全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$ % & % 年 # 月
林 业 科 学
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/012 !"，+02 #
345，$ % & %
多拷贝 !"#基因对转基因杨树生长及内源激素的影响!
郝6 宇&，7 6 梁海永$ 6 杨敏生$
（&2 河北农业大学园林与旅游学院 6 保定 %8&%%%；$2 河北农业大学林学院 6 保定 %8&%%%；
72 天津国土资源和房屋职业学院艺术设计系 6 天津 7%%$8%）
摘 6 要：6 对转入多拷贝 !"#$、!"#% 基因的三倍体毛白杨进行高生长量、生根率和内源激素（ )--、-9-）含量等指标
的测定，以研究多拷贝 !"# 基因在转基因植物中的表达。结果显示：转 :; 质粒三倍体毛白杨再次分别转入 !"#$、
!"#% 基因后，部分株系试管苗的生长受到了抑制，但各株系生根率均有不同程度提高；!"#$ 基因转化植株的内源
)-- 平均含量高于 !"#% 基因转化植株，其 )-- < -9- 值亦高于 !"#% 基因转化植株。试验结果表明 !"# 基因的多拷贝
促使转化植株快速大量生成毛状根。
关键词：6 !"# 基因；三倍体毛白杨；生长；内源激素
中图分类号：’8&=2 !7；’8&=2 !"6 6 6 文献标识码：-6 6 6 文章编号：&%%& > 8!==（$%&%）%# > %%#= > %"
收稿日期：$%%? > %7 > 7%。
基金项目：“十一五”国家高技术研究发展计划（="7 计划）项目（$%%?--&%@&%8）；教育部博士点基金资助项目（$%%8%%="%%!）。
!杨敏生为通讯作者。
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6 6 $% 世纪 =% 年代以来，国内外学者对发根农杆
菌 :; 质粒及其 !"# 基因进行了广泛深入的研究。至
今已成功地利用 :; 质粒对多个科属的许多草本植
物及一些林木与果树如毛白杨（A"/4#4- 5"=&+5"-*）、
杂交杨、刺槐（ ?"93+3* /-&4,"*.*.3*）、欧洲落叶松
（)*!3B ,&.3,4*）、苹果（C*#4- /4=3#*）、墨西哥酸橙
（%35!4- *4!*+534=）等进行了转化（周达锋等，&??7；
(GI;FKH5，$%%&）。然而，在 !"# 基因表达的性状中，既
有改良目的所需要的，也存在对育种目标不利的性
状，如对多数植物导入 !"#2、!"#$ 和 !"#% 基因后，虽
然能显著改善植株的生根能力，但常伴随着顶端优
势减弱，节间缩短，叶片卷皱等不良性状（陶爱群
等，$%%"），限制了其应用。因此，研究多拷贝 !"# 基
因在转基因植物中的表达及对形态、生长及内源激
素等的影响，对于 !"# 基因的利用具有重要意义。
三倍体毛白杨是我国培育的优良新品种，生长
快速，材质优良，应用前景广泛（朱之悌等，&??#）。
但由于三倍体树种不能用种子繁殖，扦插不易成活
（刘德良等，$%%8），其快速、大面积繁殖和推广应用
受到了严重制约。通过转化 !"# 等生根相关基因，培
育易生根三倍体毛白杨新品种，对于降低育苗成本、
加快优良品种的繁育和推广具有推动作用。刘兴菊
（$%%#）将发根农杆菌 :; 质粒 7%&!= 菌株转入三倍
体毛白杨植株中，也使三倍体毛白杨植株生根能力
得到了显著的提高。本研究将 :; 质粒上 ,PX+- 区
中决定植物毛根形成并影响植株形态的 !"#$ 和 !"#%
$ 个重要基因进行克隆并分别导入转 :; 质粒的三
倍体毛白杨植株中，使 !"#$ 和 !"#% 基因在转 :; 质
粒三倍体毛白杨基因组中形成多拷贝，与已转入的
!"#$ 和 !"#% 基因的表达情况进行对比分析。
! 第 " 期 郝 ! 宇等：多拷贝 !"# 基因对转基因杨树生长及内源激素的影响
#! 材料与方法
!" !# 材料
$ 个转 %& 质粒 ’()*+ 的三倍体毛白杨株系
,-，.# 和 ## 及在此基础上再转 !"#$ 基因获得的 #/
个转基因株系和转 !"#% 基因获得的 #- 个转基因株
系组培苗，对照三倍体毛白杨组培苗。
!"#$ 基因的载体为由 !"#$ 启动子（ 012345 &’
(#6，#77/）驱动 !"#$ 基因和由 !"#$ 启动子驱动 )*+
基因的植物表达载体 2089(9：:;<，质粒携带有
,-’!选择标记基因；!"#% 基因的载体为由 -"< 启
动子驱动 !"#% 基因的植物表达载体 2=0>..$(
018>0，质粒携带有 ,-’!基因和 ./-% 基因（以上
载体由河北农业大学林业生物技术实验室提供）。
!" $# 方法
#? $? #! 转基因组培苗的检测 ! 对转基因三倍体毛
白杨各株系试管苗的目的基因和标记基因进行
=0% 检测和组织化学染色检测。
#? $? $! 转基因组培苗的生长形态测定 ! 将转基因三
倍体毛白杨各株系试管苗的茎段和对照试管苗的茎
段（长 # @ $ AB）在无菌条件下接种于不含植物生长
调节剂的 8<. 培养基上，每瓶接种 - 株，每个处理 #.
瓶，温度（$" C -）D，光照强度# ".. @ $ ... EF，每天光
照时间为 #/ G，于接种后第 H，#.，#- 天调查各株系的
生根情况，第 $" 天调查高生长情况。
#? $? -! 转基因组培苗内源激素测定 ! 将转基因株
系试管苗进行真空冷冻干燥处理，材料处理后研磨
成干粉并过筛，每个株系准确称取 ". BI，备用。
内源激素提取方法：". BI 样品) 加入 $ BJ
K.L甲醇水含 #L冰乙酸的提取液 )/ D条件下浸
提 #. @ #$ G )/ D #. ... M·B&4 N #离心 #. B&4)取
# ... "J 浸提液与 H BJ 含 #L 冰乙酸的双蒸水混
匀，此时甲醇含量为 #.L )过经预处理的 0#K 柱
) 用含 #L 冰乙酸的 #.L 甲醇清洗杂质 )加入
# ... "J 含 #L冰乙酸的 K.L甲醇洗脱液 )收集
洗脱液在 #? " BJ 离心管中。
流动相：甲醇 O双蒸水（含 .? "L 冰乙酸）体积
分数为 /"P ""；流速：.? H BJ·B&4 N #；柱温：-. D；
色谱柱：岛津生产的 =(R)< 柱（$". S
/? ,，粒径 /? ,"B）；检测波长：$"/ 4B。数据采集
和处理由 0E1TT(U2 色谱工作站自动完成。
$! 结果与分析
$" !# 转基因株系外源基因的检测
采用农杆菌介导法分 $ 次转入 %& 质粒 ’()*+
和 !"#$，!"#% 基因，对各转入基因和标记基因进行
=0% 检测（图 #）和组织化学染色检测，证明 !"#$ 和
!"#% 基因已转入三倍体毛白杨中（表 #）。
图 #! 部分转基因植株 =0% 检测结果
V&I6 #! =0% W5X5AX&34 3Y XM14TI54&A 2E14XT
基因 :545：（ 1）,-’!；（ Z）!"#$；（ A）!"#%6 8：81MQ5M )J-...；0[ N ：转 %& 质粒植株 *5I1X&U5 A34XM3E 2E14XT；
0[ \ ：质粒阳性对照 =3T&X&U5 A34XM3E 2E1TB&W；# N K：转基因植株 ’M14TI54&A 2E14XT6
$" $# 转基因株系的形态变异
对 !"# 基因多拷贝株系进行了根、茎、叶的形态
比较，发现转 %& 质粒三倍体毛白杨再分别转入 !"#$
和 !"#% 基因后，根系形态基本没有变化，大多数株
系的分枝能力增强，茎节间有不同程度的缩短，节间
距在 $ @ K BB 之间，而未转入 !"#$、!"#% 基因的转
%& 质粒三倍体毛白杨株系节间距在 " @ #. BB 之
间。大多数转 !"#$ 基因株系较未转入 !"#$ 和 !"#%
基因的转 %& 质粒三倍体毛白杨株系植株矮化，但叶
面皱缩程度减轻，叶面积增加；H$L 的转 !"#% 基因
株系叶面由皱缩变为平展（图 $）。由此可看出，
!"#$ 基因多拷贝在植株茎段中的表达得到加强，但
在植株叶片组织中，其表达则受到一定程度的干扰。
$" %# 转基因株系的生长变异
$? -? #! 高生长量的变化 ! 调查结果显示，培养 $"
天后，各转 !"#$ 和 !"#% 基因株系高生长量差异显著
（图 -）。!"#$ 和 !"#% 基因多拷贝株系高生长量均高
于对照三倍体毛白杨，其中 ".L的转 !"#$ 基因株系
高生长量超过 " AB，但转 !"#% 基因株系高生长量均
未超过 " AB，!"#$ 基因多拷贝株系中高生长量超过
7"
林 业 科 学 !" 卷 #
# # # 表 !" 各株系的转入基因及检测基因
#$%& !" #’( ()*+(,*-. +(,(. $,/ 0$+ +(,(. *1
(2(34 03$,.+(,56 75,(
系号
$%& %’ ()*+
转入基因
,-%.+*%/0 .+*+0
检测基因
12. .+*+0
34 — —
"5 6) 7(208)9 1:;$< !"#$，!"#%，&’(，⋯
=> 6) 7(208)9 1:;$< !"#$，!"#%，&’(，⋯
>> 6) 7(208)9 1:;$< !"#$，!"#%，&’(，⋯
?"5@ 1:;$< A !"#) A *+,! !"#)，*+,!，-.(
5"5@ 1:;$< A !"#) A *+,! !"#)，*+,!，-.(
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D>>3 1:;$< A !"#$ !"#$，*+,!
转 6) 质粒对照的比例是 "!F，此比例在 !"#$ 基因多
拷贝株系中是 B5F。说明在茎的伸长生长中，!"#) 基
因多拷贝下其表达所受干扰较 !"#$ 基因强些。
?G 5G ?# 生根率的变化 # 将转 !"#) 和 !"#$ 基因株系
试管苗与对照的幼嫩茎段均培养于 HI= 培养基。
图 ! 为各转基因株系组生根率随培养时间的变化趋
势。由图 ! 可以看出，转 !"#) 和 !"#$ 基因植株在 C，
>=，>5 天时的生根率呈上升趋势，但不同转基因株
系间生根率存在着一定差异。 !"#) 和 !"#$ 基因多
拷贝株系生根率均显著高于对照三倍体毛白杨，
!"#) 基因多拷贝株系生根率平均值均高于对照转
6) 质粒的三倍体毛白杨，!"#$ 基因多拷贝株系生根
率优势于第 >5 天不再明显，部分株系的生根率低于
其对照转 6) 质粒的三倍体毛白杨。在转 !"#) 基因
株系中，"5@ 组株系生根率平均值高于 =>@ 组株系；
在转 !"#$ 基因株系中，生根率较高的为 >>3 组株
系。总体比较，!"#) 基因多拷贝株系生根率高于
!"#$ 基因多拷贝株系。
89 :" 转基因植株内源激素差异
?G !G ># 转基因植株内源 J<< 含量的差异 # 从图 B
可见，!"#) 基因多拷贝三倍体毛白杨株系所含的内
源 J<< 平均含量有不同程度提高，其中 C=>@ 内源
J<< 含量最高，达 B>!G B" *.·. K >，转 6) 质粒的株系
=> 和 "5 内源 J<< 含量普遍低于转 !"#) 基因多拷贝
株系。由图 B 可见，!"#$ 基因多拷贝三倍体毛白杨
株系所含的内源 J<< 平均含量 =>3 组与 >>3 组高
于对 照 植 株，其 中 >>>3 含 量 最 高，达 5B!G ?D
*.·. K >，而 "53 组则低于对照株系。
图 ?# 转基因株系的叶形及植株形态变化
L).& ?# M+2’ 0N2O+ 2*9 O(2*P 8%QON%(%.R SN2*.+0 %’ PN+ PQ2*0.+*)S ()*+0
# # 转 !"#) 基因的转 6) 质粒三倍体毛白杨株系内
源 J<< 含量超过 ?== *.·. K >的比率是 DBG CF，而在
转 !"#$ 基因的株系中是 B=F，最高值亦出现在转
!"#) 基因的株系中，说明转 !"#) 基因植株的内源
J<< 含量普遍高于转 !"#$ 基因的株系，这与转 !"#)
和 !"#$ 基因植株高生长量的变化一致。
?G !G ?# 转基因植株内源 <@< 的变化 # 从图 " 可
见，将 !"#) 和 !"#$ 基因分别对转 6) 质粒 1:;$< 的
="
! 第 " 期 郝 ! 宇等：多拷贝 !"# 基因对转基因杨树生长及内源激素的影响
图 #! !"#$（$），!"#%（%）基因多拷贝
株系试管苗高生长量
&’() #! *+,-.+/. 0/’(0. 12 !"#$（$），!"#%（%）.3,-4(/-’5
6+,-.4 1- .’447/ 57+.73/
89%：& : ;；<#%：& : <；89=：& : >；
99=：& : "；<#=：& : >) 下同。?0/ 4,@/ A/+1B)
图 >! !"#$（$），!"#%（%）基因多拷贝
株系试管苗生根率的变化
&’() >! ?0/ 50,-(/ 12 311.’-( 3,./ 12 !"#$（$），!"#%（%）
.3,-4(/-’5 6+,-.4 1- .’447/ 57+.73/
株系 89，99 和 <# 转化后，得到 !"# 基因多拷贝株系
组 89%，89= 和 99=，其内源激素 $%$ 含量的平均值
均低于 !"# 基因单拷贝对照植株，而 !"# 基因多拷贝
株系组 <#% 与 <#= 的 $%$ 含量的平均值高于对照
植株。C 组 !"#$ 基因多拷贝株系，89% 组的 $%$ 含
量普遍高于 <#% 组植株。在 !"#% 基因多拷贝的 #
图 "! !"#$（$），!"#%（%）基因多拷贝
株系内源 D$$ 含量
&’() "! =1-./-. 12 /-E1(/-174 D$$ ’- !"#$（$），!"#%（%）
.3,-4(/-’5 6+,-.4
图 株系内源 $%$ 含量
&’() .3,-4(/-’5 6+,-.4
组株系中，<#= 组株系的 $%$ 平均含量明显低于另
C 组株系。
CF >F #! 转基因植株内源 D$$ G $%$ 的变化 ! 由图 H
可知，!"# 基因多拷贝株系组 89%，89= 和 99=，其内
源激素 D$$ 与 $%$ 比值的平均值均高于对照植株
转 I’ 质粒 ?JKL$ 三倍体毛白杨，!"# 基因多拷贝株
系组 <#% 与 <#= 的 D$$ G $%$ 平均值均低于对照。
其中，!"#$ 基因多拷贝的株系中的最高值为 H89%，
其比值为对照的 最高值为 C99=，其比值为对照 99 的 CF > 倍。
9<
林 业 科 学 !" 卷 #
图 $# !"#$（%），!"#%（&）基因多拷贝
株系 ’%% ( %&% 值的变化
)*+, $# -./*0 01 2340+23056 ’%% /0 %&% *3 !"#$（%），
!"#%（&）/7.36+23*8 9:.3/6
;# 结论与讨论
与未转基因的三倍体毛白杨相比，转 -* 质粒
<=>?%的三倍体毛白杨发生了形态变异，即生根率
均高于对照三倍体毛白杨，且侧根极为发达，但是植
株节间缩短，叶片也表现出了不同程度的皱缩现象，
与卜学贤等（@AA@）报道相一致，但组培苗生长表现
出相反趋势。一般来说，转入 !"# 基因使植株节间缩
短，生长受抑制（ B8CDE::*3+ &’ (#,，@AFF）。但本试验
中转 !"# 基因组培苗生长表现出进一步提高的趋势，
这可能是对照组培苗在不含植物生长调节剂的 GBH
培养基中生长极为缓慢，而转基因株系能够表达生
长素，有利于促进组培苗生长，使生长相对较快，但
在田间的生长表现还有待于进一步观察。
在转 -* 质粒 <=>?% 的株系中进一步转入 !"#$
和 !"#% 基因后，形成 !"#$ 或 !"#% 的多拷贝株系，与
单转 -* 质粒 <=>?% 相比，在 GBH 培养基上组培苗
生长未受明显影响，但大部分株系侧枝明显增多，组
培苗生根能力进一步提高。但多拷贝 !"#$ 和 !"#%
基因株系存在一定差异，多拷贝 !"#$ 基因株系生根
率提高明显，且株系间差异较小；多拷贝 !"#% 基因
株系生根率提高不明显，且株系间差异明显，部分株
系生根率低于单转 -* 质粒 <=>?% 株系。进一步检
测植株内源激素表明：在 !"#$ 基因多拷贝株系中，
’%% 含量平均值较对照单拷贝株系表现出略有升高
的趋势，而 %&% 含量和 ’%% ( %&% 比值在不同株系
中表现不一致，含量平均值也表现出不一致的变化
趋势；在 !"#% 基因多拷贝株系中的 ’%%，%&% 含量
和 ’%% ( %&% 比值同样表现出不一致的变化趋势。
这可能是由于 <=>?% 和 !"#$ 和 !"#% 基因在不同株
系中插入位置不同造成的（李科等，IHHF），同时也
说明多拷贝株系中内源激素的表达量并不是决定生
根率提高与否的主要因素。
一般认为，在转基因植株中外源基因拷贝数与
表达量不一定有直接关系，即拷贝数多的基因表达
量不一定高，而且多拷贝还可能造成基因的共抑制，
反而降低了基因的表达量（J.58C272/ &’ (#,，IHH@），
但也有相反结果的报道。&2:: 等（@AAA）将 !"#% 基
因转入梨（)*!+, -"..+/0,）品种‘&25772 &068’获得
的转基因植株，经鉴定包括 ; 个拷贝数不同的株系：
)I!（; 个拷贝数）、)I;（@ 个拷贝数）和 )II（I 个拷
贝数），但 ; 个株系在植株高度、节间距上均无显著
差异；转 !"#% 基因苹果砧木 G.75K.L.*405（1(#+,
2!+.03"##0( M.7, !0/4"）植株的表现型与拷贝数无关
（ ’+.7.6C* &’ (#,，IHHI）；):.453+（@AA"）在转 !"#% 基
因马铃薯（5"#(/+. ’+6&!",+.）中发现，随着拷贝数
的增加，该基因表达效果越强，但这种现象只在试管
中表现明显。在本试验中，多拷贝株系对生长影响
不明显，但进一步促进了生根能力，分析其原因可能
是 !"#$ 和 !"#% 基因拷贝数增加，提高了其表达能
力，从而促进了生根；也可能是多拷贝基因抑制了
!"#$（或 !"#%）基因的表达，但促进了其他 !"# 基因的
表达，从而出现了生根能力提高的现象。另外，转多
拷贝基因的不同株系在生长、形态、生根能力及内源
激素水平上表现并不一致，特别是转多拷贝 !"#% 基
因的株系，差异更显著，说明外源基因插入位置不同
对外源基因的表达也有很大影响。
!"# 基因转化的三倍体毛白杨表现出了丰富的
遗传多样性，且多拷贝外源基因能够进一步影响外
源基因的表达，通过这种途径可为三倍体毛白杨生
根育种提供大量原始材料，也为研究基因的功能奠
定基础。但是本试验仅以定性 NO- 检测结果为基
础，从转化植株的生长变化、激素差异角度探讨了不
同拷贝数群体间的表达差异。对于外源基因的具体
拷贝数及表达量等量化指标并未涉及，尚待进一步
研究。
参 考 文 献
卜学贤，林忠平，陈维伦 , @AA@, 农杆菌对毛白杨的转化及完整转化
植株的获得 ,植物学报，;;（;）：IH" P I@;,
李 # 科，王世全，吴发强，等 , IHHF, 农杆菌介导的转高赖氨酸蛋白
基因（ 6K!H@）水稻 P @;",
刘德良，易 # 诚，隆朝晖 , IHH$,三倍体毛白杨硬枝扦插育苗技术研
I"
! 第 " 期 郝 ! 宇等：多拷贝 !"# 基因对转基因杨树生长及内源激素的影响
究 # 南华大学学报：自然科学版，$%（&）：$& ’ $(#
刘兴菊 # $))"# *+ 质粒转化三倍体毛白杨及外源基因表达的研究 #
保定：河北农业大学硕士学位论文 #
陶爱群，谢深喜，胡春华 # $)),# 发根农杆菌 *+ 质粒 !"# 基因矮化性
状表达研究进展 # 湖南环境生物职业技术学院学报，%$（&）：
-,) ’ -,-#
周达锋，卜学贤，陈维伦 # %((-# 发根农杆菌 *+ 质粒的分子生物学及
其应用前景 #植物学通报，%)（$）：$& ’ -&#
朱之悌，林惠斌，康向阳 # %(("#毛白杨异源三倍体 .-)% 等无性系选
育的研究 #林业科学，-%（,）：&(( ’ ")"#
./00 * 1，234567 *，25+8+97:78 ;，$% &#’ %(((# <578:=45>7?+48 4=‘./@55/
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（责任编辑 ! 徐 ! 红）
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