全 文 ：第 v|卷 第 w期
u s s v年 z 月
林 业 科 学
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干旱胁迫对白桦实生幼苗叶片蛋白质的影响 3
孙国荣 彭永臻
k哈尔滨工业大学市政环境工程学院 哈尔滨 txsssyl
阎秀峰
k东北林业大学森林资源与环境学院 哈尔滨 txsswsl
张 睿
k哈尔滨师范大学生物系 哈尔滨 txss{sl
关键词 } 白桦实生幼苗 o干旱胁迫 o蛋白质 o≥⁄≥2聚丙烯酰胺凝胶电泳 o双向电泳
收稿日期 }usst p tt p tw ∀
3 孙国荣现在扬州大学生物科学与技术学院k扬州 uuxss|l工作 ∀彭永臻同时在北京工业大学环境与能源工程学院k北京 tsssuul
工作 ∀
ΤΗΕ ΕΦΦΕΧΤ ΟΦ ∆Ρ ΟΥΓΗΤ ΣΤΡΕΣΣ ΥΠΟΝ ΠΡ ΟΤΕΙΝ ΧΟΜΠΟΝΕΝΤ
ΙΝ ΛΕΑς ΕΣ ΟΦ ΒΕΤΥΛΑ ΠΛΑΤΨΠΗΨΛΛΑ ΣΕΕ∆ΛΙΝΓΣ
≥∏± Š∏²µ²±ª °¨ ±ª ≠²±ª½«¨ ±
k Σχηοολοφ Μυνιχιπαλανδ Ενϖιρονµενταλ Ενγινεερινγ oΗαρβιν Ινστιτυτε οφ Τεχηνολογψ Ηαρβιν txsssyl
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k Φαχυλτψοφ Φορεστ Ρεσουρχεσ ανδ ΕνϖιρονµεντoΝορτηεαστ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Ηαρβιν txsswsl
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k ∆επαρτµεντ οφ ΒιολογψoΗαρβιν Νορµαλ Υνιϖερσιτψ Ηαρβιν txss{sl
Αβστραχτ } ׫¨ ¶·∏§¬¨¶²± ¯¨ ¤√¨ ³µ²·¨¬± ²© Βετυλα πλατψπηψλλα ¶¨ §¨¯¬±ª¶¥¼·«¨ °¨ ·«²§¶²©≥⁄≥2°„Š∞ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶¤±§
§¬°¨ ±¶¬²±¤¯ ª¨¯ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶º¤¶¦²±¦¨µ±¨ §q׫¨ µ¨¶∏¯·¬±§¬¦¤·¨§·«¤·¶²°¨ ±¨ º ³µ²·¨¬±¶¶∏¦«¤¶u|®⁄ ³Œw1v ou|®⁄
³Œw1u otw®⁄³Œx1v ¤±§tt1x®⁄³Œx1ty ³µ²·¨¬± ³²¬±·º¨ µ¨ ¬±§∏¦¨§¥¼¶²¬¯ §µ²∏ª«·¶·µ¨¶¶o¤±§¶²°¨ ³µ²·¨¬± §¬¶¤³³¨¤µ¨§o
©²µ¬±¶·¤±¦¨ ©²∏µ³µ²·¨¬± ¥¨·º¨ ±¨ tu1w ∗ tt1x®⁄ ³Œx1{ ∗ y1ww ¬± ¶¨ §¨¯¬±ª¶¯¨ ¤√¨ ¶²© Βq πλατψπηψλλα §∏µ¬±ª¶²¬¯ §µ²∏ª«·
¶·µ¨¶¶q
Κεψ ωορδσ} Βετυλα πλατψπηψλλα ¶¨ §¨¯¬±ª¶o⁄µ²∏ª«·¶·µ¨¶¶o°µ²·¨¬±¦²°³²±¨ ±·o≥⁄≥2°„Š∞ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶o׺²2§¬°¨ ±2
¶¬²±¤¯ ª¨¯ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶
近年来 o已经发现许多逆境因子如高温 !低温 !干旱 !盐渍 !大气污染 !紫外线 !病原菌 !活性氧胁迫
等 o都会引起植物基因表达的变化 o使植物体内原来正常蛋白的合成受阻 o而诱导产生一类新的蛋白质 o
即逆境蛋白k¶·µ¨¶¶³µ²·¨¬±l ∀虽然这些逆境诱导蛋白的生理功能还不十分清楚 o但它们所表现出来的与
抗逆性的密切相关引起了人们浓厚的兴趣 o因而与之相关的研究工作迅速展开 ∀
许多研究证明 o水分胁迫能够诱导植物产生特异性蛋白质 o并且也有部分资料报道这些特异性蛋白
质产生与植物的生理生化过程变化有关k∂¤µ·¤±¬± ετ αλqot|{z ~•¤² ετ αλqot||vl ∀徐恒平等kt||ul研究
表明 o土壤干旱诱导小麦幼苗根系新产生了 z条多肽kuw !wy !yt !yv !yx !y| !zu®⁄l ∀李妮亚等kt||z ~
t||{l对萌动的小麦种子进行水分胁迫k p t1u °¤°∞Š2ysssl处理 ouw «以后 o诱导小麦幼芽产生 wt1x®⁄
³Œx1yx的蛋白 o其含量随着胁迫时间延长明显增加 ow{ «时含量最高 o到 zu «后不再变化 ∀复水后 o该蛋
白消失 ~再胁迫 w{ «时则又出现 o其含量与处理 uw «时相当 ∀wt®⁄诱导蛋白主要位于细胞器膜上 o细
胞质中几乎不存在 ∀沈波等kt||yl的研究表明 o水分胁迫k p t1zx °¤ °∞Š2ysssl处理冬小麦时 o产生
uy®⁄³Œx1{的新蛋白 o并且抗旱性不同的品种在受到渗透胁迫时 o其诱导蛋白的形成是有差异的 ∀抗旱
性强的品种似乎在重度胁迫下能诱导基因更强的表达以适应干旱的环境 ~抗旱性弱的品种在重度胁迫
下丧失自我调节功能 o诱导的胁迫蛋白很少 ∀可见在干旱环境下 o诱导蛋白的形成因实验材料 !胁迫方
式 !处理时间 !器官部位等而异 ∀目前研究较多且较为清楚的是 ∞„蛋白 ∀ ⁄∏µ¨kt||vl和 …µ¤¼kt||zl分
别报道了 ∞„蛋白的氨基酸序列及部分性质 ∀关于水分胁迫诱导蛋白质性质 o结构和功能及细胞内定
位尚无统一结论和认识 ∀本文研究干旱胁迫对白桦实生幼苗蛋白质组分的影响 o以探讨白桦实生幼苗
叶片蛋白质组分与抗旱性的关系 ∀
t 材料与方法
t1t 实验材料及干旱处理 实验材料为 t年生白桦k Βετυλα πλατψπηψλλαl实生幼苗 ∀将供水正常的幼苗
停止浇水 o自然干旱处理 y §k叶片即将萎蔫 o土壤自然含水量约为 tv1x h l后取样 o试样均取自实生幼苗
顶端第 w ∗ x叶片 ov次重复 ∀
t1u 方法
叶片蛋白质提取 白桦叶片按适当比例加入蛋白质提取液 xs °°²¯#pt ³‹ {1s ×µ¬¶2‹≤¯ k含 t °°²¯#
pt∞⁄ׄ2‘¤os1t h Β2∞ot °°²¯#pt ∂¦和 t h °∂°l o于冰浴上研磨 otv sss µ#°¬±pt w ε 离心 vs °¬±o上清
液加入 w倍体积的冷丙酮于 p us ε 沉淀 vs °¬±otu sssµ#°¬±pt离心 vs °¬±o用 {s h冷丙酮洗数次 o于 w ε 冰
箱中沉淀 o待丙酮挥发净后 o蛋白质沉淀为白色粉末状用于以下 ≥⁄≥2°„Š∞电泳和Œ∞ƒ2≥⁄≥Π°„Š∞电泳 ∀
叶片蛋白质 ≥⁄≥2°„Š∞方法 将上述提取的蛋白质粉末用适量的样品液kyu1x °°²¯#pt ×µ¬¶2‹≤¯ o
³‹ y1{ ou h ≥⁄≥ ots h甘油 ox h u p巯基乙醇 os1sst h 溴酚蓝l使其溶解 o样品于沸水浴中加热 v °¬±o离
心 o上样量为 tx ˏo浓缩胶 w h o分离胶 tx h o电压为 tus ∗ uss ∂ o电泳在冰箱中进行 ∀电泳时间 x ∗ y «o
电泳完毕后 o按郭尧君kt|||l的银染方法进行染色 ∀
叶片蛋白的双向电泳 第一向Œ∞ƒ2°„Š∞}胶浓度为 w h k含 |1x °²¯#pt脲 ou h ‘°2ws ou h ³‹ v1x p
ts两性电解质 os1ux h 过硫酸铵 os1ssy h ×∞∞⁄l ∀电泳管底部用 °¤µ¤©¬¯°封口 ∀用含有 t h ³‹ v1x p
ts „°³«²¯¬±¨ 的 { °²¯#pt脲的样品覆盖液覆盖 o整个过程要避免气泡 o室温下聚合 v «后 o吸去覆盖液 o
图 t 白桦幼苗叶片蛋白质
≥⁄≥2°„Š∞图谱
ƒ¬ªqt ≥⁄≥2°„Š∞ ½¼°²ªµ¤°¬± ¯¨ ¤√ ¶¨²©
Βετυλα πλατψπηψλλα
¤1 正常条件 ¥1 干旱胁迫
¶¨ §¨¯¬±ª∏±§¨µ¤q²µ§¬±¤µ¼ ¦²±§¬·¬²±o
¥q§µ²∏ª«·¶·µ¨¶¶
加入 us ˏ样品缓冲液k|1x °²¯#pt脲 ou h k∂Π∂l非极性去污剂 ‘²±¬§¨·°2
ws ou h ³‹ v1x p ts „°³«²¯¬±¨ 及 u h u2巯基乙醇l进行预电泳kuss ∂ tx
°¬±ovss ∂ vs °¬±owss ∂ ys °¬±l o阳极槽液为 s1t °²¯#pt磷酸 o阴极槽液
为 s1u °²¯#pt ‘¤’‹ o预电泳后 o吸去电泳管内的溶液 o加入样品 ws ˏo
再加入 us ˏ样品覆盖液 ∀重新注满电极液 owss ∂ 电泳 t{ «∀等电聚焦
电泳后 o凝胶条需在 x °的平衡缓冲液k含有 ts h k∂Π∂l甘油 ox h u2巯
基乙醇 ou h ≥⁄≥ o及 yu1x °°²¯ #pt ³‹ y1{ ×µ¬¶2‹≤¯ 缓冲液l中平衡 vs
°¬±∀第二向 ≥⁄≥2°„Š∞电泳 }分离胶 tv h o浓缩胶 v h o将平衡后的胶条
放在浓缩胶上 o用琼脂糖k用平衡液配 t h的琼脂糖溶液l封住 o避免气泡
产生 o加上电极缓冲液k含 s1sux °²¯#pt ×µ¬¶2‹≤¯ 缓冲液 os1t|u °²¯#pt
甘氨酸及 s1t h ≥⁄≥l otus ∗ uss ∂ o电泳 x ∗ y «∀电泳完毕后 o按郭尧君
kt|||l的方法进行银染 ∀
u 结果与分析
u1t 叶片蛋白质 ≥⁄≥2°„Š∞图谱上的差异 首先用 ≥⁄≥2°„Š∞方法初步
比较了白桦幼苗叶片在土壤干旱胁迫下与对照之间的蛋白组分的差异 ∀
从图 t可看出 o大于 wy1| ®⁄的多肽无明显变化 ∀在 wy1|®⁄到 ts1v®⁄之
间的多肽变化明显 o其中 vx®⁄!vt®⁄!uz®⁄!uu®⁄!t|®⁄!ts1z®⁄的多肽带
的颜色浅 o说明其含量低于对照 ∀干旱诱导出一条 u|®⁄的多肽 ∀
t1u 叶片蛋白质 Œ∞ƒ2≥⁄≥Π°„Š∞图谱上的差异 本试验又通过 Œ∞ƒΠ≥⁄≥2
°„Š∞方法对蛋白组分进行了进一步的分析 ∀由图 u可看出 o与对照相
比 o土壤干旱胁迫引起白桦幼苗叶片蛋白质点的明显变化 ∀有一些蛋白
质点的含量显著增加 o部分蛋白质点消失或含量减少 o同时出现了一些新
uxt 林 业 科 学 v|卷
的蛋白质点 ∀例如 }经过胁迫处理后 o在 tu1w ∗ tt1x®⁄ ³Œx1{ ∗ y1ww之间消失了 w个蛋白质点k框 t所
示l ~在框 u中 ts1z®⁄³Œx1zu的 t个蛋白质点消失 o而在 vs®⁄ ∗ ut®⁄ ³Œ y1s ∗ z1s之间k框 vl和 wt ∗
vx®⁄³Œw1y{ ∗ z1s之间k框 wl的蛋白质点 o有的为新出现的蛋白质 o有的颜色变浅 o有的颜色加深 ∀在框
x中所示蛋白质点变化尤为明显 o对照图谱中等电点相同k³Œw1vl而分子量不同k分别为 uy®⁄!uw1y®⁄!
uu®⁄l的 v个蛋白质点 o在胁迫处理的图谱中消失 o同时在其上方诱导产生 u个 u|®⁄等电点分别为
³Œw1v和 ³Œw1u的新蛋白质点 ∀此外 o如框 y所示 o与对照相比 o经干旱胁迫处理后 o原有的 tw1|®⁄³Œx1v
和 tu1y®⁄³Œx1ty的 u个蛋白质点的下方产生了 u个与原蛋白质点等电点相同而分子量分别为 tw®⁄和
tt1x®⁄的两个蛋白质点 o以上结果与 ≥⁄≥2°„Š∞所得的在 wy1|®⁄到 ts1v®⁄之间的蛋白质变化是一致
的 ∀由此可见 o土壤干旱胁迫可以诱导植物基因表达 o即一些与适应水分胁迫有关的基因启动表达 o从
而引起蛋白质合成的变化并产生水分胁迫蛋白 ∀
图 u 白桦幼苗叶片蛋白质双向电泳图谱
ƒ¬ªqu ׺²2§¬°¨ ±¶¬²±¤¯ ª¨¯ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶³¤·¨¬±
¬± ¯¨ ¤√¨ ¶²© Βετυλα πλατψπηψλλα
¤1 正常条件 ¥1 干旱胁迫
¶¨ §¨¯¬±ª∏±§¨µ¤q²µ§¬±¤µ¼ ¦²±§¬·¬²± ¤±§¥q§µ²∏ª«·¶·µ¨¶¶
v 讨论
李霞等kt||vl用 °∞Š溶液k p u1s
°¤l处理小麦根际 o诱导小麦叶片产生
分子量为 t{1v ∗ t|1{®⁄ 的新多肽 ∀
⁄¤¶ª∏³·¤等kt|{wl对 y §龄大麦幼苗黄
化转绿期叶子施加 p t1s °¤胁迫 o不
同部位叶段均产生 ys®⁄蛋白 ∀ ²³¨½
等kt||wl以盐胁迫及水分胁迫小萝卜
k Ραπηανυσσατιϖυσl叶片 o诱导产生 uu®⁄
多肽 ∀ 通 过 ≥⁄≥2°„Š∞ 和 Œ∞ƒΠ≥⁄≥2
°„Š∞两种方法对白桦幼苗叶片蛋白质
组分的分析结果表明k图 t !ul o一些低
分子量如 wy1| ∗ ts1v®⁄的多肽变化较
大 o而大分子量如大于 wy1|®⁄的多肽
相对稳定 ∀从 ≥⁄≥2°„Š∞图谱上看到 o
干旱诱导产生了一条 u|®⁄的多肽 o经
Œ∞ƒΠ≥⁄≥2°„Š∞进一步分析发现 o分子量
为 u|®⁄的有 u个蛋白质点k图 u o框 xl ∀
同时还诱导出 tw®⁄ ³Œ x1v !tt1x®⁄
³Œx1ty等蛋白质点k图 u o框 yl o并发现
一些蛋白质点消失 o如 tu1w ∗ tt1x®⁄
³Œx1{ ∗ y1ww之间消失了 w个蛋白质点
k图 u o框 tl ∀这与前人的报道类似k沈
波等 ot||y ~…µ¤¼ot|{{l ∀可见水分胁迫
所产生的蛋白质 o虽然因物种及实验方
法的不同而异 o但变化较大的蛋白质均
属小分子量的蛋白 ∀由此可以推测本实验所发现的这些小分子量的蛋白质与白桦幼苗在干旱胁迫下的
生理生化代谢更为密切 o对其诱导合成的影响更为直接 ∀作为基因的直接表达产物 o由蛋白质的变化可
以推测基因表达过程中的一些变化 ∀干旱胁迫下 o发生变化的蛋白质中 o有的消失 o有的新出现 o而有的
蛋白质点颜色加深或变浅 ∀这意味着白桦幼苗的基因表达在干旱胁迫下发生了变化 ∀干旱诱导了一些
适应水分胁迫的相关基因启动表达 o也使一些基因的表达增强 o导致一些新蛋白质的出现和某些蛋白质
量的增加 ∀同时一些胁迫前正常表达的基因表达受阻或表达减弱 o致使一些原有的蛋白消失或减少 ∀
vxt 第 w期 孙国荣等 }干旱胁迫对白桦实生幼苗叶片蛋白质的影响
在逆境蛋白的研究中 o许多在逆境下出现的蛋白质其功能尚待阐明 o哪些逆境蛋白和抗性有关 o哪些和
伤害反应有关 o区分这两者具有重要的意义 o对上述出现变化的各蛋白质的特性及生理生化功能 o还需
做进一步研究 ∀
参 考 文 献
郭尧君 q蛋白质电泳实验技术 q北京 }科学出版社 ot|||
李妮亚 o曹翠玲 o高俊凤 q干旱对小麦幼苗诱导蛋白表达与某些生理特性的初步探讨 q西北植物学报 ot||z otzkul }uts p uty
李妮亚 o高俊凤 o汪沛洪 q小麦幼芽水分胁迫诱导的蛋白质的特征 q植物生理学报 ot||{ ouwktl }yx p zt
李 霞 o李云萌 o曹 敏 q抗性和非抗性品种水稻水分胁迫蛋白的比较 q北方农业学报 ot||v o{ }us p ux
沈 波 o李云萌 q渗透胁迫和脱落酸对冬小麦叶片蛋白质的影响 q作物学报 ot||y ouukvl }u{{ p u|w
徐恒平 o汪沛洪 q土壤干旱对小麦根系蛋白组分变化的影响 q西北农业学报 ot||u ot }vv p vy
…µ¤¼ ∞ „ q°¯ ¤±·µ¨¶³²±¶¨¶·² º¤·¨µ§¨©¬¦¬·q×µ¨±§¶°¯¤±·≥¦¬ot||z ou }w{ p xw
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保护 !水土保持与荒漠化防治 !木材工业与技术科学 !林业机械与电子工程 !林产化学与工业 !园林植物
与风景园林 !林业经济与管理 !森林工程 !土木工程等以及有关边缘学科的研究成果 ∀另设置专栏集中
报道重点项目 !基金项目及重大课题的研究成果 ∀
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合评价数据库来源期刊 ~中国自然科学核心期刊 ~5中国学术期刊k光盘版l6首批入编期刊 ~万方数据
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5中国生物学文摘6 !5竹类文摘6等数据库收录 ∀
t||u年以来 o5南京林业大学学报k自然科学版l6先后获得全国优秀科技期刊三等奖 !全国高校优
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辑部 ∀
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