全 文 ：第 49 卷 第 4 期
2 0 1 3 年 4 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 4
Apr．，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20130413
收稿日期: 2012 － 03 － 31; 修回日期: 2012 － 10 － 31。
基金项目: 国家自然科学基金项目(30872025; 31170602)。
* 田国忠为通讯作者。
4种植物病害植原体病原质粒全序列测定及分子特征*
胡佳续 宋传生 林彩丽 耿显胜 田国忠
(中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 国家林业局森林保护学重点实验室 北京 100091)
摘 要: 根据已发表植原体质粒序列设计引物，经 2 次 PCR 扩增，获得大小不同的 2 段 DNA 片段，测序后拼接得
到 4 种完整的环状质粒，分别是桑树萎缩植原体濮阳株系质粒 ( pMDPy)、长春花绿变植原体海南株系质粒
(pPeVHn)、泡桐丛枝植原体山东株系质粒 ( pPaWBG33D)及苦楝丛枝植原体福清株系质粒 ( pCWBFq － 2)，其中
pMDPy 为首次测定，其质粒全长分别为3 833，3 943，3 843和3 913 bp，4 种质粒皆编码 5 种蛋白，ORF1 和 ORF5 分
别编码复制相关蛋白(RepA)和单链 DNA 结合蛋白( SSB)，ORF2—4 编码未知功能蛋白。4 种质粒序列的非编码
区分析表明，ORF1 和 ORF2 之间的非编码区存在启动子和核糖体结合位点。将 4 种植原体质粒全序列与 GenBank
中登录的植原体质粒进行序列相似性比对和系统进化分析，结果表明这 4 种质粒与其他 16Sr I 组的质粒聚为一个
大的分支，与 16S rDNA 系统发育树基本一致。这可为进一步深入了解不同植原体质粒的结构与功能、寄主专化性
和质粒基因变异及进化奠定基础，也可为基于多基因分类鉴定提供新的理论依据。
关键词: 植原体; 质粒; 序列分析; 系统进化分析
中图分类号: S763. 11 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)04 － 0090 － 08
Sequencing the Full-Length DNA and the Molecular Characterization of
Four Plasmids from Plant Pathogens of Phytoplasma Disease
Hu Jiaxu Song Chuansheng Lin Caili Geng Xiansheng Tian Guozhong
(Key Laboratory of Forest Protection，State Forestry Administration; Research Institute of Forest Ecology，
Environment and Protection，CAF Beijing 100091)
Abstract: On the basis of the known phytoplasmal plasmid sequences，two pairs of specific primers were designed and
used for amplication by PCR． Two amplified DNA fragments with different sizes covering the whole plasmid were obtained
through two round of PCR amplification． After being sequenced and spliced，four phytoplasmal full-length circular plasmid
DNA sequences， including the plasmids of mulberry dwarf ( pMDPy ) in Puyang，Henan Province， periwinkle
(Catharanthus roseus ) virescence ( pPEVHn ) in Hainan Province， paulownia witches’-broom ( pPaWBG33D ) in
Yanzhou，Shandong Province and chinaberry witches’-broom phytoplasma strains ( pCWBFq － 2 ) in Fuqing，Fujian
Province were achieved，with the sizes of 3 833，3 943，3 843 and 3 913 bp，respectively． They are predicted to encode
five proteins，open reading frame ORF1 encoding replication associated protein(RepA)，ORF5 encoding binding protein
(SSB) and ORF2 － 4 encoding given unknown function proteins． pMDPy is the first plasmid determined from mulberry
dwarf phytoplasma． Sequence analysis of non-coding regions (NCR) of the four kinds of plasmids revealed that the NCR
sequences between ORF1 and ORF2 existed promoters and ribosome binding sites． The four phytoplasmal plasmid
sequences were compared with the phytoplasmal plasmid sequences found in GenBank through multiple alignments and
phylogenetic analysis; the results showed that these four plasmids and other 16Sr I group plasmid could be grouped into a
large branch，which is consistent with the phylogenetic tree created from 16S rDNA comparisons． This research would not
only provide further insight into the different phytoplasmal plasmid structure and function，host specificity and plasmid
variation and evolution within different phytoplasma species or strains，but also offer new theoretical basis for a multiple
genes and index-based system for phytoplasmal classification．
Key words: phytoplasma; complete circular plasmid; sequence analysis; phylogenetic analysis
第 4 期 胡佳续等: 4 种植物病害植原体病原质粒全序列测定及分子特征
植原体 ( Phytoplasma)是日本学者土居养二在
1967 年发现的(Doi et al．，1967)，是一类无细胞壁、
不能人工培养的原核微生物，寄生于植物韧皮部筛
管及刺吸式介体昆虫的肠道、淋巴及唾腺等组织内，
由叶蝉 ( Cicadella viridius ) 和 蝽 蟓 ( Halyomorpha
mista)等刺吸式昆虫传播，也可通过嫁接和菟丝子
(Cuscuta chinensis)等传播 (廖晓兰等，2002; 车海
彦等，2006)。植原体能够引起植物丛枝、黄化、簇
生、矮化、顶枯等症状。目前世界上报道的植原体病
害已有 1000 多种，给农林业生产带来了严重的经济
损失(Welliver，1999)。
泡 桐 ( Paulownia sp． ) 丛 枝 病 ( Paulownia
witches’－ broom disease)是一种由泡桐丛枝植原体
(Paulownia witches’－ broom phytoplasma)引起的侵
染性病害，症状主要表现为腋芽和不定芽大量萌发
至簇生成团，外观似鸟巢，有些病树上会出现花变叶
症状，常常不能正常开花。林彩丽(2009)从泡桐丛
枝植原体南阳株系中克隆并测定了 2 种质粒
pPaWBNy － 1 和 pPaWBNy － 2。 长 春 花
(Catharanthus roseus)为夹竹桃科观赏性草本植物，
已报道的自然侵染长春花的植原体株系在目前分类
体系中分别属于不同的 16Sr 组或亚组 (蔡红等，
2003)。宋传生(2009)测定了我国海南长春花绿变
植原体 1 种质粒的部分序列。陈泠伶 (2010)从台
湾长春花叶黄化植原体株系中测定出 5 种质粒，分
别为 p05PLY － 1、p05PLY － 2、p08PLY － 1、p09PLY
－ 1 和 p09PLY － 2。桑树 ( Morus alba ) 萎缩病
(Mulberry dwarf disease)是以植原体为病原的桑树
重要病害，在我国各大蚕区均有分布。目前由于没
有有效的治疗药物，所以该病又称为桑树的癌症( Ji
et al．，2009; 张合禹等，2010)。至今未见有桑萎缩
植原体质粒的研究报道。由植原体引起的苦楝
(Melia azedarach)丛枝病表现为枝条节间缩短，侧
枝丛生，叶片变小且黄化，生长缓慢，常导致苦楝大
量死亡，严重影响林业经济的发展 ( 陈作义等，
1984; 金开璇等，1982; 徐梅卿等，2008)。宋传生
等(2011)测定了苦楝丛枝植原体福清株系的一个
4 446 bp的质粒 pCWBFq。
质粒是染色质外的遗传物质，植物病原菌的质
粒通常编码与致病性和昆虫介体传播等相关的基因
(Vivian et al．，2001)。质粒可以通过获得或丢失功
能基因来适应变化的环境，因此寄主菌质粒 DNA 进
化速 度 比 染 色 体 DNA 更 快 ( Eberhard， 1990;
Sundin，2007)。目前，已被测序和发表的植原体质
粒有 29 个，它们大部分为环状，线状质粒很少。在
这些质粒的基因中，Rep、dnaG、ssb 对质粒的自我复
制起作用，cop 影响质粒的拷贝数，在某些植原体
中，致病能力与质粒的拷贝数可能有关联(Hisashi et
al．，2001)。除了复制相关基因外，植原体质粒编码
的绝大多数蛋白为膜蛋白与分泌蛋白，它们可能影响
植原体与寄主的互作以及介体昆虫的传播(Yoshiko
et al．，2009)。根据植原体质粒编码的 Rep 蛋白将植
原体质粒分为 2 类，一类质粒编码与双生病毒
(geminiviruses)类似的 Rep，另一类质粒编码与 pLS1
家族相似的复制相关蛋白(Oshima et al．，2001)。
国内外关于植原体质粒相关研究较少，特别是
质粒对于植原体繁殖、致病性以及与寄主互作的影
响都有待深入研究( Lin et al．，2010)。目前分别从
16Sr I、16Sr II、16Sr VI、16Sr XI 及 16Sr XII 组植原
体中测定了 20，3，2，1 和 3 种质粒，其余组植原体未
见有质粒的报道。
本研究测定比较了苦楝丛枝、长春花绿变、桑萎
缩及泡桐丛枝植原体上各一个质粒的完整 DNA 序
列，利用信息学软件预测并分析了所编码蛋白的结
构与功能，进一步明确该植原体分类地位，为植原体
快速检测和鉴定、质粒基因结构和功能以及致病机
制等研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
长春花绿变海南株系和泡桐丛枝植原体山东株
系保存在本实验室组培苗上，分别编号为 PeVHn 和
PaWBG33D(田国忠等，2005); 苦楝丛枝病材料采
自福建省福清市，编号 CWBFq; 桑树萎缩病材料采
自河南濮阳市，编号 MDPy。
1. 2 方法
1. 2. 1 总 DNA 的提取 参照天根公司所制的植物
基因组 DNA 提取试剂盒所附说明书(DP305 － 02)。
1. 2. 2 质粒扩增和序列测定 根据已发表植原体
质 粒 pAYWB － IV ( CP000065 )、 EcOYNIM
(AB097150)、pPaWBNy － 1(EF426472)序列比对的
结果设计引物 pF1fwd /pF1rev(表 1)。以感病的苦
楝、桑树、泡桐和长春花总 DNA 为模板，进行 PCR
扩增，分别获得质粒片段 pCWBFq － 2 F1、pMDPy
F1、pPaWBG33D F1 和 pPeVHn F1，然后根据所得到
片段的序列设计引物 pF2 － 1fwd、pF2 － 2fwd、pF2 －
3rev 和 pF2 － 4rev，利用引物对 pF2 － 1fwd /pF2 －
3rev 从罹病的苦楝和桑树中分别扩增到质粒片段
pCWBFq － 2 F2 和 pMDPy F2，利用引物对 pF2 －
2fwd /pF2 － 3rev 和 pF2 － 2fwd /pF2 － 4rev 分别从患
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林 业 科 学 49 卷
病的泡桐和长春花中扩增到质粒片段 pPaWBG33D F2 和 pPeVHn F2。
表 1 本研究设计的引物及 PCR 条件
Tab． 1 Primers and PCR conditions in this study
扩增片断名称
Name
引物名称
Primer pair
引物序列
Primer sequence(5’－ 3’)
产物长度
Product size / bp
退火温度
Annealing /℃
延伸时间
Extension
pCWBFq － 2 F1
pF1fwd
pF1rev
GAAAAATATACTAATAACGANGG
TATTTCACCANCATTAGTATTAATA
3 675 50 5 min
pMDPy F1
pF1fwd
pF1rev
GAAAAATATACTAATAACGANGG
TATTTCACCANCATTAGTATTAATA
3 608 50 5 min
pPaWBG33D F1
pF1fwd
pF1rev
GAAAAATATACTAATAACGANGG
TATTTCACCANCATTAGTATTAATA
3 598 50 5 min
pPeVHn F1
pF1fwd
pF1rev
GAAAAATATACTAATAACGANGG
TATTTCACCANCATTAGTATTAATA
3 700 50 5 min
pCWBFq － 2 F2
pF2 － 1fwd
pF2 － 3rev
CTTGCTGTTGCAGTTTTAGG
GAATANGTTAAAAAGATATCTTTGG
484 50 30 s
pMDPy F2
pF2 － 1fwd
pF2 － 3rev
CTTGCTGTTGCAGTTTTAGG
GAATANGTTAAAAAGATATCTTTGG
485 50 30 s
pPaWBG33D F2
pF2 － 2fwd
pF2 － 3rev
GGAATTCAAATTATGATAACGATG
GAATANGTTAAAAAGATATCTTTGG
596 50 30 s
pPeVHn F2
pF2 － 2fwd
pF2 － 4rev
GGAATTCAAATTATGATAACGATG
AAAATAAGGCGTTTTTAGAGGTATTA
603 50 30 s
PCR 扩增及测序方法如下。25 μL 总体积:
DNA 1 μL，2xTaq MIX 12. 5 μL，ddH2 O 1 μL，10
mmol·L － 1正反向引物各 0. 5 μL。扩增步骤为: 预
变性，94 ℃，4 min; 变性，94 ℃，30 s，退火和延伸温
度见表 1，共 35 次循环; 最后延伸，72 ℃，10 min。
PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，阳性 PCR 产物
送博迈德基因公司测序。
1. 2. 3 序 列 比 对 和 蛋 白 特 征 预 测 利 用
DNAMAN6. 0 软 件 进 行 序 列 装 配，采 用 BLAST
(Basic Local Alignment Search Tools)工具 ( http: / /
www． ncbi． nlm． nih． gov / balst /)分析序列同源性，采
用标准遗传密码的 NCBI ORF 寻找器(http: / /www．
ncbi． nlm． nih． gov / gorf / gorf． html)预测可读框，使用
DNAMAN 进 行 序 列 比 对，进 化 树 分 析 采 用
MEGA4. 1(MolecμLar Evolutionary Genetics Analysis，
version 4. 1)，启动子预测采用在线启动子预测软件
SoftBerry ( http: / / linux1． softberry． com /berry．
phtml)。
2 结果与分析
2. 1 质粒片段的 PCR 扩增与序列测定
在患病的植物总 DNA 中，扩增到长度为 3 675
bp 的片段 pF1CWBFq － 2 F1，3 608 bp 的 pMDPy
F1，3 598 bp 的 pPaWBG33D F1，3 700 bp 的 pPeVHn
F1，484 bp 的 pCWBFq － 2 F2，485bp 的 pMDPy F2，
596 bp 的 pPaWBG33D F2 和 603 bp 的 pPeVHn F2。
在健康植物总 DNA 中均没有扩增到特异性片段
(图 1)。
图 1 4 种植原体的质粒片段的 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳
Fig． 1 PCR amplification of the plasmid fragments of four phytoplasmas and agarose gel electrophoresis
A． M: Marker Ⅲ; 1，3，5，7: pPaWBG33D F2，pMDPy F2，pCWBFq － 2 F2，pPeVHn F2;
Lane 2，4，6，8: 健康对照 Healthy control; Lane 9: 空白对照 None template control．
B． M: Marker Ⅲ; 1，3，5，7: pPaWBG33D F1，pMDPy F1，pCWBFq － 2 F1，pPeVHn F1;
Lane 2，4，6，8: 健康对照 Healthy control; Lane 9: 空白对照 None template control．
2. 2 4 种植原体的质粒序列分析
利用 DNAMAN 软件分别对不同植原体的测定片
段进行拼接装配，得到 4 种环状质粒，分别是3 833 bp
的桑树萎缩植原体濮阳株系质粒，命名为 pMDPy; 长
29
第 4 期 胡佳续等: 4 种植物病害植原体病原质粒全序列测定及分子特征
度为3 913 bp的苦楝丛枝植原体福清株系质粒，命名为
pCWBFq －2; 长度为3 843 bp的泡桐丛枝植原体山东
株系质粒，命名为 pPaWBG33D; 长度为3 943 bp的长春
花绿变植原体海南株系质粒，命名为 pPeVHn(图 2)。
序列分析表明，质粒 pMDPy、pPaWBG33D、pCWBFq － 2
及 pPEVHn 的 A + T 含量分别为 72. 56%，74. 12%，
72. 3%和 75. 78%。预测此 4种质粒序列在同一条链的
同一方向均有 5 个编码蛋白，且都大于 100 个氨基酸。
将每个质粒 ORF1 上第 1 个核苷酸的位置定位为 1，
ORF5编码单链结合蛋白(single-stranded DNA binding
protein，SSB)，ORF1 编码复制相关蛋白 ( replication
associated protein，RepA)。
图 2 质粒 pCWBFq － 2、pMDPy、pPaWBG33D 及 pPeVHn 示意
Fig． 2 Schematic diagrams of the plasmids pCWBFq － 2，pMDPy，pPaWBG33D and pPeVHn
从 4 种质粒的 ORF 组织结构看，pMDPy、
pPaWBG33D 和 pCWBFq － 2 更加相似，这 3 种质粒
ORF1 和 ORF2 之间的非编码区的序列最长，大小在
816 ～ 821 bp 之间。而质粒 pPeVHn 的 ORF1 和
ORF2 间的非编码区的序列仅为 254 bp; pMDPy、
pPaWBG33D 和 pCWBFq － 2 的 ORF5 和 0RF1 之间
的非编码区仅有 48 bp 左右，而 pPEVHn 中相对应
的序列为 724 bp。
2. 3 4 种植原体编码的蛋白质序列同源性比较
对此 4 种不同植原体 质粒编码的蛋白 与
GenBank 等数据库进行同源性比对，表 2 列出了 4 种
质粒的每一个 ORF 所编码蛋白质氨基酸序列的比对
结果。结果显示，pPaWBG33D 与以前测定的泡桐丛
枝植原体南阳株系质粒 pPaWBNy － 2 的氨基酸序列
同源 性 最 高，其 中 pPaWBG33D 的 SSB 蛋 白 与
pPaWBNy － 2 的相似值为 100% ( Lin et al．，2008)。
pCWBFq － 2 比 pCWBFq 短 544 bp，且少一个 ORF，应
为苦楝丛枝植原体上新发 现的 一个 质 粒。与
pCWBFq － 2 的编码蛋白 RepA、P2、P4 及 SSB 相似值
最高的分别为 pCWBFq 的 RepA、P3、P5 及 SBB，可能
这 2 种质粒间存在共同的进化起源; 而 pCWBFq － 2
的 P2 与洋葱 ( Omanense sp． )黄化野生型的质粒
pOYW 编码的蛋白同源性最高，序列一致性为
47. 21%。从桑树萎缩植原体中首次测定的质粒
pMDPy，其编码的 5 个基因均与 pCWBFq 相对应的基
因有最高的相似性，其中 ORF4 与 pCWBFq 对应的序
列同源性达到 95. 24%。前述 3 种植原体质粒之间显
示较高的序列相似性，而 pPeVHn 明显与这 3 种质粒
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林 业 科 学 49 卷
的关系要远，而与 pOYW 和 pOYM 及台湾报道的长 春花黄化植原体质粒 p05PLY － 2 关系更近。
表 2 4 种质粒编码的蛋白质分子特性
Tab． 2 Molecular characteristics of four kinds of phyotplasma plasmids
预测阅读框
Predicted ORF 位置
Position
氨基酸数量
Number of
amino acids
同源性蛋白
Homogeneous
protein
匹配质粒蛋白
Matched
plasmid protein
最大相似度
Maximal
similarity(% )
pCWBFq － 2 ORF1 ( pCWBFq REP) 1—1104 367 AEC45506 pCWBFq 92. 37
pCWBFq － 2 ORF2 ( pCWBFq P2) 1926—2435 168 AEC45508 pCWBFq_p3 73. 37
pCWBFq － 2 ORF3 ( pCWBFq P3) 2401—2961 185 BAH20797 pOYW 47. 21
pCWBFq － 2 ORF4 ( pCWBFq P4) 2964—3533 188 AEC45510 pCWBFq_p5 99. 47
pCWBFq － 2 ORF5 ( pCWBFq SSB) 3552—3866 103 AEC45511 pCWBFq 99. 04
pMDPy ORF1 ( pMDPy REP) 1—1104 367 AEC45506 pCWBFq 91. 28
pMDPy ORF2 ( pMDPy P2) 1930—2397 155 AEC45508 pCWBFq_p3 83. 87
pMDPy ORF3 ( pMDPy P3) 2401—2880 159 AEC45509 pCWBFq_p4 54. 69
pMDPy ORF4 ( pMDPy P4) 2883—3452 189 AEC45510 pCWBFq_p5 95. 24
pMDPy ORF5 ( pMDPy SSB) 3471—3785 103 AEC45511 pCWBFq 93. 27
pPaWBG33D ORF1 ( pPaWBG33D REP) 1—1104 367 ABR08382 pPaWBNy － 2 99. 73
pPaWBG33D ORF2 ( pPaWBG33D P2) 1928—2419 163 ABR08383 pPaWBNy － 2 97. 55
pPaWBG33D ORF3 ( pPaWBG33D P3) 2406—2990 194 ABR08384 pPaWBNy － 2 99. 48
pPaWBG33D ORF4 ( pPaWBG33D P4) 2993—3454 153 ABR08385 pPaWBNy － 2 99. 34
pPaWBG33D ORF5 ( pPaWBG33D SSB) 3481—3795 104 ABR08386 pPaWBNy － 2 100
pPeVHn ORF1 ( pPeVHn REP) 1—1135 377 BAD04752 pOY-M 88. 06
pPeVHn ORF2 ( pPeVHn P2) 1400—1885 161 BAH20796 pOYW 87. 73
pPeVHn ORF3 ( pPeVHn P3) 1878—2324 148 AEA36722 p09PLY － 2 61. 07
pPeVHn ORF4 ( pPeVHn P4) 2324—2878 184 BAH22131 pOY-M 71. 74
pPeVHn ORF5 ( pPeVHn SSB) 2902—3216 104 AEA36708 p05PLY － 2 94. 23
4 个质粒的 RepA 蛋白和 SSB 蛋白与其他质粒
的相似度较高，且都在 88% 以上。 pCWBFq － 2、
pMDPy、pPeVHn 的 P3 蛋白与其他质粒编码的蛋白
相似度较低，其中 pCWBFq － 2 的 P3 蛋白与 pOYW
编码的蛋白相似值仅为 47. 21%。
对质粒编码的 5 个蛋白分别进行比对，结果显
示 pPaWBG33D RepA 蛋白与 pPaWBNY － 2 RepA 相
似性最高达 99. 7%，与 pPaWBNY － 1 RepA 的相似
性仅为 72. 3% ; pMDPy RepA 蛋白与 pCWBFq － 2
RepA 的相似性达 97%，与宋传生等(2011)测定的
pCWBFq RepA 相似性为 91. 3% ; pCWBFq － 2 RepA
与 pCWBFq RepA 相似性为 92. 4%。4 种质粒的
RepA 蛋白之间的序列相似值变化很大，在 11. 6%
～ 97%之间，其中 pPeVHn 与台湾报道的长春花黄
化植原体质粒 p05PLY 的同源性达 81. 2%，并与
pAYWB-II( 70. 8% )、pAYWB-IV ( 75. 1% ) 及 pCPa
(60. 3% )有较高的一致性，而与质粒 pCWBFq － 2、
pMDPy 和 pPaWBG33D 的相似值仅为 11. 6% ～
12. 2%之间，与其他质粒的 RepA 的相似值也在
10. 2% ～ 12. 7% 之间。质粒 pCWBFq － 2、pMDPy 和
pPaWBG33D 之间的 Rep 相似性在 88% ～ 97%之间。
17 个不同植原体质粒上的 SSB 蛋白之间表现
出相对较高的序列相似性，相似值最低为 74%，而
最高的达 100%。其特点是除 pAYWB-III SSB 序列
长度为 120 个氨基酸外(末端多出 16 个氨基酸，
KGVIEKEPKSFDDWV)，其余质粒的 SSB 长度皆为
104 个氨基酸。16Sr I 组植原体质粒起始端 16 个氨
基酸完全相同，而所测定的 4 种质粒的起始端 37 个
氨基酸完全一致; 如，洋葱黄化植原体质粒 pOYM
SSB 与 pMDPy、pCWBFq 及 p05PLY2 的 SSB 同源性都
为 74%，所测定的 4 种质粒 pPaWBG33D、pCWBFq －
2、pPeVHn 及 pMDPy 的 SSB 蛋白之间的序列同源性
在 87. 5% ～ 93. 3%之间，可能反映了它们关系较近但
却是不同种类的植原体。
质粒编码蛋白 P3(ORF3)氨基酸序列虽然存在
多个明显的保守区域或结构域，但不同植原体不同
质粒间的序列的变异却很大，所比对的 15 个 16Sr I
组植原体质粒 P3 序列的相似性在 28. 1% ～ 99. 5%
之间，pPeVHn、pCWBFq － 2、pMDPy 和 pPaWBG33D
间的相似性在 34. 1% ～ 67. 1% 之间。序列的长度
从 144 至 200 个氨基酸不等。不同质粒的该编码蛋
白末端序列无论是长度还是氨基酸种类皆表现出高
度的变异性; pPaWBG33D 与 pPAWBNy － 2 的氨基
酸序列相似性最高，为 99. 5%，仅有一个氨基酸的
差异(50 位异亮氨酸 I /苏氨酸 T)，与 pAYWB － I 为
99. 48%，有 2 个 氨 基 酸 差 异。 pAYWB － II 与
pAYWB － IV 为 98. 7% (2 个是氨基酸差异)，pOYW
与 EcAYWB 为 95. 2% ( 7 个位点，9 个氨基酸变
49
第 4 期 胡佳续等: 4 种植物病害植原体病原质粒全序列测定及分子特征
异)，pOYNIM 与 pEcAYWB 为 95. 1% (5 个差异)。
最低的 pOYW 与 pAYWB － II 为 28. 1%，pAYWB －
II 与 EcAYWB 为 28. 8%。
2. 4 质粒 DNA 全长序列和单基因系统进化分析
构建质粒 DNA 全序列的系统发育树，结果显示
(图 3)，这 4 种质粒与其他 16Sr I 组的质粒聚为一
个大的分支。pPaWBG33D 与 pPaWBNy － 2 最近，归
为 16Sr I 组 D 亚组。 pMDPy 和 pCWBFq － 2 与
pCWBFq 最近，pPeVHn 与台湾报道的长春花黄化植
原体的 5 种质粒及 pOYW 关系最近。在亚组水平
上，基于 16Sr DNA 序列的同源性已把 CWB、MD 划
分为 16Sr I 组 B 亚组，但质粒的进化分析结果显示
CWB 和 MD 更接近于 D 亚组的 PaWB。
对这 4 种质粒编码的每个氨基酸序列分别进行
进化分析，结果与用完整 DNA 序列分析的结果基本
一致。同时进一步肯定了 pPaWBG33D 与 pPaWBNy
－ 2 最近，表明 pPaWBG33D 与 pPaWBNy － 2 可能是
泡桐丛枝植原体不同地理株系的相同种类的质粒。
pMDPy 与 pCWBFq 关系更近，而与 pPaWB 较远。
由于苦楝丛枝植原体福州株系的 pCWBFq － 2 与该
株系上已测定的质粒 pCWBFq ( 4 446 bp)关系最
近，但大小比 pCWBFq 短了544 bp，且少一个 ORF，
所以判断 pCWBFq － 2 为苦楝丛枝植原体中新发现
的第 2 种质粒。与用完整 DNA 序列分析的结果类
似，各预测蛋白氨基酸列进化分析结果也进一步显
示了在 16Sr I 组植原体的质粒中，海南长春花绿变
植原体与另外 3 种亚热带或温带植物上发生的植原
体进化关系更远。
图 3 基于质粒全长序列所建立的系统发育树
Fig． 3 Bootstrapped phylogenetic analysis for phytoplasmal plasmids based on the
full-length sequences of all given plasmids
2. 5 质粒非编码区序列分析
在质粒 pMDPy、pCWBFq － 2 和 pPaWBG33D 序
列中，ORF1 与 ORF2 之间的非编码区序列最长，相
似度较高，在 71% 到 89% 之间。在 pPeVHn 序列
中，2 段最长的非编码序列分别与质粒 pMDPy、
pCWBFq － 2 和 pPaWBG33D 最长非编码区的部分
序列有较高的相似性。与 pMDPy、pCWBFq － 2 和
pPaWBG33D 相比，pPeVHn 中 5 个基因的顺序没有
变化，但个别基因可能会在质粒进化过程中出现位
移或重组。
59
林 业 科 学 49 卷
采用在线启动子预测发现，pMDPyORF1 －
ORF2 间隔区的序列长度为 816 bp，共预测到 3 个启
动子序列和 1 个核糖体结合位点(AAAGGAGTA);
pCWBFq － 2 的 ORF1 － ORF2 间隔区的序列长度为
821 bp，预测到 2 个启动子序列; pPeVHn 中 ORF1
－ ORF2 间隔区的序列长度为 254 bp，预测到 1 个可
能的启动子，ORF5 － ORF1 间隔区的序列长度为
727 bp，预测到 2 个启动子和 2 个可能的核糖体结
合位点(AGAGG 和 AAAGGAGTA); 在 pPaWBG33D
中，ORF1 － ORF2 间隔区的序列长度为 869 bp，共预
测到 3 个可能的启动子。
3 讨 论
本研究测定及分析了采自不同地区的 4 种 16Sr
I 组植原体中各 1 种质粒的完整 DNA 序列。其中桑
树萎缩植原体的 1 种质粒为该植原体上首次测定。
pCWBFq － 2 苦 楝 丛 枝 植 原 体 福 清 株 系 中 与
pCWBFq 不同的质粒。虽然之前已有关于我国长春
花绿变植原体海南株系质粒部分序列的测定结果，
但本研究完成了一个环状质粒分子的序列测定。本
研究所测定的泡桐丛枝植原体质粒 pPaWBG33D 来
源于保存在中度抗病泡桐无性系 MB33 组培苗上的
植原体山东株系，而之前 Lin 等(2009) 2 种所测定
的两个质粒 pPaWBNy － 1 和 pPaWBNy － 2 来源于保
存在感病泡桐无性系中林 3 号组培苗中的河南南阳
株系，pPaWBG33D 与 pPaWBNy － 2 可能是相同的质
粒，序列的差异可能与 2 菌株因不同地理和繁殖寄
主作用下的遗传变异有关(田国忠等，2005)。
本研究在扩增植原体质粒片段时，所设计的引
物序列位于质粒上最保守的 ssb 区域，因而可以同
时扩增和检测这 4 种属于 16Sr I 组的不同亚组的植
原体质粒。该研究采用 1 对通用引物( Plasmid2F /
Plasmid2R)先扩增到了这 4 种质粒约 94%的核苷酸
序列，测序后根据末端序列设计 4 种质粒的特异性
引物，扩增出约 200 bp 的小片段。这种方法的优点
是采用此通用引物可以对含有 ssb 的质粒的大部分
序列进行快速准确的测序。从大量植原体株系中鉴
定特异质粒并寻找突变菌株，从而更好地研究植原
体的致病机制、寄主专化性和质粒基因转移与重组
规律; 也有助于高效快速地获得完整质粒并转化到
其他菌株细胞内，以深入研究其致病相关性。也可
以为植原体的多指标、多基因分类提供新的理论依
据。由于 ssb 基因仅在 16Sr I 组植原体质粒中被发
现(宋传生等，2011)，所以该方法可能不适用于其
他组植原体的质粒研究。由于 16Sr I 组植原体是众
多植物病害的病原，用此法对该组植原体质粒进行
的快速鉴定研究会有较大的应用前景 ( Lee et al．，
2004)。
以质粒全序列构建的进化树和 16S rDNA 序列
系统发育树基本一致，验证了基于质粒基因的系统
进化分析与染色体 16S rDNA 的分类结果在一定范
围内存在一致性。在亚组水平上，根据 16S rDNA
序列，已把 CWB、MD 划为 16Sr I 组 B 亚组，但质粒
全序列分析结果显示，其更接近于 D 亚组的 PaWB。
由于长春花可感染多种植原体且表现类似的症状，
因而不同地区的所鉴定的植原体可能属于不同的
16Sr 组或 16Sr I 组内的不同亚组。在目前发现的
24 个植原体质粒中，序列变异非常明显，相似性在
11% ～ 99%之间(图 6)，这种变异的产生可能与植
原体对不同寄主植物和介体昆虫的选择以及对不同
地理生态环境的适应有关系(Liefting et al．，2006)。
已知植原体质粒编码的 Rep 蛋白分为质粒编
码与双生病毒 ( geminiviruses) 类似的 Rep ( Gibbs
et al．，2006)和与 pLS1 家族相似的复制相关蛋白
(Hisashi et al．，2001)。因而，根据本研究对 4 种质
粒的 rep 编码蛋白氨基酸序列的分析比对结果分析
推断，pMDPy、pPaWBG33D 和 pCWBFq － 2 应与
pAYWB － I 和 III、EcOYW1 和 2 一样，属于质粒编码
与双生病毒( geminiviruses)类似的 REP，而 pPEVHn
则与 pOYW 和 pAYWII 和 IV 一样，所编码的蛋白质
与 pLS1 家族相似 ( Saccardo et al．，2011; Shigetou
et al．，2001)。
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链
DNA 分子，能稳定地独立存在于染色体外，具有自
主复制、传给子代、丢失及在细菌间转移等特性，与
细菌的遗传变异有关，一般不整合到宿主染色体上。
质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状，如
性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等，通常不携带宿主
菌在正常条件下生长的必须基因 ( Barbara et al．，
2009)。在植原体中，质粒可能参与了植原体存活、
致病以及与寄主的互作，而且对致病性和介体昆虫
传播有影响。质粒易于通过获得或丢失功能基因以
适应环境的变化，因此进化速度快于比宿主染色体
DNA。在某些植原体中质粒的拷贝数也有可能影响
植原体的致病能力，这对质粒的研究是非常重要的。
本研究测定的每个质粒的 5 个 ORF 中，只有 ORF1
和 ORF5 为已知功能基因，其余 3 个功能未知。Lin
等(2009)和宋传生等 (2011)的研究都预测了这 3
个蛋白皆为分泌型蛋白，具有明显的跨膜区域，已通
过原核细胞表达了改蛋白，并通过 Western blot 技术
证明 pPaWBNy － 1 的 ORF4(与本研究中的 ORF3 同
源)基因能够在发病的泡桐植株中表达。P3 的同源
69
第 4 期 胡佳续等: 4 种植物病害植原体病原质粒全序列测定及分子特征
蛋白在洋葱黄化植原体中有较多的研究，并被证实
与介体昆虫的传播特性有关。Shigetou(2001)发现
质粒 pOYM ORF3 编码蛋的白是具有 2 个跨膜螺旋
的膜蛋白，推测包括 ORF3 在内的膜蛋白可能在与
介体昆虫的互作中发挥功能。 Ishii 等 (2009)通过
免疫 组 织 化 学 分 析 证 明 OY-NIM 植 原 体 的
EcOYNIM 的 ORF3 不能够被翻译成蛋白是由于启
动子的缺失和突变造成的，这导致了植原体 OY-
NIM 不能被介体昆虫传播。从以上 3 个 ORF 编码
蛋白氨基酸序列的变异程度可以推断，这些基因可
能与植原体的致病性、寄主和介体专化性及对环境
变化的适应性有更密切的关系。
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(责任编辑 朱乾坤)
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