全 文 ：第 !" 卷 第 #$ 期
% $ # # 年 #$ 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01!"!*/1#$
2345!% $ # #
毛白杨纤维素合酶基因家族部分成员的克隆及表达!
陈亚娟6王宏芝6李瑞芬6张中保6崔莉洁6魏建华
"北京市农林科学院6北京农业生物技术研究中心6北京 #$$$;"$
摘6要!6从毛白杨中分离 " 个纤维素合酶基因!分别为 @’#)%&3]!@’#)%&3^!@’#)%&3_!@’#)%&3‘!@’#)%&3[a!
@’#)%&3[_ 和 @’#)%&3[‘!通过与已公布的毛果杨全基因序列及拟南芥和水稻基因组中纤维素合酶基因序列的同源
性比对分析!结合目前纤维素合成机制的研究进展!预测毛白杨中上述不同纤维素合酶的功能& 利用 hNF/@N-IY+f
hNLS遗传分析系统分析毛白杨中纤维素合酶基因在不同组织中的转录表达水平!结果表明 @’#)%&3]! @’#)%&3_!
@’#)%&3‘! @’#)%&3[_ 和 @’#)%&3[‘ 在木质部高丰度表达!推测这些基因可能参与毛白杨次生细胞壁的形成!为毛白
杨次生细胞壁中纤维素的合成调控提供参考依据&
关键词’6毛白杨# 纤维素合酶# hNLS# 基因表达
中图分类号! &"#:1!8% ];!71%666文献标识码!,666文章编号!#$$# A"!::"%$####$ A$$"$ A$8
收稿日期’ %$## A$# A$8# 修回日期’ %$## A$! A%9&
基金项目’国家林业局 ;!: 项目"%$$: A! A%8$ #国家高技术研究发展计划"%$$;,,#$n#$#$ &
!魏建华为通讯作者&
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DFUPV4CW52FN/X4?NKCDF3DKI03/@K/FNF4V/XM//U DV3N0P0/VN! UN4NC@DFDFE4?N@/CK?/0/EW/XK0IF4VIFU M//U lPI0D4W5(F
4?DVV4PUW! MNDV/0I4NVN[NF 3N0P0/VNVWF4?IVNENFNV’ @’#)%&3]!@’#)%&3^!@’#)%&3_!@’#)%&3‘!@’#)%&3[a!@’#)%&3[_ IFU
@’#)%&3[‘ XC/@ @#=0*0&’#G%2’#&1 YWPVDFEk+‘S’kIFU YD/DFX/C@I4D3V@N4?/UV5, K?W0/ENFN4D34CNN/X3$1:-A#=&-&
’/1*-121! Y$(?1 &1’-51! @#=0*0&’$-./#.1$=1 IFU @!’#G%2’#&1 3N0P0/VNVWF4?IVNENFNVPKNCXI@D0DNVMIV3/FV4CP34NU PVDFE
4?Nf)h,!1$ KC/ECI@5hNF/@N-IY+f hNLSENFN4D3IFI0WVDVV?/MNU 4?I44?N4CIFV3CDK4D/F 0N[N0V/X@’#)%&3[_ IFU
@’#)%&3_ I0/FEMD4? @’#)%&3]!@’#)%&3‘ IFU @’#)%&3[‘ MNCN@P3? ?DE?NCDF _W0N@4?IF 4?I4DF 0NI[NVDF @!’#G%2’#&1!
D@K0WDFE4?I44?NVNENFNV@IWXPF34D/F /F VN3/FUICWMI0X/C@I4D/F5
>*9 ?,-(/’6@#=0*0&’#G%2’#&1# 3N0P0/VNVWF4?IVN# hNLS# ENFNN_KCNVVD/F
66纤维素是木材的主要组分!是地球上最丰富的
重要可再生资源!自然界每年可生产约 # :$$ 亿 4的
纤维素& 在生物能源和制浆造纸工业中!纤维素的
含量和存在形式直接影响发酵产物液体乙醇的产率
和制浆造纸过程中纸浆得率 "’?DIFE%’1*5!#;::#
&IVVFNC%’1*5! %$$9$& 因此!深入研究林木植物中纤
维素的生物合成过程!挖掘控制木材纤维品质和产
量的重要基因!进而通过遗传操作改良植物的纤维
品质具有重要的理论和实践意义&
在高等植物中!纤维素合酶"3N0P0/VNVWF4?IVN!
’NV,$催化纤维素的合成 "’?IFUCIV?NZ?IC%’1*5!
%$$"$& 纤维素合酶在细胞膜上组装成纤维素合酶复
合体"3N0P0/VNVWF4?IVN3/@K0N_V!’&’V$!它由 8 个大
亚基组成!在细胞膜上呈六边玫瑰形!推测每个大亚
基可能包含 8 个 ’NV,蛋白 "H/Y0DF %’1*5! %$$%#
&/@NC[D0N! %$$8# fP4MD0%’1*5! %$$:$& 目前研究表
明!植物初生%次生细胞壁的形成涉及不同的纤维素
合酶"&I_NFI%’1*5! %$$$# TIDE0NC%’1*5! %$$## HNVKCN^
%’1*5! %$$"# ,4IFIVV/[ %’ 1*5! %$$; $& 拟 南 芥
"3$1:-A#=&-&’/1*-121$中!’NV,#! ’NV,7 和 ’NV,8 形
成的复合体参与初生壁纤维素合成 "RIFE%’1*5!
%$$:$!而 ’NV,!!’NV," 和 ’NV,: 参与次生壁纤维素
的合成",4IFIVV/[%’1*5! %$$;$&
林木植物的次生细胞壁形成远比拟南芥复杂!
已有研究对林木中一些参与细胞壁形成的纤维素合
酶编码基因进行了表达分析和功能验证& 杨树
6第 #$ 期 陈亚娟等’ 毛白杨纤维素合酶基因家族部分成员的克隆及表达
"@#=0*0&$全基因组测序的完成促进了杨树中参与
细胞壁合成的纤维素合酶基因的研究& 通过序列分
析!在毛果杨"@!’$-./#.1$=1$基因组中已发现 #: 个
)%&3基 因 " &/CIWI%’1*5! %$$9 $! 其 中 @’)%&3]!
@’)%&3^! @’)%&3_! @’)%&3‘! @’)%&3[_ 和 @’)%&3[‘
在木质部特异高表达 " &P P^ZD%’1*5! %$$8$& 最近!
&/FE等"%$#$$发现!杨树木质部细胞膜上至少存在
% 种纤维素合酶复合体!复合体%由 ’NV,!! ’NV,"!
’NV,:! ’NV,#" 和 ’NV,#: 组成!参与细胞次生壁的
合成# 复 合 体 " 由 ’NV,7! ’NV,#$! ’NV,##!
’NV,#7! ’NV,#9 和 ’NV,#8 组成!参与细胞初生壁
和次生壁的合成& 然而!纤维素合酶在杨树次生细
胞壁形成中的功能鉴定还需要深入研究&
杨树是林木分子生物学研究的模式植物!也是
北半球重要的用材树种& 揭示杨树中纤维素合酶基
因及其功能!尤其是参与次生细胞壁形成的纤维素
合酶基因!对于利用现代分子生物学手段改良毛白
杨"@!’#G%2’#&1$木材品质具有重要的现实意义&
毛白杨是我国特有乡土树种!在材性品质和生态适
应性上具有明显优势!是优良的纸浆材树种和潜在
的生物质能源树种& 塔形毛白杨 ’.‘GJTk$# "@5
’#G%2’#&1 3GJTk$#/$"审定编号’国 & A&’AS+A
$$# A%$$8$新品系是经过人工杂交和多年选择而
培育出的杨树新品种& 该品系杨树具有生长快%抗
性强%树冠狭窄%雄株或弱雌性等优良特性!是城市
绿化%农田防护和短周期工业用材林的优良品种&
本研究从塔形毛白杨 ’.‘GJTk$# 中克隆了 " 个纤
维素合酶基因!结合生物信息学分析初步预测了其
功能# 运用 hNLS系统研究了这些纤维素合酶基因
的组织特异性表达模式!为揭示这些基因的生物学
功能提供了实验数据&
#6材料与方法
@F@A植物材料
塔形毛白杨 ’.‘GJTk$#!温室培养 7 个月!培
养温度为"%9 r%$d!光照时间为#8 ?)U A#!光照强
度为 !$ c!9 $@/0)@A%VA#&
@FCA试验方法
#1%1#6k*,的提取6使用柱式植物 k*,2q+%1$ 试
剂盒"天恩泽$提取毛白杨叶片 "8(: 节间幼嫩叶
片$和次生木质部"#(7 节间$总 k*,& 由于 k*,
容易降解!取材过程要迅速!剥去树皮后!用灭菌刀
片刮取树干和树皮内侧的材料!放入液氮速冻过的
离心管!马上投入液氮中& 具体总 k*,提取过程按
照试剂盒说明书进行&
#1%1%6基因克隆6根据已发表的毛果杨纤维素合
酶基因全序列!在基因 7/q+k和 9/q+k区设计引
物!采用巢式 S’k的方法扩增毛白杨纤维素合酶基
因!引物序列见表 #& 3H*,的合成使用 (F[D4C/ENF
公司的 &PKNC&3CDK4( QDCV4‘&4CIFU &WF4?NVDV&WV4N@试
剂盒!具体操作按照试剂盒说明书进行& S’k扩增
产物纯化后克隆到 Kh)f‘+)IVW"SC/@NEI$载体上!
进行测序分析&
表 @A纤维素合酶基因克隆引物
)#2B@ A.-%+*-/0,-:&,’%’4 :*&<&,/*/9’$;#/*4*’*/
引物名称
SCD@NCFI@N
引物序列"9/(7/ $
&NlPNF3NV/X4?NKCD@NCV"9/(7/ $
S4’NV,!‘,Q ’hhh,,++’h,+++h++h+’’
S4’NV,!‘,k +h,’’,’+’’,’+’’’’’,++
S4’NV,!‘GQ ,+hh’+hh’’++h+’,’hhh’,h++
S4’NV,!‘Gk ’+,h’,’+’’,’+’’,’,++h+++h,
S4’NV,9‘,Q ,+hh,h,’’,,,hhh,h,’+
S4’NV,9‘,k ,,’’++’+,’h+’,+h+h+’++
S4’NV,9‘GQ h+h,+h,hhh,’,h,,,h,h
S4’NV,9‘Gk h’++,+h+’,,hhh,hh,+
S4’NV,"‘,Q ’,+hh,,h’’,h+h’+hh,
S4’NV,"‘,k hhh’,+’+’’,++++h+’hh
S4’NV,"‘GQ ’+’+’h’’’’+++’’,++
S4’NV,"‘Gk ,,’+hhh++’,,+h’+’h+
S4’NV,:‘,Q h,h’Ohh+k,,h+hh+,,+
S4’NV,:‘,k h,h,,+’,+’+’h’,h++’,+h+
S4’NV,:‘GQ ,h,’,,’’,,h,’,’’’+,h’++
S4’NV,:‘Gk h’+’,’,h,,,+h’+’,h,’’++
S4’NV,#7‘,Q ,+hh,,+’,h,,hh+h,,,
S4’NV,#7‘,k +h,h,,++,’,+,,’’’’,’’
S4’NV,#7‘GQ ,h,h’,h’+,+’h,+hh,,+
S4’NV,#7‘Gk ,,’’’’,’’+’’++,’,++
S4’NV,#"‘,Q ’,+hh,,h’+,h+h’+hh,’
S4’NV,#"‘,k ’h’,+,+’h+,++’’’++,h,
S4’NV,#"‘GQ h’+’+’+’,’’’’,++’’,+
S4’NV,#"‘Gk ’’++’+h’,+’+’’,+’++h+
S4’NV,#:‘,Q hh’+++h++’,’++’+hh+’+
S4’NV,#:‘,k h,’’+,+h+’+++h’+h’+h++
S4’NV,#:‘GQ ,h,’,’’’+,h’+++hh++
S4’NV,#:‘Gk ’+hhh,h,h,’++,++hh,hh+
66
#1%176生物信息学分析6H*,序列利用 H*,f,*
软件进行组装和分析# 数据库搜索利用 *’G(
G-,&+搜索程序",04V?P0%’1*5!#;;$$# 采用 ’0PV4I0
R"+?/@KV/F %’1*5!#;;! $进行多序列比对# 使用
fNEI!1$ 软件"+I@PCI%’1*5! %$$"$对 #$ 个拟南芥
)%&3基因%## 个水稻"Y$(?1 &1’-51$)%&3基因%#: 个
毛果杨 )%&3基因和 " 个完整的毛白杨 )%&3基因构
建 *J"*NDE?Y/C‘J/DFDFEfN4?/U!邻接法$系统发育
树& 拟南芥基因的数据来自 *’G(!水稻基因数据来
自水 稻 基 因 组 计 划 注 释 数 据 库 " ?4K’aaCD3N5
K0IF4YD/0/EW5@VP5NUP$!毛果杨基因序列来自毛果杨
基因组文库"?4K’aaENF/@N5\ED‘KVX5/CEaS/K4C#u#a$&
#1%1!6基于hNLS遗传分析系统的基因表达分析6引
物设计选择在基因序列的非保守区!引物序列见表 %&
#"
林 业 科 学 !" 卷6
毛白杨叶片和次生木质部总 k*,的提取方法同上&
使用hNF/@N-IY hNLS&4IC4BD4"GN3Z@IF ’/P04NC$试剂
盒进行反转录"k+$及多重 S’k"LS‘S’k$反应& 以
3.’-2基因的表达水平作为对照!同时设无模板质控
"*+’$和无反转录酶质控"*k+’$对照&
表 CA纤维素合酶基因 L*a.遗传分析引物!
)#2BCA.-%+*-/0,-L*’,+*6#2)D L*a.4*’*$%:#’#&9/%/
,0:*&<&,/*/9’$;#/*4*’*/
引物
名称
SCD@NC
FI@N
引物序列"9/(7/ $
&NlPNF3NV/X4?NKCD@NCV"9/(7/ $
I34DF‘9 =LL)L=3=3)=)=L==)=,+h’+’’’,hhh’,h+h++
I34DF‘7 L)=3L=3)3=3)=)=LLL=+’’,,’’,+h,’,’’,h+h+h+
#,Q =LL)L=3=3)=)=L==)=+h+’,+h’’,+’+’’+’+’,
#,k L)=3L=3)3=3)=)=LLL=+’’++’,’+h+h’’+,’’,,
%,Q =LL)L=3=3)=)=L==)=,h,’,,,,h,’,’’’’’+h,
%,k L)=3L=3)3=3)=)=LLL=+hh’,,,h+’,h+’’+h+h+
7,Q =LL)L=3=3)=)=L==)=++++h’+hh+hh,,’,,,,,
7,k L)=3L=3)3=3)=)=LLL=hh,h’++h’+h,h+h+h,+++
!GQ =LL)L=3=3)=)=L==)=+h’,h,,+hh’,,h,h,hhh+
!Gk L)=3L=3)3=3)=)=LLL=’’,+,h+hh++h’’+hh’++
9,Q =LL)L=3=3)=)=L==)=’h++++,hh,h+h’,+,,h’h
9,k L)=3L=3)3=3)=)=LLL=’’’,’+,’,,+++’’,++’’,
8,Q =LL)L=3=3)=)=L==)=’h+h’’’’+h,h+hh+,++++
8,k L)=3L=3)3=3)=)=LLL=h+h’+h+hh,,,’’,,’’’,+
"GQ =LL)L=3=3)=)=L==)=,hh+hh,,,h,h,hh,+hh,+h,+
"Gk L)=3L=3)3=3)=)=LLL=,+’++h’+’h,’h’,h++hh+,’++
:GQ =LL)L=3=3)=)=L==)=+’’++hh,,,’,’’hh,h’+
:Gk L)=3L=3)3=3)=)=LLL=,’’hh’+++’++h+hh+h++
;,Q =LL)L=3=3)=)=L==)=,+h,++’+hh,h’’,,h,hh
;,k L)=3L=3)3=3)=)=LLL=’++’’’’,’,’’’,,,,h+,
#$,Q =LL)L=3=3)=)=L==)=h’+h,,hh,h,hhh,’,’,+
#$,k L)=3L=3)3=3)=)=LLL=’,,,,’+h’,’,,’,,+hh’
#!GQ =LL)L=3=3)=)=L==)=,hhhh,,h,,,+hhh,h,+h’+
#!Gk L)=3L=3)3=3)=)=LLL=,’’’,,’’’,h’,+,’h++’+
#9,Q =LL)L=3=3)=)=L==)=’’+,,h+hh+h’+h+hh,+h’+
#9,k L)=3L=3)3=3)=)=LLL=h’,’’’,’,hh++’,,,+h+’++
#8,Q =LL)L=3=3)=)=L==)=’’+,,h+hh+h’+h+hh,+h’+
#8,k L)=3L=3)3=3)=)=LLL=h+,’’’,’,hh+h’,,,+h++’+
#"HQ =LL)L=3=3)=)=L==)=’’,h+h+,+h+hhh’,’,hh,+
#"Hk L)=3L=3)3=3)=)=LLL=h’,h+’h’,hh+++’’,+’+++
#:HQ =LL)L=3=3)=)=L==)=’++’’++hh,,,+,’+hh,h’+’h+
#:Hk L)=3L=3)3=3)=)=LLL=,’’,h’’+++++h+hh+h’+
66!引物加粗部分为标签序列& +?NY/0U KIC4/X4?NKCD@NCICN4?N
4IEVNlPNF3NV5
%6结果与分析
CF@A毛白杨纤维素合酶基因的克隆及序列分析
以毛白杨次生木质部总 k*,为模板!通过 k+‘
S’k扩增纤维素合酶基因!获得大小约为 7 #$$ YK
的 H*,片段"图 #$& 获得的序列经分析均具有完
整的阅读框! 包含部分 q+k区序列& 经 *’G(
G-,&+数据库搜索!以及同毛果杨和拟南芥纤维素
合 酶 基 因 家 族 比 对! 分 别 命 名 为 @’#)%&3]!
@’#)%&3^!@’#)%&3_!@’#)%&3‘!@’#)%&3[a!@’#)%&3[_
和 @’#)%&3[‘! 基 因 命 名 "表 7 $ 参 考 BP@IC等
"%$$;$& H*,f,*分析表明!克隆的毛白杨纤维素
合酶基因与毛果杨基因组文库登记的同源基因在氨
基酸水平上的一致性为 ;!> c;:>"表 7$&
图 #6纤维素合酶基因扩增结果
QDE5#6SC/UP34V/X)%&3I@K0DXD3I4D/F
I5f’H*,分子量标准 H*,@ICZNC(# # A!’)%&3^!)%&3_!)%&3[a!
)%&3[_ 基因巢式扩增结果 *NV4NU S’k KC/UP34V/X)%&3^!)%&3_!
)%&3[a! )%&3[_ CNVKN34D[N0W5
Y5f’H*,分子量标准 H*,@ICZNC(# # A7’)%&3]!)%&3‘!)%&3[‘
基因巢式扩增结果 *NV4NU S’k KC/UP34V/X)%&3]!)%&3‘!)%&3[‘
CNVKN34D[N0W5
表 EA毛白杨纤维素合酶基因特性
)#2BEA3;#-#:$*-%/$%:/,09.)4)%’6+’"%")(+2.0(+)$
基因命名
hNFN
F/@NF30I4PCN
3H*,总长
-NFE4? /X
3H*,aYK
编码氨基
酸数目"个$
*P@YNC/X
I@DF/I3DUV
与毛果杨同
源基因一致
性 (UNF4D4WMD4?
4?N?/@/0/E/PV
ENFNV/X@#=0*0&
’$-./#.1$=1">$
hNFGIFZ
注册号
,33NVVD/F
*/5
@’#)%&3] 7 %97 # $!% ;: T]9:9:8;
@’#)%&3^ 7 7%7 # $;9 ;: T]9:9:"7
@’#)%&3_ 7 %#: # $78 ;" T]9:9:"$
@’#)%&3‘ 7 %8" ;": ;: T]9:9:8"
@’#)%&3[a 7 7#9 # $"; ;: T]9:9:"%
@’#)%&3[_ 7 #:9 # $7% ;: T]9:9:"#
@’#)%&3[‘ 7 $;# ;": ;! T]9:9:8:
66
使用 fNEI!1$ 软件建立系统进化树"图 %$& 从
进化树上可以看出!毛白杨 S4/’NV,#7 与拟南芥
,4’NV,7 属于同一亚族!毛白杨 S4/’NV,9 与拟南芥
,4’NV,%! ,4’NV,9! ,4’NV,8 及 ,4’NV,; 属于同一
亚族& 拟 南 芥 研 究 表 明! ,4’NV,#! ,4’NV,7 和
,4’NV,8 组成纤维素合酶复合体!参与初生细胞壁
合成# 同时 ,4’NV,%! ,4’NV,9 和 ,4’NV,; 被认为是
,4’NV,8 的替代物!这些蛋白彼此之间存在功能冗
余"SNCVV/F %’1*5! %$$9# &/FDI%’1*5! %$$8# HNVKCN^
%’1*5! %$$" $& 由 此 推 测 毛 白 杨 S4/’NV,9 和
S4/’NV,#7 在初生壁形成中发挥作用&
%"
6第 #$ 期 陈亚娟等’ 毛白杨纤维素合酶基因家族部分成员的克隆及表达
图 %6拟南芥%水稻%毛果杨和毛白杨纤维素
合酶构建的邻接树
QDE5%6+?NFNDE?Y/C‘\/DFDFE4CNN/X3$1:-A#=&-&’/1*-121! Y$(?1
&1’-51! @#=0*0&’$-./#.1$=1 IFU @!’#G%2’#&1 ’NV,VKC/4NDFV
拟南芥数据来自 *’G(HI4I/X3$1:-A#=&-&’/1*-121 MIVXC/@
*’G(’,4’NV,# ",Q$%"#"% $ # ,4’NV,% ",Q$%"#"7 $ # ,4’NV,7
",Q$%"#"!$ # ,4’NV,! ",Q!9:$:7 $ # ,4’NV,9 "*f‘#%#$%! $ #
,4’NV,8 " *f‘#%9:"$ $ # ,4’NV," " ,Q$::;#" $ # ,4’NV,:
" ,Q%8""!% $ # ,4’NV,; " *f‘#%""!8 $ # ,4’NV,#$ " *f‘
#%:###$5
水稻数据来自 kh,SHI4I/XY$(?1 &1’-51 MIVXC/@kD3NhNF/@N
,FF/4I4D/F SC/\N34’ 2V’NV,# "-2’u2V$9E$:7"$$ # 2V’NV,%
"-2’u2V$7E9;7!$$ # 2V’NV,7 "-2’u2V$"E%!#;$$ # 2V’NV,!
"-2’u2V$#E9!8%$$ # 2V’NV,9 "-2’u2V$7E8%$;$$ # 2V’NV,8
"-2’u2V$"E#!:9$$ # 2V’NV," "-2’u2V#$E7%;:$$ # 2V’NV,:
"-2’u2V$"E#$""$$ # 2V’NV,; "-2’u2V$;E%9!;$$ # 2V’NV,#$
"-2’u2V#%E%;7$$$ # 2V’NV,## "-2’u2V$8E7;;"$$5
毛果杨数据来自毛果杨基因组文库 HI4I/X=#=0*0&’$-./#.1$=1
MIVXC/@@#=0*0&’$-./#.1$=1 ENF/@NUI4IYIVN’S4’NV,#"9:%!";$ #
S4’NV,% " 99#7$: $ # S4’NV,7 " 8;#!89 $ # S4’NV,! " 8;#;;" $ #
S4’NV,9 " "#!"8$ $ # S4’NV,8 " "#"8# $ # S4’NV," " "#"8!8 $ #
S4’NV,:" 98:8:% $ # S4’NV,; " 8;9;!; $ # S4’NV,#$ " "$%$$" $ #
S4’NV,##"7!!"%7$ # S4’NV,#% "98$9%$ $ # S4’NV,#7 "8;"9$" $ #
S4’NV,#!" 9"87!: $ # S4’NV,#9 " 989"$ $ # S4’NV,#8 " ;""%" $ #
S4’NV,#""9":"#"$ # S4’NV,#:"99989$$5
毛 白 杨 S4/’NV,! 与 S4’NV,!! ,4’NV,! 和
2V’NV," 属于同一个亚族# S4/’NV," 和 S4/’NV,#"
与 S4’NV,"!S4’NV,#"!,4’NV," 和 2V’NV,; 属于同
一 亚 族# S4/’NV,: 和 S4/’NV,#: 与 S4’NV,:!
S4’NV,#:!,4’NV,: 和 2V’NV,! 属于同一个亚族&
研究表明 ,4’NV,!!,4’NV," 和 ,4’NV,: 共同参与细
胞次生壁的合成 "+PCFNC%’1*5!#;;"# +IW0/C%’1*5!
%$$7# ,4IFIVV/[%’1*5! %$$; $& 2V’NV,!!2V’NV,"
和 2V’NV,; 在功能上并不冗余!可能形成一个纤维
素合酶复合体参与次生细胞壁合成"+IFIZI%’1*5!
%$$7$& 由此推测毛白杨 S4/’NV,!!S4/’NV,"a#" 和
S4/’NV,:a#: 参与细胞次生壁的合成&
CFCA毛白杨纤维素合酶基因的表达分析
%1%1#6用于 hNLS多重分析的基因引物有效性验
证6采用 S’k对设计的特定基因引物进行验证和
优化!筛选出能够有效扩增的特异引物& S’k产物
经毛细管电泳分离!以检验特定引物扩增的有效性
和扩增片段的大小& 结果表明!本研究中最终选定
的引物!对目标基因能进行有效特异性扩增!为基因
的表达分析奠定了基础& 尝试了多对不同引物!
@’#)%&3[a 均没有得到有效扩增!可能是由于基因转
录丰度没有达到系统可以检测的水平&
%1%1%6hNLS系统分析杨树纤维素合酶基因的表达
特性6为了鉴定在次生木质部特异表达的毛白杨纤
维素合酶基因!利用 hNLS系统分别分析了毛白杨
叶片和次生木质部纤维素合酶基因的表达 "图 7!
图 !$& 结果表明’ 毛白杨次生木质部和叶片纤维
素合酶 基 因家 族表 达谱 存 在明显 差 异! 其 中
@’#)%&3]! @’#)%&3_! @’#)%&3‘! @’#)%&3[_ 和
@’#)%&3[‘ 在茎次生木质部中的转录丰度较高 "图
!$!说明这些基因可能主要参与毛白杨次生细胞壁
的形成# 而 @’#)%&3^ 在叶片中的转录丰度明显高于
次生木质部"图 !$& 由于叶片中维管系统较少!推
测 @’#)%&3^ 可能在初生壁合成中发挥作用& 以上
这些结果与生物信息学分析预测的基因功能相
吻合&
76结论与讨论
本研究利用 k+‘S’k的方法!从毛白杨中分离
了纤维素合酶基因 @’#)%&3]! @’#)%&3^! @’#)%&3_!
@’#)%&3‘! @’#)%&3[a! @’#)%&[_ 和 @’#)%&3[‘& 通过
与拟南芥%水稻以及毛果杨基因序列比对!推测毛白
杨 @’#)%&3^ 和 @’#)%&3[a 参与毛白杨初生壁的形
成! @’#)%&3]! @’#)%&3_! @’#)%&3‘! @’#)%&3[_ 和
@’#)%&3[‘ 在毛白杨次生壁形成过程中发挥作用!这
与 &P P^ZD等"%$$8$和 &/FE等"%$#$$在毛果杨中的
研究结论相一致& 然而!在 &P P^ZD等"%$$8$的研究
中!毛果杨 @’)%&3] 转录表达水平最低!@’)%&3[‘ 最
高# 而在本试验中 @’#)%&3] 的转录表达水平最高&
&P P^ZD等"%$$8$的研究显示木质部特异表达基因
在其他组织中的表达量都非常低!而本研究通过
hNLS系统分析其表达水平差异较小!如在木质部
特 异 高 水 平 表 达 的 基 因 @’#)%&3]! @’#)%&3_!
@’#)%&3[_ 等在叶片中的表达量也较高& 以上差异
7"
林 业 科 学 !" 卷6
图 76毛白杨次生木质部和叶片纤维素合酶基因家族表达谱的毛细管电泳
QDE576kNKCNVNF4I4D[N3IKD0ICWN0N34C/K?NC/ECI@V3/CCNVK/FUDFE4/ENFNN_KCNVVD/F KC/XD0NV/X3N0P0/VN
VWF4?IVNXC/@@#=0*0&’#G%2’#&1 DF VN3/FUICW_W0N@IFU 0NI[NV
可能是由于本试验取材树龄小%木质部还没有充分
木质化所致& 引起这些差异的具体原因还有待进一
步的研究&
图 !6毛白杨次生木质部和叶片纤维素合酶
转录丰度的比较
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@#=0*0&’#G%2’#&1 DF VN3/FUICW_W0N@IFU 0NI[NV
基因表达水平为相对值!对照 3.’-2 基因的表达水平定为 #!试验
设 7 次重复& +?NN_KCNVVD/F 0N[N0V/XENFNVICN3/@KICNU MD4? 4?I4
/X3.’-2! M?D3? DVVN44/#1)CC/CYICVCNKCNVNF44?N&)/X4?CNN
YD/0/ED3I0CNK0D3I4NV5
&P P^ZD等"%$$8$在毛果杨 ! 种组织中均检测不
到 @’)%&3a 的表达!本试验在毛白杨叶片和次生木
质部中均检测到了 @’#)%&3a 基因的表达!但是表达
量相对较低& @’#)%&3[a 在本试验中未能得到有效
扩增& 根据系统进化树分析!@’#)%&3[a 与 3’)%&3a!
@’)%&3[a 和 @’)%&3a 进化上亲缘关系最近# &/FE等
"%$#$$的研究表明毛果杨中!@’)%&3a 和 @’)%&3[a
既参与初生壁的合成也参与次生壁的合成!3’)%&3a
参与了拟南芥初生细胞壁的形成& 根据以上结果毛
白杨 @’#)%&3a 和 @’#)%&3[a 在细胞壁形成过程中的
作用还有待于进一步的试验验证&
本研究克隆了毛白杨 " 个 )%&3基因!利用
hNLS遗传分析系统对毛白杨纤维素合酶家族基因
在不同部位的表达进行了研究!为进一步鉴定毛白
杨纤维素合酶基因的功能提供了实验依据& 本实验
室选取了部分次生木质部高表达基因进行了进一步
的过表达和抑制表达研究!目前已获得了一部分转
基因株系!基因功能的验证还在进行中&
参 考 文 献
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4//05Jf/0GD/0! %#9"7$ ’ !$7 A!#$1
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!"
6第 #$ 期 陈亚娟等’ 毛白杨纤维素合酶基因家族部分成员的克隆及表达
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%8%" A%87"1
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