全 文 ：第 8? 卷 第 ? 期
4 A 2 5 年 ? 月
林 业 科 学
7;QRS6QL 7Q!ILR 7QSQ;LR
I.(T8?"S.T?
7-H3" 4 A 2 5
D."!2A322=A=UV32AA2F=8>>34A25A?A8
收稿日期!4A24 WA? W24# 修回日期!4A25 WA2 W28’
基金项目!国家自然科学基金项目$52A:A425#524:A5:>% # 江西省科技支撑计划项目$4A2ANSNAA9A5% ’
#上官新晨为通讯作者’
青钱柳悬浮培养细胞三萜酸的分离及结构鉴定#
尹忠平2! 4\上官新晨2! 4\陈继光2! 4\吴少福4\黎冬明4
$23江西省天然产物与功能食品重点实验室\南昌 55AA89#
43江西农业大学食品科学与工程学院\南昌 55AA89%
摘\要!\通过大孔树脂吸附 &硅胶柱层析 &7-H0%D-c!柳悬浮培养细胞三萜酸进行分离纯化 "获得 9 个单体三萜酸 "经高分离度快速液相 W飞行时间质谱 $XX!;F
6@ZU$7% &核磁共振氢谱 $ 2 4(W羟基熊果酸 &白桦脂酸 &齐墩果酸 &熊果酸 "其中 4(W羟基齐墩果酸和白桦脂酸是首次在青钱柳中得到
分离鉴定 ’
关键词!\植物细胞培养# 青钱柳# 三萜酸# 分离# 结构鉴定
中图分类号!M9A2\\\文献标识码!L\\\文章编号!2AA2 W=8>>"4A25#A? WAA45 WA9
$/%&*&’("#̓/#’(1(,&’("#"1H*(’/*%/#(,@,(701*"4$+0%/#7/7
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@50’*&,’!\Q& )0"+H%H-*" /"K-)*")-*H-&",%,"D+J-*-+-H%*%)-D /*.B+#+H-&D-D ,#()#*-D ,-(+./=7,$),#67# K#$+A6A-EG
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+-H%*%)-D %&D "D-&)"/"-D /*.B=%K#$+A6A-%
A/: B"*70!\H(%&),-(,#()#*-# =7,$),#67# K#$+A6A-# )*")-*H-&",%,"D# +-H%*%)".&# +)*#,)#*-"D-&)"/",%)".&
\\青钱柳$=7,$),#67# K#$+A6A-%为我国特有的胡桃
科$[#C(%&D%,-%-%青钱柳属珍稀濒危植物"零星分布
于南方各省’ 青钱柳叶含三萜&黄酮&多糖及微量元
素等活性成分$谢明勇等" 4AA># 尹忠平等" 4A22#
Z%&C!"#$%" 4A22# j"-!"#$%" 4AA:%"具有降糖$谢明
勇等" 4AA># Y#*"0%*%!"#$%" 4AA5%%&调脂$Y#*"0%*%
!"#$%" 4AA5E%&增强免疫力 $谢明勇等" 4AA>%等多
种功能"是良好的天然保健食品和医药资源’ 青钱
柳繁育困难$谢明勇等" 4AA>%&资源匮乏严重等问
题制约其开发利用’ 三萜化合物是一类由 : 个异戊
二烯单位构成的化合物群"具有抗肿瘤$h%&C!"#$%"
4A24%&抗炎$ %^&C!"#$%" 4A24%&降脂$$,‘0"-!"#$%"
4A24%等多种功能活性"在医药和保健食品领域具有
重要的开发利用价值’ 三萜化合物是青钱柳叶中重
要的活性物质"舒任庚等$4AA9%率先对青钱柳叶中的
三萜类物质进行分离和结构鉴定"先后鉴定出乌苏
酸&RH"b%).&",%,"D 等多个三萜类化合物#研究人员现
已从青钱柳叶中鉴定了 2= 个三萜类化合物$谢明勇
等" 4AA># 舒任庚等" 4AA9# ["%&C!"#$%" 4AA:# 李俊"
4AA>%’ 目前"国内外尚未见青钱柳悬浮培养细胞三
萜酸分离鉴定方面的研究报道’ 笔者对青钱柳悬浮
培养细胞中的三萜类化合物进行研究"从中分离出 9
种三萜酸并进行结构鉴定"旨在探索以青钱柳细胞悬
浮培养方式生产三萜酸类功能因子的可行性"以解决
资源匮乏制约其活性成分开发利用的难题’
林 业 科 学 8? 卷2\材料与方法
EDEF试验材料
青钱柳悬浮培养细胞由本实验室培养获得$尹
忠平等" 4A22%’ 培养物经减压抽滤得到新鲜细胞"
再于 :A o真空干燥箱中烘干至恒质量"粉碎后
备用’
EDGF试剂
乙酸乙酯&二氯甲烷&石油醚&甲醇&乙酸酐&浓
硫酸等均为分析纯$天津永大化学试剂厂%# 色谱纯
级无水甲醇$江苏汉邦公司%# 大孔树脂 LNW>$河
北沧洲宝恩吸附材料科技有限公司%# 葡萄聚糖凝
胶 7-H0%D-c!4AA 目&4AA f5AA 目$青岛海洋化工有限公司%’
EDCF试验仪器
超声循环提取机$高效液相色谱仪 $N*--r-2949F==49F48>="h%)-*+%#
低速大容量离心机 $L&b-6a!9FL"上海安亭仪器
厂%# 显微熔点测定仪$jX:"上海永亨光学仪器制
造公 司 %# 核 磁 共 振 波 谱 仪 $ LILS;R# :AA"
N*#b-*%# 高分离度快速液相 W飞行时间质谱
$XX!;F6@ZU$7%联用仪$安捷伦 24AA 型液相色谱
仪&安捷伦 ‘:44AL飞行时间质谱仪&R7QLC"(-&)标
准电喷雾离子源&M#%(")%)"K-%&%(GF+"+质谱分析软
件%’
EDLF试验方法
2T8T2\总三萜酸提取\以乙酸乙酯为溶剂"采用超
声辅助法提取总三萜酸"主要提取条件如下!提取时
间为 8A B"&"提取温度为 9A o"料液比为 2g2A’ 重
复提取 2 次"合并提取液":A o旋转真空浓缩得粗
提物’
2T8T4\三萜酸分离纯化\经超声辅助提取&真空浓
缩得到的青钱柳叶总三萜粗提物"以 LNW> 大孔树
脂进行吸附"上柱后以 8Ad乙醇清洗去杂"以 ?9d
乙醇洗脱"得初步纯化的总三萜’ 初步纯化的总三
萜再进行硅胶柱层析$2AA f4AA 目%"干法上柱"依
次以石油醚U乙酸乙酯$4Ag2)4g2%&石油醚U乙酸
乙酯U甲醇$4Ag2Ag2)4Ag2Ag2A%和甲醇$2AAd%进
行梯度洗脱"每 9AA B!为 2 个单位进行收集"获得
含三萜化合物的组分 2"4 和 5’ 组分 2"4 和 5 再以
4AA f5AA 目硅胶进行分离和纯化"分别采用石油
醚U乙酸乙酯$2Ag2%&石油醚U乙酸乙酯$:g2%和二
氯甲烷U甲醇$2Ag2%进行洗脱"收集含三萜的目标
成分"再分别以 7-H0%D-c!氯甲烷U甲醇$2g2%的溶剂进行洗脱-"最后以半制
备高效液相色谱和重结晶进行分离和纯化"从组
分 2中分离得到三萜化合物单体$和’"从组分 4
中得到三萜单体#"从组分 5 中得到了三萜单体!
和"’
2T8T5\半制备高效液相色谱分离\色谱柱!h%)-*+
;2> 柱$=T> BB e5AA BB"= *B%# 检测器!h%)-*+
48>=# 检测波长!42A &B# 流动相!P$甲醇%gP$AT2
d醋酸水溶液% k>?g22# 流速!4TA B!*B"& W2# 柱
温!8A o’ 样品以色谱纯甲醇溶解"AT44 *B滤膜
过滤后上柱分离’
2T8T8 \ XX!;F6@ZU$7 检 测 \ 液 相 色 谱 柱 为
LC"(-&)R,("H+-1(#+;2> $ 4T2 BBe9A BB" 2T>
*B%# 流动相为 ?A d甲醇 ]2Ad甲酸水$甲酸含量
为 AT2d%’ 质谱条件为电喷雾负离子模式# 质量
扫描范围为 22A f2 AAA $BUr%# 毛细管电压为 8
AAA I# 雾化气压力为 AT42 $1%# 干燥气流速为 2A
!*B"& W2# 干燥气温度为 59A o# 碎片电压为 2>A
I’ 选择参比校准液进行实时质量数校正’ 样品测
定之前"以调谐液进行质量轴校准"使质量精度误差
小于 4 e2A W:’ 数据以 M#%(")%)"K-L&%(G+"+软件进行
处理’
4\结果与分析
GDEF化合物"
白色无定形粉末 $甲醇%’ 熔点!4:? f4=2 o
$未校正%’ !"-E-*B%&&FN#*,0%*D&2A d浓硫酸乙醇
反应均呈阳性’ XX!;F6@ZU$7 负离子模式准分子
离子峰, $F<- WBUr8=2T598 :’2a$7@%!+24TA5$2<"E*+";@@%# +9T2= $2<"
)"Wk5T: <)W4%# +8T4?$2<"D"Wk8T4 $2<"B"%# +2T2A$5<"+%"AT?4$5<"+%"AT?A
$5<"+%"AT>>$:<"+%"AT=2$5<"+%"AT=A$5<"+%对
应 = 处甲基氢信号’25 ;S$X$ 29A$aR16谱图表明该化合物含 5A 个碳"其中"25 个伯
碳和叔碳& ? 个仲碳& > 个季碳# +2=?TA $;4> %"
+288T8$;25%" +242T? $;24%" +>4T> $;5%" +:=T=
$;4%" +4?T5 $;45%&2=T: $;48%&2:T> $;49%&2=T8
$;4:%&4:T2 $;4=%&55T5 $;4?%&45T? $;5A%对应 =
个甲基碳# 以上碳信号提示该化合物是含有 4 个羟
基的三萜酸’25 ;S$X谱图数据归属见表 2’ 该化
合物的2< S$X"25 ;S$X"aR16谱图数据与文献
$刘博等" 4A2A# 鞠建华等" 4AA5# 陈龙胜等" 4AA>%
所报道的 4(W羟基齐墩果酸相应数据基本一致"因
此鉴定为 4(W羟基齐墩果酸$B%+("&",%,"D%’ 该化
84
\第 ? 期 尹忠平等! 青钱柳悬浮培养细胞三萜酸的分离及结构鉴定
合物结构见图 2 W!’
GDGF化合物#
白色无定形粉末 $甲醇%’ 熔点!492 f495 o
$未校正%’ !"-E-*B%&&FN#*,0%*D&2A d浓硫酸乙醇
反应均呈阳性’ XX!;F6@ZU$7 负离子模式准分子
离子峰,$F<- WBUr8=2T599 >’2a$7@%!+22T?9$2<"E*+";@@%# +9T28 $2<"
)"Wk5T: <)W4%# +8T4>$2<"D"Wk8T4 $2<"B"%# +AT=A$5<"+%"AT=8$5<"+%"AT>2
$5<"D"Wk:T: 5T:%&2TA8 $5<"+%对应 = 处甲基氢信号’25 ;S$X
$29A $个碳"其中"29 个伯碳和叔碳&> 个仲碳&= 个季碳#
+2=>T> $;4> %" +>4T= $;5 %" +:=T: $;4 %" +25>T=
$;25%& +249TA$;24%" +4?T5$;45%&2=T9$;48%&2:T?
$;49%& 2=T= $;4: %& 45T> $;4= %& 2=T8 $;4? %& 42T:
$;5A%分别对应 = 个甲基碳# 以上碳信号提示该化合
物是带有 4 个羟基的五环三萜类化物’25;S$X谱图
数据归属见表 2’ 该化合物的2< S$X"25 ;S$X"
aR16谱图数据与文献$刘博等" 4A2A# %^B%C"+0"!"
#$3" 2?>>"陈龙胜等" 4AA>%所报道的 4(W羟基熊果酸
相应数据基本一致"故鉴定为 4(W羟基熊果酸
$;.*.+.(",%,"D%’ 该化合物结构见图2 W"’
GDCF化合物$
白色无定形粉末 $甲醇%’ 熔点!4?8 f4?: o
$未校正%’ !"-E-*B%&&FN#*,0%*D&2A d浓硫酸乙醇
反应均呈阳性’ XX!;F6@ZU$7 负离子模式准分子
离子峰 ,$F<- WBUr899T5:2>’2;a;(5%!+8T=8$2<"+"4?(%表明可能含有一个环外双键# +5T2?$2<"DD"W
k22T8":T:"
2AT>"8T> 5 $5<"
+%"AT?8$5<"+%"AT?= $5<"+%"2TA2 $5<"+%"2T:?
$5<"+% 为 : 处甲基氢信号’25 ;S$X$ 29A$;a;(5%!+2>AT8$;4>%"+=?TA $;5%"+29AT8 $;4A%"
+2A?T=$;4?%提示该化合物可能为羽扇豆烷型三萜
类化合物# +4>TA $;45%"29T8 $;48%"2:T2 $;49%"
2:T2$;4:%"28T=$;4=%"2?T8 $;5A%对应 : 个甲基
碳# 25;S$X谱图数据归属见表 2’ 该化合物2<
S$X"25;S$X数据与文献$林朝展等" 4A2A# ;0-&
!"#$%" 4AA>%报道的白桦脂酸数据基本一致"因此鉴
定为白桦脂酸$ E-)#("&",%,"D%’ 该化合物结构见图
2 W#’
GDLF化合物%
白色针状结晶 $氯仿 W甲醇 %’ 熔点!5A2 f
5A5 o$未校正%’ !"-E-*B%&&FN#*,0%*D&2A d浓硫
酸乙醇反应均呈阳性’ XX!;F6@ZU$7 负离子模式
准分子离子峰,$F<- WBUr899T59> 5’2$+5T44$2<"DD"Wk2AT>"8T4 DD"Wk25T>"8T4 %# + AT=9$5<"+%"AT==
$5<"+%"AT?A $5<"+%"AT?2 $5<"+%"AT?5 $5<"+%"
AT??$5<"+%"2T25 $5<"+%为 = 处甲基氢信号’25 ;
S$X$ 29A$5T4 $ ;4> %" +285T:
$;25%"+244T= $;24%"+=?TA $;5%表明该化合物可
能为五环三萜的基本骨架# +4>T2 $;45 %" 29T9
$;48%"29T5 $;49 %"2=T2 $;4: %"49T? $;4=%"55T2
$;4?%"45T:$;5A%分别对应 = 个甲基碳# 25;S$X
谱图数据归属如表 2 所示’ 该化合物的2< S$X"
25;S$X数据与文献 $M# !"#$%" 4AA?# 周洪波等"
4A22%所报道的齐墩果酸数据基本一致"因此鉴定
为齐墩果酸 $.(-%&.(",%,"D %’ 该化合物结构见
图2 W$’
GDNF化合物&
白色无定形粉末$甲醇% ’ 熔点!4>8 f4>: o
$未校正 % ’ !"-E-*B%&&FN#*,0%*D&2A d浓硫酸乙
醇反应均呈阳性’ XX!;F6@ZU$7 负离子模式准
分子离子峰,$F<- W BUr899T59? =’2$ % #
+9T25$2<")"Wk5T: @"=T4 +4T2A$2<"D"Wk2AT> % # + AT:> $ 5<"
+% "AT=9$ 5<"+% "AT>4 $ 5<" D"Wk:T: =
$5<"+% "AT?A$5<"+% "AT?2 $5<"+% "2TA8 $5<"+%
为 = 处甲基氢信号’25 ;S$X$ 29A$aR16谱图表明该化合物有 5A 个碳"其中"28 个伯
碳和叔碳&? 个仲碳&= 个季碳# +2=>T> $;4> % "
==T5$;5% "+25>T=$;25% "+249T2 $;24%提示该化
合物可能是带有 2 个羟基的五环三萜酸# +4>T=
$;45 % " 2:T: $;48 % " 29T= $;49 % " 2=T8 $;4: % "
45T>$;4=% "2=T9 $;4? % "42T: $;5A %分别对应 =
个甲基碳# 25;S$X谱数据归属见表 2’ 该化合物
的 2#$%" 4AA?# 尹海龙等" 4A2A%所报道的熊果酸数据
基本一致"因此鉴定为熊果酸 $ #*+.(",%,"D% "其结
构见图 2 W’’
94
林 业 科 学 8? 卷图 2\化合物!W’结构
Z"C32\60-+)*#,)#*-./,.BH.#&D !W’
表 EF化合物"&#&$&%&&的EC-!2X数据归属
H&5IEFEC-!2X7&’& "1,"4%"+#7
"& #& $& % &
位置编号
1.+")".& &#BE-* ! " # $ ’
2 8=T5 8=T: 5>T? 5>T8 5>T=
4 :=T= :=T: 4=T8 4=T4 4=T9
5 >4T> >4T= =?TA =?TA ==T5
8 5?T8 5?TA 5>T= 5>T> 5>T?
9 99T5 99T4 99T8 99T4 99T5
: 2>T9 2>T9 2>T5 2>T5 2>T9
= 54T> 55T2 58T8 54T: 55T4
> 5?T8 5?T8 8AT= 5?T5 8AT9
? 8=T: 8=T9 9AT: 8=T: 8=T9
2A 5>T4 5>T2 5=T4 5=T2 5=TA
22 45T2 45T8 4AT? 44T? 45T5
24 242T? 249TA 49T9 244T= 249T2
25 288T8 25>T= 5>T8 285T: 25>T=
28 82T? 84T4 84T9 82T: 84T2
29 4=T= 4>TA 5AT: 4=T= 4>TA
2: 45T9 48T5 54T4 45T8 48T5
2= 89T? 8=T5 9:T5 8:T9 8=T5
2> 82T5 94T> 8:T? 82TA 94T?
2? 8:T4 8AT9 8?T5 89T? 5?TA
4A 5AT? 5>T? 29AT8 5AT= 5>T?
42 55T> 5AT= 4?T= 55T> 5AT=
44 54T: 5:T> 5=T2 54T8 5:T>
45 4?T5 4?T5 4>TA 4>T2 4>T=
48 2=T: 2=T9 29T8 29T9 2:T:
49 2:T> 2:T? 2:T2 29T5 29T=
4: 2=T8 2=T= 2:T2 2=T2 2=T8
4= 4:T2 45T> 28T= 49T? 45T>
4> 2=?TA 2=>T> 2>AT8 2>5T4 2=>T>
4? 55T5 2=T8 2A?T= 55T2 2=T9
5A 45T? 42T: 2?T8A 45T: 42T:
5\结论与讨论
目前可利用的青钱柳资源很少"且大都零星
分布于深山老林之中"或保存于自然保护区内$谢
明勇等" 4AA># 谢寅峰等" 4A24% ’ 青钱柳种壳坚
硬"种子属于综合性深休眠类型"自然萌发率低"
有性繁育困难’ 尚旭岚等$4A22 % &Z%&C等$4AA= %
采用酸蚀&‘L5 浸种&‘L5 拌沙&先低温后暖温层
积的方法"可实现头年采种&翌年出苗’ 无性繁殖
方面的研究主要在扦插和组培繁殖技术上"但难
以生根"成活率很低$谢明勇等" 4AA># 谢寅峰等"
4A22% ’ 从实际应用情况来看"目前尚无青钱柳大
量人工繁殖和栽培的成功经验"资源稀缺局面仍
未得到根本改观’
用植物细胞培养生产活性天然产物具有周期
短&可控性强&受自然条件影响小&操作方便&重复性
好&易于工业化生产等优点 $刘菲" 4A2A# N.&/"(
!"#$%" 4A22# ‘-.*C"-K!"#$%" 4AA?%"可用来解决青钱
柳活性成分开发利用的难题’ 研究人员已对 2 AAA
多种植物进行细胞培养研究"从中分离出 :AA 多种
次生代谢产物"其中"有 :A 多种物质的含量接近或
超过原有植物"有 4A 多种的含量超过培养细胞干质
量的 2d#用人参 $8#1#T’+1-!1’%细胞培养生产皂
:4
\第 ? 期 尹忠平等! 青钱柳悬浮培养细胞三萜酸的分离及结构鉴定
甙&用洋地黄$S+’+")T+1 KA6KA6!#%细胞培养生产生物
碱等都已经达到了工业化生产的规模"用长春花
$=#"/#6#1"/A-6)-!A-%细胞培养生产生物碱已达到
中试水平$刘菲" 4A2A%’
本实验室前期已经建立了青钱柳细胞悬浮培养
体系"并对其中的三萜化合物积累进行了初步研究
$尹忠平等" 4A22%’ 本文则对其中的三萜酸进行分
离和结构鉴定"从青钱柳悬浮培养细胞中分离了 9
个单 体 三 萜 酸" 经 XX!;F6@ZU$7" 2S$X和 aR16等鉴定"分别为 4(W羟基齐墩果酸&
4(W羟基熊果酸&白桦脂酸&齐墩果酸&熊果酸"其
中 4(W羟基齐墩果酸和白桦脂酸是首次在青钱柳
中得到分离鉴定’ 研究结果表明"青钱柳悬浮培养
细胞中含有多种活性三萜酸"可进一步从诱导&培养
方式方法&代谢途径中的关键酶基因以及生物反应
器培养等方面进行深入研究"为植物细胞培养工业
化生产活性三萜类物质奠定基础’
本文以大孔树脂吸附层析对三萜酸粗提物进行
初步纯化"取得了较好的纯化效果"回收率可达
=9T9d"纯化后总三萜的纯度可达 :4T8d’ 在上柱
吸附操作时"因用乙酸乙酯提取的粗提物极性较小"
难溶于水"故以水溶液上柱时上柱液体积非常大"时
间长"效果不好’ 课题组对三萜酸在 LNW> 树脂上
的吸附 W解吸特性进行了反复试验"发现以 5Ad的
乙醇溶液上柱效果较好"操作也较为方便"同时一些
极性大的杂质在树脂上的吸附也较少"可提高树脂
的吸附能力"洗脱所得的目标物纯度上也更高’ 洗
脱时"以 :9d以上的乙醇溶液就可以将目标物洗脱
下来"随着乙醇浓度的增加"洗脱的效率能够得到提
升"回收率提高"最后确定以 ?9d的乙醇进行洗脱’
在以硅胶进行分离时"课题组发现提取物中还有少
量极性更高些的三萜类物质"但含量较少"分离难度
大"此组分有待于进一步分离和鉴定’
参 考 文 献
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国医国药" 2?$24% !4?A? W4?2A3
鞠建华"周\亮"林\耕"等34AA53枇杷叶中三萜酸类成分及其抗
炎&镇咳活性研究3中国药学杂志"5>$2A% ! =94 W=9=3
李\俊34AA>3鹊肾树心材和青钱柳叶化学成分及其生物活性的研
究3广州!中山大学博士学位论文3
林朝展"祝晨蔯"邓贵华"等34A2A3枇杷叶紫珠化学成分研究3中药
材"55$:% !>?= W?AA3
刘\博"吴和珍34A2A3山茱萸药材中三萜类成分的研究3湖北中医
杂志"54$24% !=9 W=:3
刘\菲34A2A3喜树悬浮培养体系的建立及喜树碱含量的调控研
究3长沙!湖南农业大学硕士学位论文3
尚旭岚34AA=3青钱柳种子休眠机理及其解除休眠方法的研究3南
京!南京林业大学博士学位论文3
尚旭岚"徐锡增"方升佐"等34A223青钱柳种子休眠机制3林业科
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