全 文 ：第 ww卷 第 ts期
u s s {年 ts 月
林 业 科 学
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草决明荚枯病病原鉴定 3
刘会香t 赵新兰t 牛福芳t 潘彦平u 刘爱新t
kt1山东农业大学植保学院 泰安 uztst{ ~u1 北京市林业局保护站 北京 tsssu|l
摘 要 } ussy ) ussz年在山东农业大学中药材试验站栽培的药用植物草决明上发现一种新病害 o定名为草决明
荚枯病 ∀该病主要危害荚果 o荚果受害后均从尖端开始发病 o使受害部分变褐枯死 o不能正常结籽 ∀从多个发病荚
果中共分离到 tt株相同真菌分离物 o针刺法接种荚果后均可引起荚果发病 ∀根据该病原菌形态学特征 !培养性状
并结合µ⁄‘„ p Œ×≥序列分析 o将引起草决明荚枯病的病原鉴定为葡萄座腔菌 o这也是首次在草决明荚果上发现由
该种病菌引起的病害 ∀
关键词 } 草决明荚枯病 ~症状 ~病原鉴定 ~ Βοτρψοσπηαερια δοτηιδεα
中图分类号 }≥zyv1tx 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{lts p ss|w p sw
收稿日期 }uss{ p sz p sw ∀
基金项目 }国家自然科技资源共享平台项目/林业微生物菌种资源标准化整理 !整合及共享试点0kussx⁄Ž„utusz p t|l ∀
3 刘爱新为通讯作者 ∀
Πατηογεν Ιδεντιφιχατιον οφ Λεγυµε ∆ιεβαχκ οφ Χασσιατορα
¬∏‹∏¬¬¬¤±ªt «¤² ÷¬±¯¤±t ‘¬∏ƒ∏©¤±ªt °¤± ≠¤±³¬±ªu ¬∏„¬¬¬±t
kt1 ∆επαρτµεντ οφ Πλαντ Πατηολογψo Σηανδονγ Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ται. αν uztst{ ~
u1 Προτεχτιον Στατιον οφ Βειϕινγ Φορεστρψ Βυρεαυ Βειϕινγ tsssu|l
Αβστραχτ } „ ±¨ º §¬¶¨¤¶¨ ±¤°¨ §¯¨ ª∏°¨ §¬¨¥¤¦®²© Χασσιατορα º¤¶©¬µ¶·©²∏±§¬± פ¬¤± ²©≥«¤±§²±ª°µ²√¬±¦¨ §∏µ¬±ªussy )
ussz1 ׫¨ §¬¶¨¤¶¨ º¤¶°¤¬±¯¼ «¤µ°©∏¯ ©²µ¯ ª¨∏°¨ ¶qŒ±¬·¬¤¯ ¼¯o·«¨ ·¬³¶²©§¬¶¨¤¶¨§¯¨ ª∏°¨ º¨ µ¨ ªµ¤¼2ªµ¨ ±¨ ¤±§¯¨ ª∏°¨ §¬¨¥¤¦®
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µ¬¥²¶²°¤¯ ⁄‘„2Œ×≥ o·«¨ ³¤·«²ª¨± º¤¶¬§¨±·¬©¬¨§¤¶ Βοτρψοσπηαερια δοτηιδεα ≤ ¶¨ ·¨§¨ ‘²·q׫¬¶¬¶·«¨ ©¬µ¶·µ¨³²µ·²©¯¨ ª∏°¨
§¬¨¥¤¦®²© Χασσιατοραq
Κεψ ωορδσ} ¯¨ ª∏°¨ §¬¨¥¤¦®²© Χασσιατορα~¶¼°³·²°¶~³¤·«²ª¨±¬¦¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²±~ Βοτρψοσπηαερια δοτηιδεα
草决明k Χασσια τοραl为豆科植物 o广泛分布于热带和亚热带地区 o在我国安徽 !广西 !四川 !浙江 !广东等
地栽培面积较大 ∀其干燥成熟种子即决明子 o是中医临床最常用药材之一 ∀该药材具有祛风散热 !清肝明
目 !润肠通便的功效 o主要成分有蒽醌类 !萘并吡喃类 !多糖类化合物及锌 !锰等多种微量元素k贾振宝等 o
ussyl ∀研究表明 }其具有降压 !降血脂 !抗菌等作用 o尤其对高血压 !高血脂等心血管疾病疗效较好 ∀由于良
好的降脂效果 o目前又成为减肥用品中的最常用组分 o是国家卫生部公布的 y|种药食同源的植物之一k吕翠
婷等 oussyl ∀
草决明在我国栽培历史悠久 o但国内对该药材的研究主要集中在分类鉴定 !内在质量 !有效成分 !药理作
用及作用机制等方面k张颖等 oussw ~张加雄等 oussyl o对其栽培过程中的病害问题研究很少 ∀作者于
ussy ) uss{年 o在山东农业大学药材试验站种植的草决明荚果上发现一种新病害 o该病害可造成 ts h以上
荚果受害 o危害严重 ∀本研究对病害的病原进行系统研究和鉴定 o以期为病害的控制提供理论依据 ∀
t 材料与方法
111 标本采集及病原菌分离
病害标本分别采自山东农业大学中药材试验站和山东农业大学园艺试验站 ∀
病原菌的分离和纯化采用组织分离方法 o置 °⁄„培养基上于 ux ε 恒温培养 o待菌落长出后 o挑选形态
一致的菌落转入 °⁄„平板继续培养 o观察菌落形态 ∀
112 病原菌形态观察
在体视显微镜下检查采集的病荚 o观察拍摄分生孢子器在病荚表面的分布 ∀选取具有典型症状的草决
明病荚标本 o采用徒手切片法切取子实体 o显微镜下观察病菌分生孢子器和分生孢子形态 o分别测定 tss个
分生孢子器和分生孢子 o计量分生孢子器及分生孢子大小 ∀
113 致病性测定
采用离体菌丝块接种法对分离菌株进行致病性测定 ∀选取健康未成熟的草决明幼荚 o用 zx h的酒精表
面消毒 o将 °⁄„平板上培养 w §的培养物用直径 y °°的打孔器在菌落边缘打出菌饼 o采用无伤和刺伤进行
接种 ∀无伤接种是将菌饼直接贴接于幼荚表面 o刺伤接种用一次性注射器针头在健康幼荚表面针刺后 o将菌
饼贴接于刺伤部位 o每处理接种 ts个幼荚 o以 °⁄„ 琼脂块同样处理接种为对照 ∀ux ε 培养箱内保湿培养 ∀
接种 u §后移去菌丝块 o观察发病情况 ∀根据柯赫氏法则 o对发病草决明荚再分离病原菌 o观察分离的病菌
是否与原接种菌株相同 ∀
114 病原菌生物学特性
t1w1t 病原菌对温度的适应性研究 分设 ts otx ous oux ou{ ovs ovx ε z个温度梯度 o取直径 x °°的菌落圆
片置于 °⁄„培养基上 o于上述温度下恒温培养 o间隔 uw «测量菌落直径 o并观察菌落生长形态 !颜色等 ∀每
处理重复 v次 ∀
t1w1u 病原菌对酸碱度的适应性 培养基灭菌后 o分别调节 ³‹值为 v ow ox ox1x oy oz o{ o| o接菌后于 ux ε 恒
温培养箱中培养 o间隔 uw «测量菌落直径 o计算日生长量 o观察菌落生长形态 !颜色等 o每处理重复 v次 ∀
115 ΙΤΣ区的 ΠΧΡ 扩增与序列分析
t1x1t 基因组 ⁄‘„的提取 选择菌株 ≥⁄„˜s{2t o将病原菌接种到铺有无菌玻璃纸的 °⁄„平板 ox §后收集
菌丝 o≤ׄ…法提取纯化基因组 ⁄‘„ o用于 °≤• 扩增 ∀
t1x1u °≤• 扩增及序列测定 采用真菌核糖体 ⁄‘„ kµ⁄‘„l 通用引物 oŒ×≥t和 Œ×≥w进行扩增 o引物序列分
别为 Œ×≥t }xχ p ×≤≤Š×„ŠŠ×Š„„≤≤׊≤ŠŠ p vχ oŒ×≥w }xχ p ×≤≤×≤≤Š≤×ׄ×׊„ׄ׊≤ p vχk上海生工生物工程
有限公司合成l ∀°≤• 循环设置如下 }|x ε 预变性 w °¬±o|x ε 变性 vs ¶oxx ε 退火 ws ¶ozu ε 延伸 t °¬±o设
vs个循环 o最后 zu ε 延伸 ts °¬±∀°≤• 产物经 t h琼脂糖凝胶电泳分析 ∀所用试剂购自上海生工生物工程
有限公司 ∀
用胶回收试剂盒kפ®¤µ¤公司l回收正确片断 o连接 ³⁄2t{2×载体kפ®¤µ¤公司l o转化大肠杆菌 ⁄‹2xΑo
°≤• 法筛选阳性克隆 o提取质粒 o经酶切鉴定正确后 o由上海博亚生物技术有限公司测序 ∀
t1x1v 序列分析与数据处理 测序后 o菌株的µ⁄‘„2Œ×≥序列与 Š¨ ±…¤±®核酸数据库中相关菌株进行相似性
比较 o用 ⁄‘„„‘软件构建系统发育树 o分析该菌与其他菌株的关系 ∀
u 结果与分析
211 草决明荚枯病症状
该病主要为害草决明的荚果 o均从荚果的顶k尖l端开始发病 ∀发病初期在荚果的顶端形成暗绿色 !水渍
状长条形斑 o病斑凹陷 o并迅速环绕整个荚果 ∀病斑沿荚果的顶端逐渐向内扩展 o形成边缘褐色 o中部灰褐色
至灰白色的病荚 o荚果发病部分明显凹陷 o不膨大 ∀有时病斑边缘暗绿色 o病健交界处不明显 o病部明显缢缩
k图版 ´ p „ o箭头所示l ∀后期在发病部位密布黑色小颗粒 o排列不规则 ∀病部可延伸至整个荚果的 tΠu o导
致病部以上的荚果枯死k图版 ´ p „l ∀荚果发病部分很少形成籽粒 o发病较轻者偶有籽粒形成 o但籽粒干
瘪 !黑褐色 !表皮不光滑k图版 ´ p ≤l ∀根据病害症状 o将该病命名为草决明荚枯病 ∀
212 病原菌鉴定
u1u1t 病原菌形态特征 在解剖镜下镜检田间自然发病的荚果 o发现病原菌分生孢子器黑褐色 o初埋生寄
主表皮下 o后突破表皮部分外露k图版 ´ p ∞l ∀分生孢子器多为单生 o单腔室 o扁球形或球形 o有孔口 o大小
约ktts1tu ∗ txw1u{lΛ° ≅ k{u1zw ∗ txs1uvlΛ° o平均ktu|1yz ∗ ttw1uzlΛ°∀内壁生分生孢子梗 o孢子梗无色 o
不分支k图版 Œp ƒ oŠ o…和 ≤l ∀分生孢子梭形 o单胞 o无色 o顶端钝圆 o基部平截k图版 ´ p ‹l o大小为kty1{v
∗ uw1xxlΛ° ≅ kx1uz ∗ {1tzlΛ° o平均kt{1vx ≅ y1vwlΛ°∀
u1u1u 病原菌培养性状及生物学特性 将分离获得的不同菌株在 °⁄„培养基上培养 o共获得 tt株长势一
x| 第 ts期 刘会香等 }草决明荚枯病病原鉴定
致的分离物 ∀各分离物在 °⁄„培养基上生长迅速 o培养初期菌丝白色 !疏松 !棉絮状 o气生菌丝发达 o易纠
结 o菌落边缘整齐或不整齐 ∀培养 v §后 o菌落逐渐变成灰色 ots §左右 o菌落呈深灰色至黑色 o镜检发现 o菌
丝初期无色 o后为深褐色 o菌丝粗细不匀 o分枝发达 o有隔 ∀
从病原菌对温度 !酸碱性适应性方面对该病菌的生物学特性进行初步分析 o结果表明 }病菌在 ts ∗ vx ε
范围内均可生长 o但在 us ∗ u{ ε 时菌丝生长迅速 ow §后即可长满培养皿 o其他温度下生长较慢 ∀³‹测定表
明 o该菌在 ³‹w ∗ |均可生长 o但在 ³‹x1x ∗ y1x生长最好 o菌丝生长速度快 o其他 ³‹ 条件下生长相对较差 ∀
因此 o该菌生长适温范围为 us ∗ u{ ε o适宜的 ³‹范围为 x1x ∗ y1x ∀
u1u1v 致病性测定 菌丝块法接种结果表明 }经针刺接种的荚果 ov §后开始出现病斑 o病斑初期暗绿色 o水
渍状 o随后继续扩展形成暗褐色梭形斑 ∀而无伤贴接菌丝块的荚果只有 u个荚果表现轻微的水渍状 o且水渍
状未进一步发展 o对照处理也未产生任何症状 ∀从发病荚果上再分离的病菌与原接种菌株培养性状相同 o证
实原接种菌株为草决明荚的致病菌 ∀
图 t 草决明荚枯病菌 ≥⁄„˜s{2t与其他
菌株间的系统进化树
ƒ¬ªqt °«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¨¨²©¬{¶²¯¤·¨ ≥⁄„˜s{2t ¤±§
µ¨ ¤¯·¨§³¤·«²ª¨ ±¶¥¤¶¨§²± ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶²©Œ×≥ µ¨ª¬²±
u1u1w Œ×≥序列分析 为明确草决明荚枯病菌的类群 o在形态鉴定基础上 o进一步采用分子生物学方法进行
鉴定 ∀利用真菌Œ×≥t和Œ×≥w通用引物 o对草决明荚枯病菌 ≥⁄„˜s{2t的基因组 ⁄‘„进行 °≤• 扩增 o在 x{s¥³
左右扩增出一条单一条带 ∀经序列测定 o该片段大小为 x{v¥³∀将该序列与 Š¨ ±…¤±®中已有的 ⁄‘„序列进
行同源性比较 o发现与其同源性在 |x h以上的菌株共 tst个 ∀其中 oΒοτρψοσπηαερια δοτηιδεα {z个 oΒ qχορτιχισw
个 oΒ q ποπυλιk基因登录号 }xts|ws{zlt个 o其他类群如 Πηψσαλοσπορα πψριχολα o∆οτηιορελλα γρεγαριαo∆ιχηοµερα
σαυβινεττιιk Φυσιχοχχυµ αεσχυλιl oΜαχροπηοµινα πηασεολινα等 | 株 ∀所有 Β q δοτηιδεα菌株的 µ⁄‘„ Œ×≥ 序列与
≥⁄„˜s{2t的同源率均在 |{ h ∗ tss h o其中 tu株与该菌的同源率为 tss h ∀所得最大分值k≥¦²µ¨l为 tszz
¥¬·¶o分别为来自中国的石榴干腐病菌 Β q δοτηιδεαk基因登录号 }ª¬}t{vuv{ywvl和石榴疮痂病菌 Β q δοτηιδεα
k基因登录号 }ª¬}ty{{ts{{ul ∀同源性较低的有 Μαχροπηοµινα πηασεολιναk分值为 |vxl和 Ρηιζοχτονια βατατιχολα
k分值为 |u{l o同源率均为 |x h ∀
用 ⁄‘„„‘软件建立该菌与其他 tx个代表菌株的系统发育树 o结果如图 t ∀菌株 ≥⁄„˜s{2t的序列与
Š¨ ±…¤±®中 {个 Β q δοτηιδεα位于系统发育树的同一分支 o
遗传距离最近 ∀与其他两个 Β q δοτηιδεαk登录号 }{|||wtyu
和 {|||wtyvl及无性态的 ∆ q σαυβινεττιι即 Φυσιχοχχυµ αεσχυλι
k登录号 }x{ytwvx|l和 Β q ποπυλιk登录号 }xts|ws{zl相对较
近 ∀而与 ∆ q γρεγαριαk登录号 }t{zwzuvxzl及 Πq πψριχολα
k登录号 } t{zwzuvz{l相对较远 o与 Β q χορτιχισk登录号 }
{vuzsuxul遗传距离最远 ∀
根据上述病原菌的形态特征以及 Œ×≥序列同源性比较
的结果 o初步鉴定草决明荚枯病的病原菌为葡萄座腔菌
k Βοτρψοσπηαερια δοτηιδεα ≤ ¶¨ ·¨§¨ ‘²·ql ∀其分类地位属于子
囊菌门k„¶¦²°¼¦²·¤l !腔菌纲k²¦∏¯²¤¶¦²°¼¦¨·¨¶l !格孢腔菌
目k°¯ ²¨¶³²µ¤¯ ¶¨l !葡萄座腔菌科k…²·µ¼²¶³«¤¨µ¬¤¦¨¤¨ l o葡萄座
腔菌属k Βοτρψοσπηαεριαl ∀
v 结论与讨论
本研究通过对该病害病原菌的致病性测定 !病原菌的
形态观察和µ⁄‘„的 Œ×≥序列分析 o确定该病原菌为葡萄座
腔菌 o将该病害命名为草决明荚枯病 o这在国内外为首次报
道 ∀
葡萄座腔菌属k Βοτρψοσπηαερια ¶³³ql真菌是世界性分布
的病原菌 o由它引起的植物病害在世界 us多个国家流行危
害 o主要引起多种木本植物的枝干和果实病害 o如危害杨树
kΠοπυλυσl !苹果k Μαλυσl !石榴k Χατυναρεγαµl !桃树k Πρυνυαl
y| 林 业 科 学 ww卷
等的枝干而导致溃疡 !干腐 !流胶 o为害果实则导致果实腐烂等症状k张星耀等 oussy ~余仲东等 oussu ~付娟
妮等 ousszl ∀有关该类真菌在药用草本植物上引起的病害报道较少 ∀ Β qδοτηιδεα在草决明上的症状非常单
一 o目前主要发现危害荚果 o而在发病植株的茎杆和叶片等部位未发现症状 o与木本植物上的多种症状类型
差异较大 ∀由草决明荚枯病的症状还可以看出 o该病菌在荚果上仅发现无性态的分生孢子器和分生孢子 o未
发现有性时期的结构 ∀从 Š¨ ±…¤±®比对结果看 o在 tst个与 ≥⁄„˜s{2t同源性 |x h以上的菌株中 o{z个为 Β q
δοτηιδεα o且同源率均在 |{ h ∗ tss h o⁄‘„„‘构建的系统发育树也表明 o该菌与 Β qδοτηιδεα位于系统进化
树的同一分支 o表明引起草决明荚枯的病菌其有性时期为 Β qδοτηιδεα∀
Βοτρψοσπηαερια属真菌无性时期的分类鉴定较为复杂 o该属真菌曾先后与多个半知菌属相联系 o因此很难
把有性型和无性型正确地对应起来 ∀由于该菌的无性型特征如分生孢子颜色 !分隔 !分生孢子果的形态等都
是可变的 o因此仅依靠形态特征进行分类容易发生混淆k…∏·¬±ot||vl ∀赵嘉平等kusszl认为 Βοτρψοσπηαερια
无性阶段可能分别对应于色二孢属k ∆ιπλοδιαl和壳梭孢属k Φυσιχοχχυµl o而我国林木病理学界曾广泛使用无
性型 ∆ q γρεγαρια∀王金利等kussxl综合分析以前的研究结果后认为 oΒ q δοτηιδεα的无性型应该是 Φq αεσχυλι
而不是 ∆ q γρεγαρια∀本研究中 o草决明荚枯病菌 ≥⁄„˜s{2t菌株在基于µ⁄‘„2Œ×≥序列的系统进化树中 o与分
离自桉树的 ∆ q σαυβινεττιι即 Φq αεσχυλιk登录号 }x{ytwvx|l的遗传距离更为接近 o表明该病原菌的无性型可
能为 Φq αεσχυλι o有关这方面的研究正在进行中 ∀
参 考 文 献
付娟妮 o刘兴华 o蔡福带 o等 qussz q石榴采后腐烂病病原菌的分子鉴定 q园艺学报 ovw kwl }{zz p {{u q
贾振宝 o丁霄霖 qussy q决明子中蒽醌类成分研究 q中药材 ou|ktl }u{ p u| q
吕翠婷 o黎海彬 o李续娥 o等 qussy q中药决明子的研究进展 q食品科技 o{ }u|x p u|{ q
王金利 o秦国夫 o贺伟 o等 qussv q葡萄座腔菌属及其相关真菌的系统学研究进展 q中国森林病虫 ouukvl }vu p vy q
余仲东 o曹支敏 o张星耀 qussw q杨树溃疡病 !苹果轮纹病等病原菌的 Œ×≥2µ⁄‘„2 • ƒ°解析 q中国森林病虫 ouvkul }tx p t{ q
张 颖 o张立木 o杨志孝 o等 qussw q草决明不同部位中无机元素的含量测定 q泰山医学院学报 ouxktl }vv p vw q
张加雄 o万 丽 o胡轶娟 o等 qussy q决明子降血脂有效部位的研究 q时珍国医国药 otzkyl }|sw p |sx q
张星耀 o赵嘉平 o梁 军 o等 qussy q树木溃疡病菌主要类群系统地位及茶 子葡萄座腔菌的种内一致性 q林业科学 owukttl }yv p y{ q
赵嘉平 o梁 军 o吕 全 o等 qussz q葡萄座腔菌属k Βοτρψοσπηαεριαl系统分类评述 q林业科学研究 ouskvl }wtx p wuu q
…∏·¬± ‹ qt||v q²µ³«²¯²ª¬¦¤¯ ¤§¤³·¤·¬²± ¤±§¶³²µ¨ ³¯ ²¨°²µ³«¬¶°¬±·«¨ ©²µ°2¦²°³¯ ¬¨ ∆ιχηοµερα2Χαµαροσποριυµ ¤±§ Φυσιχοχχυµ2∆οτηιορελλα q≥¼§²º¬¤owx }tyt
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k责任编辑 王艳娜l
z| 第 ts期 刘会香等 }草决明荚枯病病原鉴定