全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$ % & & 年 # 月
林 业 科 学
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-345!$ % & &
杨树抗逆转录因子基因内 ’’Y标记的开发&
王保垒6王博文6陈清清6李百炼6张德强
"北京林业大学6林木育种国家工程实验室6林木花卉遗传育种教育部重点实验室6北京 &%%%#7$
摘6要!6利用直接测序法开发小叶杨抗逆转录因子基因内一套新的核基因组 ’’Y标记& 通过对 7 个抗逆转录因
子共 $& 个成员在 7A 个小叶杨基因型个体中的序列比较分析后共检测到 7& 个 ’’Y多态性位点!’’Y出现的频率为
&h& B&A JG& 在小叶杨自然群体中!’’Y多态性位点的碱基重复呈现出 $ b? 碱基形式!基元重复次数变异范围为
7 b$% 次!其中以二碱基重复的位点较多!占总数的 ?&2Ad& 在此基础上!依据 ’’Y位点两侧的保守序列!设计 7&
对 ’’Y位点 Z(Y扩增引物对& 利用设计的引物检测所开发的 ’’Y位点在杨属内 $$ 个基因型个体中 Z(Y扩增的
有效性及 ’’Y位点的保守性& Z(Y扩增结果显示!B72?d的 ’’Y位点能够在杨属内至少 ! 个派内有效扩增!每对
引物组合可检测到 ’’Y多样性位点数 7 b&$ 个!平均 A 个& 基于抗逆转录因子基因内开发的 ’’Y标记位点为分
子标记辅助小叶杨抗逆性状育种提供工具&
关键词’6 杨树# 抗逆性状# 转录因子# 基因内 ’’Y标记
中图分类号! ’"!A’ nB!72$666文献标识码!-666文章编号!&%%& @"!##"$%&&#%# @%%A" @%#
收稿日期’ $%&& @%$ @&A# 修回日期’ $%&& @%A @%#&
基金项目’ 国家林业公益性行业科研专项经费项目"$%&%%!%%B$ #教育部新世纪优秀人才支持计划专项基金"+(*,U%"U%%#!$ &
&张德强为通讯作者&
N2"(%&5&1$%&’(’5..!S’1&5/’49/$()1/&+%&’(Q$1%’/H"(")
GL+/"))"20(2"/;,&’%&1.%/"))")&(!%6,$,&
ID<4 D^01F=6ID<4 0^VF<6(KF< n=<4l=<46.=^ D=1=D<6NKD<4LFl=D<4
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JMR=;FTS1MOFl3F=RFF2*,$(*F)< SKFG01M80;GK=T’’Y10T=!
SKF;FVF;FR=U! S;=U! SFS;DU! DP;Fl3FF2*,$(*F,K=;SMU0D8G1=P=TDS=0< ’’Y10T=VF;FRFO=40P’’Y10T=VF;FSFOSFR V=SK $$ 4F<0SMG=T=$G3%32F,KFZ(YD8G1=P=TDS=0< FQK=J=SFR D< DWF;D4F0PB72?d
T0$G3%32! D7 S0&$! V=SK D< DWF;D4F0PA2% D1F1FOGF;10T3O5,KFRFWF10GFR 4FS;D;FO=OSDF2*,$(*! D<"= -’/2)’6>$G3%32# S;D=SOV=SK DJ=0S=TOS;FOO;FO=OSD66干旱%高盐及极端温度胁迫是影响森林生产力
和限制林业生产的主要非生物胁迫因素!也是实施
困难立地造林的主要限制因子& 国内外研究表明!
植物的抗旱%耐极端温度和盐碱等抗逆性状是由多
基因控制的数量性状!是多方面%多层次和多途径协
同作用的结果!有着非常复杂的调控机制"NKD<4-.
/%5! $%%!# C3F-./%5! $%%A$& 最近的研究表明!植物
各种诱导型基因的表达主要受特定转录因子在转录
水平上的调控!在逆境条件下!抗逆转录因子能够与
基因组中顺式作用元件特异结合从而有效转录调控
诸多抗逆基因的表达!在抗逆分子育种中显示了前
所未有的应用前景"-4D;VD1-./%5! $%%A$& 而目前
在分子育种方面的主要进展是通过分子标记辅助选
择"8D;]F;DOO=OSFR OF1FTS=0性状的多个基因剖分开来& 这一方法可以像研究质
量性状基因位点一样!对这些数量性状基因位点进
林 业 科 学 !" 卷6
行研究!研究基因在染色体上的位置!并寻找与其紧
密连锁的分子标记!以通过聚合育种或直接选择等
策略来对林木进行抗逆遗传改良"e0OG=SD1! $%%B$&
若有效开展分子标记辅助育种!就需要首先开
发理想的分子标记位点& 在常见的分子标记技术
中!简单序列重复"O=8G1FOFl3F称微卫星 L+-!由于具有多态性高%共显性遗传%检
测容易且结果稳定%重复性强等优点!被认为是一种
理想的分子标记"jD1=D-./%5! $%&&$& 但传统方法
开发的 ’’Y位点多来自基因组的随机区域!而这些
’’Y多呈中性进化!与物种表型性状的形成连锁不
太紧密",3O]D< -./%5! $%%!$& 与此不同!基因内的
’’Y由于其功能重要性!在进化过程中!一般会受到
较强烈的选择压!造成与物种的表型性状紧密连锁
".=-./%5! $%%!$& 特别是开发转录因子基因家族内
的 ’’Y!并对其在不同物种内的可转移性进行检测
是利用该标记技术进行重要抗逆性状分子标记辅助
育种的前提&
为此!本研究以能最大程度地反映小叶杨
">$G3%322*,$(*$自然分布区域的 7A 个基因型个体
为材料!在对 7 个转录因子家族!包括 +Dphep反向
运输蛋白基因 "+Dphep D应元件结合蛋白 " RFKMR;DS=0< ;FOG0J=S;D基础上!发现基因内不同区域 ’’Y位点!并依据 ’’Y
位点两侧的保守区域设计 ’’Y扩增引物& 在此基
础上!以杨属内白杨派 " <-3"-$%黑杨派 "7*6-*+$2$%
青杨派 "D/"/,/#/"/$%胡杨派 "D3+/(6/$及大叶杨
派"<-3"$*0-2$内 $$ 个基因型个体为试验材料!对开
发的 7& 对 ’’Y引物进行了多态性评价& 研究结果
为利用功能基因内 ’’Y位点进行 n,.分析及连锁
不平衡"1=<]D4FR=OFl3=1=J;=38!.L$作图提供了重要
的理论依据!具有重要的应用价值&
&6材料与方法
@?@A植物材料
$%%" 年秋季课题组从吉林%辽宁%内蒙古%河
北%北京%山东%河南%山西%陕西%青海%甘肃%四川
&$ 个省"市%自治区$的小叶杨自然分布区域!共收
集保存了 ?A% 个基因型个体& 为发现小叶杨抗逆相
关转录因子基因内多态性 ’’Y!选取能最大程度地
覆盖小叶杨自然分布区域的 7A 株个体作为试材!摘
取新鲜叶片用于基因组 L+-提取# 而用于 ’’Y引
物在杨属内通用性评价的材料列于表 &!为杨属内
$$ 个基因型个体&
表 @A用于 ..!引物有效性评价材料
9$,E@A9*"4$%"/&$#)0)"25’/"K$#0$%&’(’5..!+/&4"/+$&/)
派别 ’FTS=0< 树种 ’GFT=FO 来源 ’03;TF 标本号 /03TKF;+05
白杨派 <-3"-
毛白杨 >5.$,-(.$2/ 北京 F^=X=<4 NLnU%&7
欧洲山杨 >5.+-,3%/ *
欧洲山杨 >5.+-,3%/ +
瑞典 ’VFRF<
NLnU%&?
NLnU%&A
山杨 >50/)*0*/(/ 北京 F^=X=<4 EeCU%&#
银白杨 >5/%@/ 北京 F^=X=<4 INNU%&?
响叶杨 >5/0-($G$0/ 陕西 ’KDD河北杨 >5#$G-*-(2*2 北京 F^=X=<4 INNU%&A
银腺杨 >5/%@/ 9>56%/(03%$2/ 韩国 j0;FD INNU%&"
黑杨派 7*6-*+$2
美洲黑杨 >50-%.$*0-2*
美洲黑杨 >50-%.$*0-2+
美国 -8F;=TD
NLnU%%"
NLnU%%#
加杨 >59"/(/0-(2*2 北京 F^=X=<4 NLnU%%B
欧美杨 &%" >59-3+/,-+*"/(/ 7"! h"A0 北京 F^=X=<4 NLnU%&$
箭杆杨 >5(*6+/ WD;5.#-)-2.*(/ 河北 eFJF= NLnU%&%
钻天杨 >5(*6+/ WD;5*./%*"/ 河北 eFJF= NLnU%&&
青杨派 D/"/,/#/"/
小叶杨 >52*,$(* 内蒙古)<大青杨 >53223+*-(2*2 吉林 k=1=< kH^ U%$7
香杨 >523/)-$%-(2 韩国 j0;FD INNU%%!
川杨 >52U-"#3/(*"/ 四川 ’=TK3D< NLnU%&!
滇杨 >5;3((/(-(2*2 云南 C3<毛果杨 >5.+*"#$"/+G/ 美国 -8F;=TD NLnU%$"
胡杨派 D3+/(6/ 胡杨 >5-3G#+/.*"/ 新疆 H=大叶杨派 <-3"$*0-2 大叶杨 >5%/2*$"/+G/ 湖北 e3JF= NLnU%$B
外类群 i3S4;03G 馒头柳 !/%*P,/.230/(/ 北京 F^=X=<4 NLnU%7%
#A
6第 # 期 王保垒等’ 杨树抗逆转录因子基因内 ’’Y标记的开发
@?>A总 J8;的提取
总 L+-提取按 L+FDOMZ1D)@?BA..!位点发现及引物开发
作者所在课题组在进行小叶杨抗逆转录因子基
因单核苷酸多态性分析时检测到 &? 个转录因子基
因内存在 ’’Y多态性位点!并设计了基因特异的
Z(Y扩增引物&
@?CA..!位点扩增及电泳检测
根据设计的核苷酸引物对应用 $? %.L+-聚
合酶链式反应"Z(Y$体系! 以杨属不同种及小叶
杨种 内 不 同 个 体 提 取 的 L+-为 模 板! 加 入
$2? %.&% 9J3PF;! &2# %.$? 8801-.@& E4(1$ !
& %.&% 8801-.@& R+,Z!D/BL+-聚合酶 &2% q
"以上试剂购自 Z;08F4D公司$ ! &% %801-.@&正向
和反向引物各 & %.! 加适量双蒸水至 $? %.& 于
B! c!7 8=< ) " B7 c! 7% O) ?A c! 7% O)
"$ c! !% O$ 7? 个循环)"$ c! ? 8=< 热循环条
件下!扩增出预期长度的目的片段& 扩增产物加
入 &% %. .0DR=<4 J3PF;" B#d 甲 酰 胺!
&% 8801-.@& *L,-!%2$?d二甲苯青!%2$?d溴酚
兰$ !经变性后在 Ad的变性聚丙烯酰胺胶上电泳
分离! 条 件 是 B? I! 恒 功 率 电 泳 约 "% 8=<&
电泳后采用银染检测方法进行显色观察!记录扩
增结果&
@?DA小叶杨自然群体遗传多样性分析
依据 7A 株小叶杨 ’’Y基因型数据! 采用
ZiZ:*+*&27$ 程序计算自然群体中等位基因数
"CD$%有效等位基因数"CF$%观测杂合度"O0$%期
望杂合度 "OF$ 与近 交系数 "9=O$ 等遗 传多 样
性参数& 66
@?MA..!引物的有效性评价
利用开发的 ’’Y引物!检测其在杨属内 ? 个
派间与派内不同个体间的有效性扩增!并分析其
多态性# 在此基础上!用 ZiZ:*+*&27$ 聚类分析
软件计算基于 +F=‘O无偏遗传距离 "+=F! &B#" $ !
根据遗传距离由 ZeC.)Z中的邻接法 qZ:E-构
建系统聚类图!最终在分子水平上确定杨属内各
派间亲缘关系&
$6结果与分析
>?@A检测小叶杨抗逆相关转录因子基因内 ..!
位点
鉴于植物各种诱导型基因的表达主要受特定
转录因子在转录水平上调控这一特点!开发抗逆
转录因子基因内发生的 ’’Y多态性位点是进行该
物种 ’’Y分子标记辅助抗逆育种的基础& 为此!
选取了在非生物胁迫如极端温度%干旱及高盐等
差异表达的 7 个基因家族中共 $& 个转录因子候选
基因作为目标!对这些基因的启动子%?‘q,Y%外
显子%内含子%7‘q,Y进行了克隆与测序 "表 $$ &
由表 $ 可见!分析的这 $& 个转录因子基因长度为
"%# bB 7%7 JG!共覆盖杨树基因组长度 ?B 7#B JG&
通过对这 $& 个基因在 7A 株小叶杨基因型个体中
的序列比对后共检测到 7& 个 ’’Y位点!’’Y出现
的频率为 & h& B&A JG"表 7$ & 由表 7 可见!开发的
这 7& 个 ’’Y位 点! 分 别 位 于 基 因 的 启 动 子
"7#2"d$ %?‘q,Y" B2"d$ %外显子 " $$2Ad$ %内
含子"B2"d$及 7‘q,Y"&B2!d$ "表 7$ & 在这 7&
个 ’’Y位点中!碱基重复呈现出 $ b? 碱基形式!
其中以二碱基重复的位点有 &A 个!占总数的
?&2Ad!且尤以"-,$ (!"(,$ (!"-:$ ( 较普遍 "表
7$ &
>?>A..!位点 F6!扩增引物的开发及其有效性
验证
为了合理利用检测到的转录因子基因内 ’’Y
位点!就需要开发有效扩增这些位点的引物& 因
此!在 ’’Y位点发现的基础上!依据其两端的保守
序列!设计了 7& 对 ’’Y位点 Z(Y扩增引物 "表
!$ & 为了检测这些引物组合在杨属内的通用性及
Z(Y扩增的有效性!以表 & 所列的杨属白杨派%黑
杨派%青杨派%胡杨派及大叶杨派内 $$ 个基因型
个体为材料进行了 Z(Y扩增及有效性检测"表 !!
表 ?$ & 可见!除引物对 ’’Y&" 与 ’’Y$B 仅能在杨
属 7 个派内进行有效扩增外!其他 $B 对引物组合
都至少能在 ! 个派内个体中进行有效扩增!占引
物总数的 B72?d "表 ? $ & 这一结果显示!设计的
引物比较理想!同时也推测转录因子基因序列在
杨属内的相对保守性& 理想的 ’’Y位点不仅要求
能够在目标物种中得到有效扩增!更需要它们在
杨属派间或派内具有多样性变异& 为此!统计了
在派间或派内具有多样性扩增的 ’’Y位点数量
"表 ?$ & 由表 ? 可见!仅有 $ 个 ’’Y位点 " ’’Y&"
与 ’’Y$B$分别仅能在白杨派与青杨派 & 个派内不
同个体中显示出多样性!其他位点均至少在 $ 个
派内个体间具有多样性& 因此!本文在抗逆相关
转录因子基因内检测到的 ’’Y位点在杨属内具有
较高的多样性&
BA
林 业 科 学 !" 卷6
表 >A用于 ..!检测的候选基因
9$,E>A6$(2&2$%"I"(")0)"25’/..!2"%"1%&’(
基因
:F推测的基因功能
Z3SDS=WFP3分析的
基因长度
:FDCOH家族
COHPD8=1M
>2COHa
>2COHb
T1’V家族
T1’VPD8=1M
>2T1’Vc
>2T1’Vd
>2T1’Ve
>2T1’Vf
O2&家族
O2&PD8=1M
>2O2&g
>2O2&c
>2O2&d
>2O2&e
>2O2&aa
>2O2&ab
>2O2&ah
>2O2&ag
>2O2&ad
>2O2&ae
>2O2&ai
>2O2&ba
>2O2&bb
>2O2&bh
>2O2&bg
总和 ,0SD1
盐诱导差异表达
’D1SOS;FOO=盐诱导差异表达
’D1SOS;FOO=非生物胁迫表达
*QG;FOO=0< 3非生物胁迫表达
*QG;FOO=0< 3盐诱导差异表达
’D1SOS;FOO=高温诱导表达
e=4K SF8GF;DS3;F=热激诱导表达
eFDSOK0T] OS;FOO=热激诱导表达
eFDSOK0T] OS;FOO=热激诱导表达
eFDSOK0T] OS;FOO=非生物胁迫表达
*QG;FOO=0< 3温度诱导表达
,F8GF;DS3;F=低温诱导表达
.0VSF8GF;DS3;F=非生物胁迫表达
*QG;FOO=0< 3非生物胁迫表达
*QG;FOO=0< 3非生物胁迫表达
*QG;FOO=0< 3热激诱导表达
eFDSOK0T] OS;FOO=热激诱导表达
eFDSOK0T] OS;FOO=热激诱导表达
eFDSOK0T] OS;FOO=热激诱导表达
eFDSOK0T] OS;FOO=非生物胁迫表达
*QG;FOO=0< 3热激诱导表达
eFDSOK0T] OS;FOO=A A?A
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>?BA..!位点在小叶杨及杨属内不同个体间的等
位变异
检测开发的 ’’Y位点在小叶杨及杨属内不同
种间的等位变异是有效利用这些 ’’Y位点的基础!
因此!统计了所有 ’’Y位点在小叶杨自然群体及杨
属内不同个体间的等位变异& 总体上! 检测到的这
表 BA基因内开发的 ..!位点
9$,EBA..!#’1&2"K"#’+"2-&%*&(I"(")
’’Y位点
’’Y10T=
重复基元
’’Y80S=P
’’Y位点来源
’’Y10T=O03;TF
’’Y& "-,$ &7 >2COHa G;080SF;
’’Y$ "(,$ && >2COHb G;080SF;
’’Y7 "(,$ &% >2COHb G;080SF;
’’Y! "-::$ ! >2COHb FQ0< &
’’Y? "(,,$ A >2COHb =’’YA "-:$ B >2COHb =’’Y" "(::$ 7 >2T1’Vc T0R=<4;F4=0<
’’Y# "-,$ " >2T1’Vc ?‘q,Y
’’YB "(,,,,$ A >2T1’Ve 7‘q,Y
’’Y&% "-(($ && >2T1’Vf T0R=<4;F4=0<
’’Y&& "(-,$ ? >2O2&g 7‘q,Y
’’Y&$ "-(($ A >2O2&c 7‘q,Y
’’Y&7 "-,$ &% >2O2&d G;080SF;
’’Y&! ":,$ " >2O2&d =’’Y&? "-,$ # >2O2&e 7‘q,Y
’’Y&A "--,$ " >2O2&aa G;080SF;
’’Y&" ":,$ &$ >2O2&aa G;080SF;
’’Y&# "-,$ &7 >2O2&ab G;080SF;
’’Y&B "(,$ &! >2O2&ab 7‘q,Y
’’Y$% ",::$ ? >2O2&ah T0R=<4;F4=0<
’’Y$& ",---$ ! >2O2&ag G;080SF;
’’Y$$ "-,,,$ " >2O2&ad G;080SF;
’’Y$7 ",-$ # >2O2&ad 7‘q,Y
’’Y$! ":-$ $% >2O2&ae G;080SF;
’’Y$? "(,$ &% >2O2&ae G;080SF;
’’Y$A "-,:$ " >2O2&ai T0R=<4;F4=0<
’’Y$" "-:$ " >2O2&ba ?‘q,Y
’’Y$# "-,$ $7 >2O2&bb G;080SF;
’’Y$B ",(-$ ? >2O2&bb ?‘q,Y
’’Y7% "::,$ " >2O2&bh T0R=<4;F4=0<
’’Y7& "-::$ A >2O2&bg T0R=<4;F4=0<
些 ’’Y位点在小叶杨自然群体中展示了丰富的多
样性!’’Y基元的重复次数变异范围为 7 b$7 "表
7$& 在此基础上!检测了小叶杨自然群体中的遗传
多样性"表 A$!7& 个位点的有效等位基因数"CF$为
&2A"$ b?2&"7!平均为 72!?## 这些位点的观察杂合
度"O0$与期望杂合度 "OF$平均分别为 ?%2Ad与
AB2&d!表明小叶杨群体内因有一定程度自交现象
而导致纯合子过量& ’KD<<0< 信息指数 "L$在各位
点间较为稳定!均高于 &2%!平均为 &2!?"& 由表 A
可知!近交系数"9=O$中除 ’’Y& 与 ’’Y7 $ 个位点为
负值外!其余位点在小叶杨自然群体中均为正值!平
均为 %2$B?!显示群体内个体间纯合子过量而杂合
体缺失&
若 ’’Y位点处于基因的编码区!则 ’’Y基元是
7!以保证密码子编码氨基酸的正确性!如 >2T1’Vf
基因编码区域的 ’’Y&% 位点!在小叶杨自然群体演
化过程中密码子 -((形成了 ! b&& 次的多样性变
异"表 7$& 比较了来源于基因内不同区域 ’’Y位点
%"
6第 # 期 王保垒等’ 杨树抗逆转录因子基因内 ’’Y标记的开发
的多样性变异!结果表明!源于基因调控区域如启动
子与 q,Y区域的 ’’Y位点无论在小叶杨种内不同
个体间还是在杨属内不同派间均显示出较高的多样
性& 如位于 >2COHa 和 >2COHb 启动子区域的 ’’Y
位点!-,与 (,单元的重复次数均在 &% 以上!显示
了启动子区域 ’’Y位点在小叶杨种内具有广泛的
遗传变异& 而在杨属内不同种间也展示了较为广泛
的等位位点多样性!变异范围为 7 b&$ 个!共检测
到 &#B 个多样性位点!平均 A 个"表 !$&
>?CA开发的 ..!位点在杨属系统分类中的应用
选取了能在杨属 ? 个派内均能扩增的 $" 个
’’Y位点来检测杨属内不同种间的遗传进化关系&
结果显示!$$ 份供试材料在 ’’Y水平上表现出明显
的多态性差异!且可很容易区分出不同派间的杨树
个体"图 &$& 如图 &-与 &^分别用 ’’Y&$ 和 ’’Y$B
可将杨属 ? 个派内 $$ 个基因型个体划分成 ! 类!即
青杨派"编号 & bA$%白杨派"编号 " b&!$%黑杨
派"编号 &? b$%$%胡杨派 "编号 $&$与大叶杨派
"编号 $$$"图 &$& 在此基础上!基于 ’’Y多态性数
据对 $$ 个供试材料进行了聚类分析"图 $$& 由图 $
可见!以柳树为外类群!所有杨属个体聚在一起!且
可明显区分成 ? 个亚分支!相应于杨属 ? 个派!其中
青杨派与黑杨派首先聚在一起!然后依次分别与胡
杨派及大叶杨派聚为一个大的分支!而白杨派与其
他 ! 个派系的亲缘关系则较远& 在此基础上!计算
了个体间的遗传距离及遗传相似系数& 本研究对杨
属内 $$ 个基因型个体的聚类结果与常规分类一致!
即各派在杨属中是明显独立的!黑杨派%青杨派%胡
杨派及大叶杨派亲缘关系较近!与白杨派亲缘关系
较远&
76讨论
随着全球气候变化和生态环境日益恶化!研究
植物抵御不同非生物胁迫的分子遗传调控机制就成
为国际研究热点")Z((! $%%"$& 为此!先前已在模
式植物和主要农作物中广泛开展了基于 n,.作图
的分子标记辅助选择育种!并取得显著进展 "jD1=D
-./%5! $%&&$& 而对于林木!已在杨树%桉树和松树
等主要用材树种中检测到了控制木材纤维品质如纤
维素 含 量% 纤 维 长 度 和 宽 度 等 性 状 的 n,.O
":;DSDGD41=D-./%5! &BBA# ’FVF1-./%5! $%%$# NKD<4
-./%5! $%%A# ,K388D-./%5! $%&%$& 这些研究虽然
大大提高了人们对复杂数量性状结构的认识!如控
制这些性状的 n,.O的数量%大小及其互作方式! 但
由于树木本身具有高度杂合%树体高大%生长周期较
表 CA..!引物及在杨属内检测到的等位变异!
9$,ECA..!+/&4"/+$&/)$(2..!$#"#"
K$/&$%&’(2"%"1%"2&(!%6,$,&
’’Y位点
’’Y10T=
引物序列
Z;=8F;OFl3F’’Y&
[’ :(-:,((-(--((,(((,,,
Y’ (-(,:(-:-,,:,,:(((,-,
&?7 ?
’’Y$
[’ (,(,:,,:,(((:(-((-,
Y’ -(--:(,((,((,:,:-(,
&A# ?
’’Y7
[’ (,-,-,,(,-,-,(:(,(,(,(-
Y’ -,--(-(,(::-,-((,,(--
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’’Y!
[’ ::-::--,,:-,:(---,:(-:-
Y’ :-:-::-(:-:(-,(-,:-
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总和 ,0SD1 &#B
66$ <’ 预期片段长度 *QGFTSFR G;0R3TS1F<4SK# C’ 检测到的等位
位点数目 +38JF;0PD1F1FO0JOF;WFR5
&"
林 业 科 学 !" 卷6
表 DA..!引物在杨属内个体扩增的有效性评价!
9$,EDAGK$#0$%&’(’5%*"0%&#&%= ’5..!5’/’%*"/
!%6,$,&)+"1&")
’’Y位点
’’Y10T=
青杨派
D/"/,/#/"/
白杨派
<-3"-
黑杨派
7*6-*+$2
胡杨派
D3+/(6/
大叶杨派
<-3"$*0-2
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66$. p/ ’ 具有多样性位点 Z01M80;GK=T10T=# . @/ ’ 无多样性位
点 +0表 MA不同位点小叶杨群体的遗传多样性分析
9$,EMA;($#=)&)’5I"("%&12&K"/)&%= 5’/
!4&-3%2-+’+0#$%&’()$%B@ ..!#’1&
位点
.0T3O
遗传多样性 :F有效等位
基因数 CF
观察杂合
度 O0
期望杂合
度 OF
’KD<<0<
信息指数 L
近交系
数 9=O
’’Y& $2!7B %2"?A %2"$$ &277% @%2%!B
’’Y$ 72#"A %2A&& %2#?$ &2!&$ %2$B7
’’Y7 !2#&" %2"#7 %2"$% &2&?& @%2%#$
’’Y! ?2%!? %2!!& %2"?! &2"!B %2!%#
’’Y? !27?? %2?7? %2#77 &2B"B %27##
’’YA 72!#& %2??B %2AA$ &27A# %2&!"
’’Y" 7277? %2?#B %2A!$ &2$A# %2&7"
’’Y# 72A%# %2!B! %2"%B &2!%B %277#
’’YB 72?!7 %2!A! %2"AB &27%# %27$#
’’Y&% ?2&$! %27B# %2"$A &2#7& %2?&#
’’Y&& 72??? %2$7A %2A7" &2$$B %2AB!
’’Y&$ 72$B% %2"A! %2A#& &2!&" %2%"$
’’Y&7 $2!%? %27B& %2A"$ &27B# %2!A?
’’Y&! 72##$ %277? %2"$A &2$?" %2?"&
’’Y&? $2!B7 %2A7? %2?"# &2%7A %27#B
’’Y&A $2#"B %2!AB %2A!& &2$%! %2$B%
’’Y&" &2A"$ %27"? %277# &2%%" %2$7"
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’’Y&B 72!?# %2A!& %2"#7 &2"$& %27"B
’’Y$% $2!!A %2??# %2?BB &2&7# %2%!B
’’Y$& !2??! %27?7 %2"7$ &2"?$ %2??$
’’Y$$ 72%&? %2?#B %2A## &2?7& %2&77
’’Y$7 72!#$ %2?BA %2"#$ $27&$ %2$&#
’’Y$! 72#?A %2AB7 %2A!# &2A!# %2&$7
’’Y$? 72&!% %27AB %2ABB &2?BB %277B
’’Y$A ?2&"7 %27"# %2#&A &2#A" %2?&#
’’Y$" 72$$$ %2!?B %2?#& &2$7? %2&?!
’’Y$# 72?B& %2?A! %2"7A &27%# %2$$B
’’Y$B 72$#" %2$$$ %2A!# &2"?! %277#
’’Y7% $2&&A %2!&? %2"B$ &2!&B %2!!"
’’Y7& 72&$" %2?"& %2?#" &2$$7 %2%?B
平均 EFD< 72!"? %2?%A %2AB& &2!?" %2$B?
图 &6’’Y&$"-$与 ’’Y$B" $^引物组合对 $$ 份杨属种间材料扩增的 ’’Y位点
[=45&6,KFD8G1=P=FR ’’Y10T=0P$$ =$G3%32JM’’Y&$ DE’ 标准 L+-分子量 " Gq(&BhE2G)$ ’SD523/)-$%-(2# $’ 大青杨 >53223+*-(2*2# 7’ 小叶杨
>F2*,$(*# !’ 毛果杨 >5.+*"#$"/+G/# ?’ 滇杨 >5;3((/(-(2*2# A’ 川杨 >52U-"#3/(*"/# "’ 毛白杨 >5.$,-(.$2/# #’ 银腺杨 >5/%@/ 9
>56%/(03%$2/# B’ 响叶杨 >5/0-($G$0/# &%’ 欧洲山杨+ >5.+-,3%/+# &&’ 欧洲山杨*>5.+-,3%/ *# &$’ 山杨 >50/)*0*/(/# &7’ 银白杨
>F/%@/# &!’ 河北杨 >5#$G-*-(2*2# &?’ 美洲黑杨* >50-%.$*0-2*# &A’ 美洲黑杨+ >50-%.$*0-2+# &"’ 欧美杨 &%" >59-3+/,-+*"/(/
7"! h"A0 # &#’ 钻天杨 >5(*6+/ WD;5*./%*"/# &B’ 加杨 >59"/(/0-(2*2# $%’ 箭杆杨 >5(*6+/ WD;5.#-)-2.*(/# $&’ 胡杨 >F-3G#+/.*"/# $$’ 大叶
杨 >5%/2*$"/+G/# $7’ 馒头柳 !/%*P,/.230/(/5
$"
6第 # 期 王保垒等’ 杨树抗逆转录因子基因内 ’’Y标记的开发
图 $6基于 +F=‘O无偏遗传距离绘制的杨属内不同种间个体的 qZ:E-聚类图
[=45$6qZ:E-RF$G3%32JDOFR 0< +F=‘O3长%多为异交等特性!很难像模式植物或农作物那样
构建足够大的理想的近交系作图群体& 其中原因之
一所用标记大多为显性标记!有限的标记数量和性
状在群体中的变异幅度很小!且这势必导致 n,.O
的分辨率低%准确性差等缺陷& 因此!在林木中很难
将所检测到的 n,.O应用于标记辅助选择来提高遗
传增益或进行图位克隆&
而 ’’Y作为一种分子标记技术!与其他标记如
Y[.Z!Y-ZL及 -[.Z等相比!具有多态性高%共显
性%L+-用量少%实验重复性好%结果可靠等优点!
并已利用基因组插入文库筛选法%微卫星富集法及
数据库生物信息学搜索法在林木中开发了一批 ’’Y
标记",3O]D< -./%5! $%%!# CDO0RKD-./%5! $%%## C=<
-./%5! $%%B$& 但由于先前开发的这些 ’’Y位点多
来自基因组的随机区域!可能在物种的系统演化%指
纹图谱绘制与种质鉴定等领域具有较好的应用前
景!但在 ’’Y标记辅助选择育种实践中则经常会出
现 ! 方面的问题’一是随机区域特别是基因间隔区
虽可检测到较多的 ’’Y位点!但由于这些区域的保
守性较低!则会造成在一个物种中开发的 ’’Y标记
很难在近缘物种中得到有效利用# 二是这些 ’’Y多
呈中性进化!很难检测到与表型性状显著连锁的
’’Y位点"/DOF8y4=-./%5! $%%?$# 三是即使检测到
与目标性状连锁的 ’’Y位点!但由于 ’’Y位点与控
制目标性状的基因连锁比较松散!在未来 & b$ 代杂
交育种中就会造成标记与基因间的分离# 四是随机
开发的 ’’Y标记位点一般解释表型遗传变异的比
例较少!很难对目标性状进行直接选择& 功能基因
组学研究表明!植物的抗旱%耐极端温度和高盐等抗
逆性状是由多基因控制的数量性状!且控制抗逆基
因的表达主要受特定转录因子在转录水平上的调控
"-4D;VD1-./%5! $%%A$& 在逆境条件下!一个抗逆转
录因子能够与基因组中含有特定顺时作用元件结合
从而有效转录调控诸多抗逆基因的表达& 因此!若
能大规模开发抗逆转录因子基因调控或编码区的
’’Y位点!将会在抗逆性状标记辅助选择或分子育
种中发挥作用&
本文以我国乡土抗逆树种小叶杨为模式!首次
在林木中报道了 7 个抗逆转录因子家族共 $& 个基
因成员中开发的 ’’Y位点& 通过对 7A 个小叶杨基
因型个体!$& 个候选基因的启动子%?‘q,Y%外显
子%内含子及 7‘q,Y分析!共检测到了 7& 个多态性
’’Y位点"表 7$& 由于功能基因在物种系统演化过
程中受到较强的选择压!造成基因位点序列的保守
性!’’Y位点在 $& 个转录因子基因内出现的频率较
低!为 &h& B&A JG"表 $!表 7$& 与先前在青杨派树
种毛果杨">5.+*"#$"/+G/$中开发的 ’’Y标记相比!
具有明显的优点& 优点之一是本文报道的是多态性
的 ’’Y位点!而在毛果杨中是基于一个基因型个体
检测到具有简单序列重复的 ’’Y位点!在不同基因
型个体中不一定具有多态性 ",3O]D< -./%5! $%%!#
C=< -./%5! $%%B$#优点之二是基因内开发的 ’’Y标
记能够扩展应用到同一属内不同亚属甚至同一科
内& 本文开发的 ’’Y标记中!B72?d的位点能够在
杨属内至少 ! 个派内不同树种中有效扩增!且在派
内不同个体中显示了广泛的遗传变异!共检测到
7"
林 业 科 学 !" 卷6
&#B 个多样性位点!变异范围为 7 b&$ 个& 虽然目
前基于表达序列标签"FQG;FOOFR OFl3F开发的 ’’Y标记在群体遗传学及标记辅助选择育
种研究中也显示了强有力的生命力!但也存在明显
的不足之处!如真核生物基因内一般会存在 & 个至
多个内含子!基于 *’,开发的引物对经常会落在内
含子与外显子的剪切位点而不能得到扩增!在数据
分析时被误认为是零等位" <31D1F1F$!从而造成错
误的结论"*1=O-./%F! $%%"$&
参 考 文 献
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NKD<4LFl=D<4! NKD<4NK=M=! CD<4jD=5$%%A2n,.DDG0G1D;">$G3%32.$,-(.$2/ 9>F@$%-/(/$ 9>5.$,-(.$2/F(D< k
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NKD<4kN! (;FF18D< Y-! NK3 kj5$%%!2[;081DJ0;DS0;MS0P=F1R’
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