTTGAATCGTTG /AAGATTTCTGGATAGGTCTGTGGC
PCＲ PlGST5 ATGGCAGCTGCAGTGAAAGT /GCATAAAATAAAGAACAAAGAACCA gDNA 全长 For the full gDNA
1. 3 生物信息学
用 DNAMAN6. 0 软件进行氨基酸序列相似性比
对，并在 ExPASY Protparam ( http:∥ www． expasy．
org / compute_pi /)上运用 ComputePI /Mw 软件预测
编码蛋白的分子量及理论等电点。利用 NCBI 数据
库( http:∥ www． ncbi． nlm． nih． gov / structure / cdd / ．
wrpsb． cgi ) 预 测 编 码 蛋 白 的 保 守 结 构 域 和
MEGA5. 2. 2 软件中的 Neighbor-Joining(邻位相连，
NJ)法构建系统进化树。
1. 4 表达模式分析
采 用 ＲT-PCＲ 技 术 分 析 PlGST1，PlGST5，
PlGST6，PlGST7，PlGST8 在黄牡丹、紫牡丹、‘赵粉’
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林 业 科 学 50 卷
和‘玉板白’的花瓣不同发育阶段的表达模式。同
样以 Helicase 为内参基因，应用 qＲT-PCＲ 法分析
PlGST1 － 10 在不同发育阶段和不同组织的表达模
式，引物序列见表 1。参照 TaKaＲa 公司的荧光定量
试剂盒 STBＲ PrimeScriptTM ＲT-PCＲ Kit 说明书，建立
20 μL 反应体系(表 2)。荧光定量 PCＲ 在 Ｒoche
Light Cyder 480 实时定量 PCＲ 仪上进行，反应程序
为: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环; 然
后通过加热扩增产物 60 ℃至 95 ℃，获得溶解曲线。
采用 Livak 等(2001)的 2 － △△ CT法计算目的基因的
相对表达量。所有的 qＲT-PCＲ 反应均进行生物学
重复和技术重复 (每个样品 3 个生物学重复，每个
生物学重复 3 个技术重复)。
表 2 实时定量 PCＲ 反应体系
Tab． 2 qＲT-PCＲ reaction systems
组分 Ingredient 体积 Volume /μL
SYBＲ Premix Ex TaqTM 10
PCＲ forward primer(10 μmol·L － 1 ) 0. 8
PCＲ reverse primer(10 μmol·L － 1 ) 0. 8
cDNA 2
dH2 O 6. 4
合计 Total 20
2 结果与分析
2. 1 黄牡丹 PlGST 基因家族的分离及花色素相关
GST 的筛选
对本课题组前期构建的黄牡丹花瓣转录组数据
库(未发表)分析发现有 19 个 Unigene 与 GSTs 基因
同源性较高 (表 3)。但其中同一 Unigene 的不同
Contig 的 序 列 基 本 相 同，如 CL7322． Contig1 与
CL7322． Contig2，3，4，5 的序列一致，CL5164． Contig1
与 CL5164． Contig2 序列完全相同，因此推测 10 个序
列可能与参与花色素运输的 GST 酶有关。根据
Unigene 信息设计特异引物，进行 PCＲ 扩增，将得到
的 10 个 GST 成员分别命名为 PlGST1 － 10。将这 10
个 GST 成员编码的氨基酸序列与拟南芥 GSTs 成员
(Wagner et al．，2002; Kitamura et al．，2004)和其他与
花色素相关的 GSTs 成员构建系统进化树(图 2)。由
图可见: PlGST2，PlGST3，PlGST4，PlGST9，PlGST10 先
聚类在一起，然后与 PlGST1 聚在 tau 型(AtGSTU)分
支上; PlGST5，PlGST8 与拟南芥 phi 型(AtGSTF)聚在
一支; PlGST6，PlGST7 与拟南芥 theta 型(AtGSTT)聚
类在一起。分析发现 PlGST5 与花色素相关 GST
( AtTT19，DcGSTF2，PfGST1，VvGST4，CkmGST3 和
PhAn9)的同源性最高。
表 3 与 GST 基因相关的 10 个 Unigene 基本信息
Tab． 3 The ten unigenes related to GST genes
Unigene 编号
Unigene ID
Unigene 长度
Unigene length / bp
Pl-FPKM Blastx 比对结果
CL7322． Contig1 672 91. 875 1 Glutathione S-transferase，putative (Ｒicinus communis)
CL7322． Contig2 372 4. 024 4 Glutathione S-transferase GSTU33 (Populus trichocarpa)
CL7322． Contig3 657 41. 727 1 Glutathione S-transferase，putative (Ｒicinus communis)
CL7322． Contig4 669 9. 576 2 Glutathione S-transferase，putative (Ｒicinus communis)
CL7322． Contig5 231 1. 979 1 Glutathione S-transferase-like (Vitis vinifera)
Unigene14312 633 4. 024 39 Tau class glutathione S-transferase GSTU45 (Populus trichocarpa)
CL5164． Contig1 684 0. 762 0 Glutathione S-transferase U17 isoform1 (Vitis vinifera)
CL5164． Contig2 684 1. 075 5 Glutathione S-transferase U17 isoform1 (Vitis vinifera)
CL8420． Contig1 630 99. 590 2 Glutathione S-transferase (Pyrus pyrifolia)
CL8420． Contig2 630 18. 251 9 Glutathione S-transferase (Pyrus pyrifolia)
Unigene11611 651 6. 077 43 Glutathione S-transferase theta，gst，putative (Ｒicinus communis)
CL3028． Contig1 750 12. 152 8 Glutathione S-transferase theta，gst，putative (Ｒicinus communis)
CL3028． Contig2 723 35. 204 9 Glutathione S-transferase theta，gst，putative (Ｒicinus communis)
CL3028． Contig3 198 6. 684 6 Glutathione S-transferase (Panax ginseng)
CL10364． Contig1 801 3. 086 9 Glutathione S-transferase family protein (Theobroma cacao)
Unigene14840 642 4. 997 9 Phi class glutathione S-transferase protein (Bruguiera gymnorrhiza)
Unigene22976 663 38. 386 5 Glutathione transferase，partial (Vitis vinifera)
CL592． Contig1 306 2. 004 8 Probable glutathione S-transferase (Vitis vinifera)
CL592． Contig3 612 2. 12 Probable glutathione S-transferase parA (Nicotiana tabacum)
利用 ＲT-PCＲ 技术，对进化树中与其他物种花
色素转运相关 GST 关系较近的 PlGST5 和另外 4 个
聚在同一大分支上的 PlGST 基因在 4 个花色牡丹花
瓣的不同发育时期中的表达模式进行分析，结果显
示 PlGST5 在黄牡丹和紫牡丹中的表达量比在‘赵
粉’和‘玉板白’中高很多，且除了在‘玉板白’的硬
蕾期(第 1 阶段)有少量表达外，在其他 4 个发育阶
段中 几 乎 无 表 达 ( 图 3 )。而 PlGST6，PlGST7，
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第 12 期 史倩倩等: 云南野生黄牡丹谷胱甘肽转移酶(GST)基因的分离及表达分析
PlGST8 的表达模式基本无变化，可断定为组成型表
达; PlGST1 基因在不同花色不同发育阶段的表达
模式基本上没有规律(图 3)。因此推测 PlGST5 可
能与牡丹的花色素转运相关。
图 2 PlGSTs 和不同物种 GSTs 的系统进化树
Fig． 2 The phylogenetic tree derived from deduced amino acid sequences of PlGSTs and other known GSTs
AtGSTU: tau 型 tau type; AtGSTF: phi 型 phi type; AtGSTT: theta 型 theta type．
Pl: 黄牡丹 P． delavayi var． lutea; At: 拟南芥 Arabidopsis thaliana; Pf: 紫苏 Perilla frutescens; Vv: 葡萄 Vitis vinifera; Ph:
矮牵牛 Petunia hybrida; Ckm: 仙客来 Cyclamen persicum; Dc: 香石竹 Dianthus caryophyllus; Sc: 瓜叶菊 Senecio cruentus．
图 3 PlGST1，5，6，7，8 在不同花色花瓣的 5 个发育时期的表达模式
Fig． 3 The expression pattern of PlGST1，5，6，7，8 in tree peony petals with different flower color
1 － 5: 牡丹花瓣发育阶段 Developmental stages of tree peony flowers 1: 硬蕾期;2:圆蕾期;3:透色期;4:初开
期;5:盛开期。下同。1: Unpigmented tight bud; 2: Slightly pigmented soft bud; 3: Initially opened flower; 4:
Half opened flower; 5: Fully opened flower． The same below．
2. 2 黄牡丹 PlGST5 cDNA 序列分析
根据黄牡丹花瓣转录组数据库 (未发表)筛选
出的 PlGST5 基因的 Unigene 序列(Unigene11611)，
设计特异引物并利用 ＲACE 技术扩增 OＲF 编码区，
然后利用 NCBI 提供的 OＲF Finder 进行分析，发现
PlGST5 cDNA 的扩增序列全长 919 bp，包含 675 bp
的开放阅读框 ( open reading frame，OＲF) 和一个
poly(A)尾巴，5非编码区长 64 bp，3非编码区长
154 bp。其 OＲF 编码一个含 224 个氨基酸的蛋白
质，Protparam ( http:∥ www． expasy． org / compute _
pi /)预测所编码蛋白的分子量为 25. 137 8 kDa，理
论等电点(pI)为 8. 65。
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林 业 科 学 50 卷
利用 BlastP 对 PlGST5 编码的蛋白保守域进行预
测发现，PlGST5 编码的蛋白的保守结构域为 GST
(PIN02395，glutathione S-transferase)，含有 2 个保守
域: 一 个 为 Thioredoxin _ like superfamily 结 构 域
(cl00388，蛋白质二硫氧化还原酶和其他具有硫氧还
蛋白折叠的蛋白质，GST_N_Phi subfamily); 另一个为
GST_C_family superfamily 结构域(cl02776，GST 家族
的羧基端，α 螺旋域，GST_C_Phi subfamily)(图 4)。
图 4 BlastP 推导的 PlGST5 氨基酸序列保守区检索
Fig． 4 Search for conserved domains in deduced sequence of amino acid of PlGST5 gene
谷胱甘肽 GSH 结合位点包括: 一是由氨基端
TＲX －折叠域的氨基酸残基形成的 GSH 特异结合
位点(G 位点)，二是包括羧基端 α 螺旋域残基的非
特异底物结合位点(H 位点)。PlGST5 氨基酸序列
分析结果显示，位于第 14，45，46，47，58 和 59 氨基
酸残基为 G 位点(图 5“#”表示); 而位于第 112，
113，116，117，119，120，124，127，175 和 178 氨基酸
残基为 H 位点(图 5“* ”表示)。
2. 3 黄牡丹 PlGST5 编码氨基酸的同源性分析
为对黄牡丹 PlGST5 与其他物种 GST 进行同源
性分析，利用 DNAMAN 软件对包括 PlGST5 在内的
8 个物种的 GST 蛋白氨基酸序列 (Wagner et al．，
2002; Kitamura et al．，2004; 2012; Yamazaki et al．，
2008; Conn et al．，2008; Sasaki et al．，2012; 金雪花
等，2013)进行了多重比对(图 6)。结果发现，黄牡
丹 PlGST5 与已知的花色素相关的 GST 蛋白氨基酸
序列有相似的同源性，其中与葡萄 VvGST4 相似性
最高，达 45. 15% ; 与拟南芥 AtTT19 和香石竹
DcGSTF2 相似性相对较低，为 39. 24%。
对构建的系统发育树 (图 2)分析发现，10 个
GST 成员中，仅有 PlGST5 与已知花色素转运相关的
GST 聚类在一起，说明 PlGST5 可能也具有转运花色
素的功能。
以黄牡丹花瓣 gDNA 为模板，扩增了 PlGST5 基
因组 DNA。由图 7 可知 PlGST5 gDNA 从起始密码子
到终止密码子约长 821 bp，含有 3 个外显子和 2 个内
含子，内含子总长为 146 bp(图 7)，属于 GT-AG 内含
子。Blastn 比对结果说明 PlGST5 属于 phi 型 GST。
图 5 PlGST5 基因 cDNA 全长及推导的氨基酸序列
Fig． 5 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the complete cDNA of PlGST5
ATG 为起始密码子;TGA 为终止密码子。标注‘#’处为 6 个 G 位点;标注‘* ’处为 10 个 H 位点。Start and stop codons are underlined．
The six amino acide residues of the G site are noted with‘#’，while‘* ’denote the residues of ten H sites．
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第 12 期 史倩倩等: 云南野生黄牡丹谷胱甘肽转移酶(GST)基因的分离及表达分析
图 6 黄牡丹 PlGST5 与其他已知花色素苷相关 GST 氨基酸序列比对
Fig． 6 Alignment of amino acid sequence of PlGST5 in P． delavayi var． lutea and other known GST related to anthocyanin
图 7 黄牡丹 PlGST5 基因组结构
Fig． 7 The structure of PlGST5 genome in P． delavayi var． lutea
2. 4 PlGST5 表达模式分析
qＲT-PCＲ 分析 PlGST5 在黄牡丹 (黄色)、紫牡
丹(紫色)、‘玉板白’(白色)和‘赵粉’(粉色)花瓣
不同开放时期的表达模式发现，在花色素含量较高
的黄牡丹、紫牡丹和‘赵粉’花瓣中表达量较高，而
在不含花色素或含量极少的‘玉板白’花瓣中的表
达量很少(图 8)。在花色较深的黄牡丹和紫牡丹的
盛开期(第 5 阶段)，PlGST5 表达量最高，与硬蕾期
(第 1 阶段)的表达量存在极显著差异，这与黄牡丹
和紫牡丹在盛开期的花色着色最深相符合。在花色
为粉色的‘赵粉’的硬蕾期表达最高，随着花的开放
表达量不断下降，且在透色期(第 3 阶段)、初开期
(第 4 阶段)和盛开期的表达量较硬蕾期显著降低。
在花色为白色的‘玉板白’的硬蕾期高丰度表达，随
着花朵的开放不断降低，最终在盛开期基本无表达。
进一步对黄牡丹(黄色)、紫牡丹(紫色)、‘玉板
白’(白色) 和‘赵粉’(粉色) 的盛开期的花瓣、萼
片、雄 蕊、心 皮 和 叶 片、茎 中 的 表 达 模 式 进 行
qＲT-PCＲ分析发现，PlGST5 在花瓣和心皮中表达最
低，在萼片、叶片和茎中高丰度表达。PlGST5 在黄
牡丹、紫牡丹和‘玉板白’的各组织中的表达模式相
似，在花药、萼片、叶片和茎中的表达量比花瓣中的
表达量极显著或显著升高，而黄牡丹的心皮中的表
达量比花瓣中的表达量稍低，紫牡丹的心皮中的表
达量较花瓣中的表达量显著升高。PlGST5 在‘赵
粉’的萼片、叶片和茎中的表达显著比花瓣高，而在
花药和心皮中的表达与花瓣中的表达相似(图 9)。
整体上看，PlGST5 在浅色系的‘赵粉’和‘玉板白’
各组织中的表达量比深色系的黄牡丹和紫牡丹的表
达量低，这与在各色系的花瓣发育过程中的表达相
一致。
3 讨论
花色素先在细胞质中合成，然后被转运并积累
在液泡中。已有研究证明花色素分子运输到液泡中
有 3 种方式: 以膜为介质、以囊泡为介质和以转运
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林 业 科 学 50 卷
图 8 PlGST5 在不同花色牡丹花瓣中的表达模式
Fig． 8 Expression patterns of PlGST5 in tree peony petals with different flower color
1 － 5． 牡丹花发育阶段 Developmental stages of tree peony flowers．
图 9 PlGST5 在不同花色牡丹的盛开期(第 5 阶段)不同组织中的表达模式
Fig． 9 The expression pattern of PlGST5 in different tissues of
tree peony with different flower color at fully opened flower( stage 5)
子为介质。其中以膜为介质的运输途径中，谷胱甘
肽转移酶(GST)是起关键作用的一个酶，在多种植
物中参 与 花 色 素 分 子 的 运 输 ( Goodman et al．，
2004)。本研究根据黄牡丹转录组数据中的 Unigene
序列并结合 ＲACE 技术克隆了 10 个 GST 成员，并
通过构建系统进化树和 ＲT-PCＲ 分析筛选出黄牡丹
花色素转运相关的 GSTs 基因 PlGST5。
前人通过突变体研究证明具有转运花色素功能
的 GST 蛋白在物种之间是相当保守的(Alfenito et
al．，1998; Marrs et al．，1995; Satoshi et al．，2004)。
为了进一步证明 PlGST5 参与花色素转运，对其进行
了序列及表达模式分析。序列分析表明，PlGST5 所
推测编码的蛋白序列具有 GST 蛋白家族典型的 2
个保守结构域和 2 个功能位点，与已发表的花色素
相关 GST 也具有较高的相似性，而且与花色素转运
相关 GSTs 亲缘关系近，尤其是与葡萄和拟南芥的
花色 素 转 运 相 关 GSTs ( Wagner et al．， 2002;
Kitamura et al．，2004; Conn et al．，2008 )，说 明
PlGST5 具有相似的功能。GSTs 的高度保守性也许
是 GSTs 比 ATP 结合盒式蛋白(ATP-binding cassette
transporter，ABC ) 和多药抗性转运蛋白 ( multidrug
and toxic compound extrusion，MATE)研究更广泛的
07
第 12 期 史倩倩等: 云南野生黄牡丹谷胱甘肽转移酶(GST)基因的分离及表达分析
原因之一。ABC 转运蛋白直接利用水解 ATP 供能，
底物可以是离子、单糖、氨基酸、磷脂、肽、多糖和蛋
白质; 而植物 MATE 蛋白是一种能利用 ATP 的能
量将各种药物从细胞质转运到细胞外，底物主要是
多药和有毒化合物(Yazaki et al．，2008)。
花色素转运相关 GST 表达模式与花色素积累
模式密切相关，而且研究证明 GSTs 也参与类黄酮
的合成和积累 ( Kitamura et al．，2004 )。矮牵牛
PhAn9 在花瓣中表达模式与花色素的合成相一致
(Alfenito et al．，1998)。在果实着色过程中，山葡萄
VAmGST4 在果皮中的表达随花色苷的合成上调(刘
海峰等，2011)。紫苏 PfGST1 的表达模式与紫苏不
同组织中花色素积累模式一致 ( Yamazaki et al．，
2003; 2008)，且优先在橙黄色果实中表达(Lo Piero
et al．，2006)。PlGST5 在花色素含量较高的黄牡丹、
紫牡丹和‘赵粉’花瓣中表达量高，而在不含或含少
量花色素的‘玉板白’花瓣中的表达量极少; 不同组
织中，在萼片、叶片和茎中高丰度表达，而在花瓣和
心皮中表达最低。这与金雪花等 (2013)对瓜叶菊
ScGST3 在组织和花瓣的表达模式的研究结果相
吻合。
花色素转运相关 GSTs 表达模式也与合成花色
素的组织发育过程有关。如拟南芥 AtTT19 的表达
模式与积累类黄酮的组织的发育阶段密切相关
(Kleindt et al．，2010)。本研究发现，在花色较深的
黄牡丹和紫牡丹的盛开期，PlGST5 表达量最高，与
硬蕾期的表达量极显著差异，这与在香石竹花发育
后期的花瓣中大量检测到 DcGST2 的转录本的报道
相吻合(Sasaki et al．，2012); 在花色为粉红色的‘赵
粉’的硬蕾期表达最高，随着花的开放表达量不断
下降，与仙客来和矮牵牛(Quattrocchio et al．，1993;
Alfenito et al．，1998; Kitamura et al．，2012)的研究结
果相似，即在花发育早期高表达，而在发育后期表达
很弱。本研究中出现的关于花发育过程中的 2 种不
同表达模式可能与试验材料所属的居群不一样有
关，即黄牡丹和紫牡丹均为云南野生种，而‘赵粉’
和‘玉板白’均为中原牡丹的栽培品种，它们花色素
合成的变化趋势也许不同。本结果与 5 个 PlGSTs
成员的 ＲT-PCＲ 分析相一致(图 3)。
综上所述，PlGST5 可能参与黄牡丹花色素的转
运和积累。但由于 GST 在植物体内行使多种功能，
如解除外界毒素以及内源有毒代谢物的侵害、调节
细胞程序衰老和作为胁迫信号等功能( Edwards et
al．，2000; Dixon et al．，2002; Loyall et al．，2000)，黄
牡丹的其他 9 个 GST 成员的功能还有待进一步
确定。
黄牡丹花色素转运相关基因 PlGST5 的分离及
表达模式的分析，将为更好地认识 PlGST5 在黄牡丹
花瓣着色过程中的作用，培育出更多牡丹新品种奠
定了良好的基础。
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(责任编辑 徐 红)
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