全 文 ：第 wv卷 第 ts期
u s s z年 ts 月
林 业 科 学
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’¦·qou s s z
松茸 ≥≤„• 标记的建立 3
吴松权t 管清杰u 全雪丽t 傅伟杰t 吴基日t
kt1 延边大学农学院 龙井 tvvwss ~ u1 东北林业大学 哈尔滨 txsswsl
关键词 } 松茸 ~假松茸 ~ • „°⁄~≥≤„•
中图分类号 }±|v p vvt ~≥zt{1z 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusszlts p stxs p sw
收稿日期 }ussy p sy p sw ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助项目kvsuyssztl ∀
3 全雪丽为通讯作者 ∀
Εσταβλισηµεντ οφ ΣΧΑΡ Μαρκερ Λινκεδ το Τριχηολοµα µατσυτακε
• ∏≥²±ª´ ∏¤±t Š∏¤± ±¬±ª­¬¨u ±∏¤± ÷∏¨ ¬¯t ƒ∏ • ¬¨­¬¨t • ∏¬µ¬t
kt1 Αγριχυλτυραλ Χολλεγε οφ Ψανβιαν Υνιϖερσιτψ Λονγϕινγ tvvwss ~ u1 Νορτηεαστ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Ηαρβιν txsswsl
Αβστραχτ } • „°⁄¤±¤¯¼¶¬¶º¤¶¤§²³·¨§·²¬§¨±·¬©¼·«¨ Τριχηολοµα µατσυτακε ¤±§ Τq βακαµατσυτακε q •¬·«·«¨ °¨ ·«²§²©…≥„ o
¤³²¯¼°²µ³«¬¦¥¤±§²©{zs ¥³ ¬¯±®¨ §·² Τq µατσυτακε º¤¶¤°³¯¬©¬¨§o¤±§·«¨ ≥≤„• °¤µ®¨µº¤¶§¨√¨ ²¯³¨ §©µ²°·«¨ ³²¯¼°²µ³«¬¦
¥¤±§¥¼ ¦¯²±¬±ªo¶¨ ∏´¨±¦¬±ª¤±§§¨¶¬ª±¬±ª³µ¬°¨ µ¶q׫¨ ≥≤„• °¤µ®¨µ²±¯¼ ³µ¨¶¨±·¨§¬±·«¨ ¬±§¬√¬§∏¤¯¶²© Τq µατσυτακε o·«∏¶o
¬·¦¤± ∏´¬¦®¯¼ ¤±§¤¦¦∏µ¤·¨¯¼¬§¨±·¬©¼ Τq µατσυτακε ¤±§ Τq βακαµατσυτακε ¤·°²¯ ¦¨∏¯¤µ¯ √¨¨ ¯q
Κεψ ωορδσ} Τριχηολοµα µατσυτακε ~ Τριχηολοµα βακαµατσυτακε ~• „°⁄~≥≤„•
松茸群全球共报道 tx个种 t变种 o我国记载 x个种 t变种k臧穆 ot||sl ∀长白山区有 u种 o即松茸
k Τριχηολοµα µατσυτακεl和假松茸k Τq βακαµατσυτακεl o同属于口蘑属 ∀松茸是与松属k Πινυσl树木共生的一种
外生菌根菌 o不仅菌肉肥厚 !营养丰富 !风味绝佳 o而且具有抗癌作用k傅伟杰等 oussxl ∀假松茸 o常生于栓皮
栎k Θυερχυσϖαριαβιλισl !蒙古栎k Θqµονγολιχυσl !岩栎k Θqαχροδονταl等栎类树种林下 o并与其根系形成外生菌
根 o其个体与松茸相比相对较小 o气味也不如松茸纯正 o显微镜检查其褶缘有囊状体 o而松茸则没有k弓明钦
等 ot|||l ∀松茸与假松茸的鉴定主要依赖于传统的形态学和显微鉴定 ∀然而 o这些手段对于松茸和假松茸
的准确鉴定仍显不足 ∀
• „°⁄是 t||s年由美国科学家 • ¬¯¯¬¤°¶和 • ¨¯¶«¬几乎同时采用 °≤• 技术发展起来的一种 ⁄‘„分子标
记技术 ∀因其操作简洁 !快速 !高效且在不了解物种基因组相关分子生物学信息下就可进行等优点而广泛应
用于动植物遗传育种 !基因诊断 !居群遗传学 !生物系统学与进化研究 ∀
≥≤„• k¶¨ ∏´¨±¦¨ ¦«¤µ¤¦·¨µ¬½¨ §¤°³¯¬©¬¨§µ¨ª¬²±¶l标记是从 • „°⁄技术衍生而来的 o代表一个基因组上遗传上
确定的点 ∀这些标记通过感兴趣的 • „°⁄片段的克隆和测序产生 o通过序列分析设计出一对互补到原来
• „°⁄片段 u端的引物 o用这对引物与原来的模板 ⁄‘„ 进行扩增时 o单位点的称为特征序列扩增区域
k≥≤„•¶l被特异性扩增 ∀与 • „°⁄相比 o≥≤„• 用了一对互补到专一基因组位点上的长引物和严格的 °≤• 条
件 o排除了引物结合位点之间的竞争 o因而得到可靠的可重复的带 o它们对反应条件不敏感k邹喻苹等 o
usstl ∀本研究在于松茸和假松茸 • „°⁄分子标记基础上 o建立具有松茸特异性的 ≥≤„• 标记 o以便在分子水
平上快速 !准确地鉴定松茸和假松茸 ∀
1 材料与方法
t1t 供试材料 分别从吉林省汪清县 !吉林省龙井市 !黑龙江省牡丹江市和吉林省安图县采集松茸和假松茸
子实体k经吉林省松茸专家傅伟杰教授鉴定l之后 o及时带回实验室于 p zx ε 超低温冰箱中保存备用k表 tl∀
t1u 基因组总 ⁄‘„提取 采用曾东方等kusstl的 ≤ׄ…法 ∀
t1v • „°⁄分析 tl 松茸及假松茸基因池的建立 采用 …≥„法k邹喻苹等 ousstl o分别将表 t中的 x个松
茸子实体和假松茸子实体中提取的 ⁄‘„等量k各取 xss ±ªl混合 o组成松茸和假松茸基因池 ∀
ul °≤• 反应体系 总体积为 us ˏo包括模板 ⁄‘„ ts ±ªo引物 s1v Λ°²¯#pt o§‘×° uss Λ°²¯#pt oª≤¯ u
表 1 供试材料及来源
Ταβ .1 Σαµ πλεσ ανδ τηειρ οριγιν
编号
‘²q
名称
‘¤°¨
来源
յ»±
编号
‘²q
名称
‘¤°¨
来源
յ»±
t 松茸子实体 ´Τ q µατσυτακε
吉林省汪清县
• ¤±ª´¬±ªo¬¯¬± y
假松茸子实体 ´
Τ q βακαµατσυτακε
吉林省安图县
„±·∏o¬¯¬±
u 松茸子实体 µΤ q µατσυτακε
吉林省汪清县
• ¤±ª´¬±ªo¬¯¬± z
假松茸子实体 µ
Τ q βακαµατσυτακε
吉林省安图县
„±·∏o¬¯¬±
v 松茸子实体 ¶Τ q µατσυτακε
吉林省龙井市
²±ª­¬±ªo¬¯¬± {
假松茸子实体 ¶
Τ q βακαµατσυτακε
吉林省安图县
„±·∏o¬¯¬±
w 松茸子实体 ·Τ q µατσυτακε
吉林省龙井市
²±ª­¬±ªo¬¯¬± |
假松茸子实体 ·
Τ q βακαµατσυτακε
吉林省安图县
„±·∏o¬¯¬±
x 松茸子实体 ∏Τ q µατσυτακε
黑龙江省牡丹江市
∏§¤±­¬¤±ªo ‹ ¬¨¯²±ª­¬¤±ª ts
假松茸子实体 ∏
Τ q βακαµατσυτακε
吉林省安图县
„±·∏o¬¯¬±
u °°²¯#pt oפ´ ⁄‘„ 聚
合酶 t ˜ ot ≅ …∏©©¨µo剩余
用双重蒸馏水补充 ∀
vl °≤• 扩增程序
预变性 |w ε x °¬±o|w ε
变性 ys ¶ovy ε 退火 ys ¶o
zu ε 延伸 |s ¶供循环 wx
次 ~最后 zu ε 延伸 z °¬±∀
wl °≤• 产物检测
°≤• 产物在终浓 度为
s1x Λª#°pt溴化乙锭的
t1w h的琼脂糖凝胶上电
泳 o电泳缓冲液为 s1x ≅
ׅ∞k³‹{1slo在v ∂#¦°pt恒压下电泳约 v1x «左右 o用 ⁄²¯³«¬±凝胶成像仪照相 ∀为了验证 • „°⁄的重复性 o以
上试验设置 v次重复 ∀
t1w 特异性片断的回收 !克隆和测序 通过 • „°⁄筛选的随机引物 ’°„us经 °≤• 扩增后的产物 o在 t h ׄ∞
琼脂糖凝胶上电泳后 o在紫外灯下切下目的 ⁄‘„片断 ’°„us p {zs o转入 t1x °离心管 o按照上海华舜生物
有限工程公司胶回收试剂盒说明书回收目的 ⁄‘„ ∀回收的片段与 ³⁄t{ p ×载体的连接 o连接到 ×载体质
粒 ⁄‘„向大肠杆菌ts|的转化克隆 o参考莎姆布鲁克等kussvl利用碱法提取重组质粒 o用 Ηιν§¶和 Βαµ ‹
´双酶切进行鉴定 ∀委托大连宝生物公司测序 ∀
t1x ≥≤„• 引物的设计和扩增 根据测序结果及引物设计原则 o设计一对含 us ¥³的上 !下游引物 o引物由
华美生物工程公司合成 ∀利用设计上 !下游的引物对松茸和假松茸个体进行 °≤• 扩增 o反应总体 us ˏo除
上 !下游引物各 s1v Λ°²¯#pt o其余成分同 t1v1u °≤• 反应体系相同 ∀
°≤• 程序为预变性 |w ε x °¬±o|w ε 变性 wx ¶oyv ε 退火 ys ¶ozu ε 延伸 |s ¶共循环 vs次 ~最后 zu ε
延伸 z °¬±∀
图 t 松茸 !假松茸 °≤• 结果
ƒ¬ªqt °≤• µ¨¶∏¯·¶²© Τ q µατσυτακε ¤±§ Τ q βακαµατσυτακε
 }uss ¥³分子质量标准 uss ¥³ ⁄‘„ ¤¯§§¨µ~单数编号为松茸 ’§§±∏°¥¨µ¬¶ Τ q µατσυτακε ~
偶数编号为假松茸 ∞√¨ ± ±∏°¥¨µ¬¶ Τ q βακαµατσυτακε q
2 结果与分析
u1t • „°⁄标记 以松茸和假松茸基因池 ⁄‘„为模板进行 • „°⁄分析 o从 tus个随机引物中选出 ts个具有
多态性的引物k图 tl o引物顺序为 ’°„s{kŠ×Š„≤Š×„ŠŠl !’°„tyk„Š≤≤„Š≤Š„„l !’°„uskŠ×׊≤Š„×≤≤l !
’°…su k ׊„×≤≤≤׊Šl ! ’°…t{ k ≤≤„≤„Š≤„Š×l ! ’°≤sx k Š„׊„≤≤Š≤≤ l ! ’°≤s{ k ׊Š„≤≤ŠŠ×Šl ! ’°≤us
k„≤××≤Š≤≤„≤l !’°⁄tskŠŠ×≤ׄ≤„≤≤l !’°∞tykŠŠ×Š„≤׊׊l o基数为松茸 o偶数为假松茸 ∀用这 ts个引物
txt 第 ts期 吴松权等 }松茸 ≥≤„• 标记的建立
图 u 引物 ’°„us对松茸和假松茸子实体中 °≤• 结果
ƒ¬ªqu °≤• µ¨¶∏¯·¶²©³µ¬° µ¨’°„us ©²µΤ q µατσυτακε ¤±§ Τ q βακαµατσυτακε
 }uss ¥³分子质量标准 uss ¥³ ⁄‘„ ¤¯§§¨µ~t ∗ x }松茸 Τ q µατσυτακε ~
y ∗ ts }假松茸 Τ q βακαµατσυτακε ~箭头为 {zs ¥³多态性片断
„µµ²º«¨¤§}{zs ¥³³²¯¼°²µ³«¬¦¥¤±§q
在构成松茸和假松茸基因池 ⁄‘„的单个子实体进
行扩增 o只有引物 ’°„us在检测的松茸中均能各自
扩增出一条 {zs ¥³左右的多态性条带k图 u中箭头
所指l o标记为 ’°„us p {zs o而在假松茸的单株中
则未见 o因此该 • „°⁄标记具有松茸特异性 ∀
u1u 对 × 载体连接转化质粒 ⁄‘„ 用 Ηιν§¶和
Βαµ ‹ ´双酶切检测 用 xs Λª#°pt的氨苄青霉素
选择压 o自 ≤¤≤¯ u 感受态细胞冻融转化后的蓝白斑
平板上挑取白色单克隆 vz ε 摇菌培养过夜 o煮沸
法提取质粒 ⁄‘„ o用 Ηιν§¶ 和 Βαµ ´双酶切检测
获得的基因克隆 o用 t1x °的离心管在 vz ε 水浴
中酶切反应 u «电泳成像k图 vl ∀能切出约 {zs 和
u zss ¥³的片段k°⁄t{ p ×为 u zss ¥³l的克隆为阳
性克隆 o而且是插入一段 {zs ¥³碱基的阳性克隆 o得到了预想质粒大小一致的质粒 ⁄‘„ ∀
图 v 重组质粒双酶切
鉴定结果
ƒ¬ªqv Œ§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²©
§²∏¥¯¨ ±¨½¼°¨¦¤·¤¯¼½¬±ª©²µ
µ¨¦²°¥¬±¨ §³¯¤¶°¬§⁄‘„ q
 }Ηιν§¶ 标准 Ηιν§¶ ⁄‘„
¤¯§§¨µ~t ou }重组质粒双酶切
• ¶¨∏¯·¶²©§²∏¥¯¨ ±¨½¼°¨
¦¤·¤¯¼½¬±ªq
≤Š„Š≤×≤ŠŠ×„≤≤≤ŠŠŠŠ„×≤≤×≤ׄŠ„Š„×× Š×׊≤Š„×≤≤ ׊×≤≤Š×≤≤≤ŠŠ„Š×ׄ
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图 w 目的片断的碱基序列
ƒ¬ªqw …¤¶¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©·¤µª¨·©µ¤ª° ±¨·
u1v 目的片断序列测定分析 目的片断经克隆并进行酶切鉴定后 o用于测序k大连宝生物公司l o测序结果
为 {zw ¥³o其碱基序列如图 w ∀其中方框部分与 °≤• 扩增时所用随机引物序列相同 o在序列 u端均有与引物
’°„us结合位点 o进一步证实了克隆片断的正确性 ∀
u1w ≥≤„• 标记引物的合成及基因组 ⁄‘„ 扩增结果 根据引物设计原则及测得的目的片断 ⁄‘„ 碱基序
列 o在原有 ’°„us引物 ts个碱基的基础上 o向内延长 ts个碱基 o构成了上游引物 ~在原有 ’°„us引物互补
基础 上 o向 内 延 长 ts 个 碱 基 o合 成 其 互 补 序 列 o构 成 了 下 游 引 物 ∀ 上 游 引 物 k °t l }
Š×׊≤Š„×≤≤׊×≤≤Š×≤≤≤ o下游引物k°ul }Š×׊≤Š„×≤≤≤„≤××≤„„„„ ∀
利用 ≥≤„• 标记引物对松茸和假松茸基因组 ⁄‘„进行扩增 o松茸都能扩增出 {zw ¥³特征带 o而假松茸
未能扩增出任何条带 o结果见图 x ∀为了进一步验证该标记的准确性和广泛适用性 o笔者提取了吉林省松茸
专家傅伟杰教授赠送的 u个长白山松茸 !t个日本松茸和吉林省龙井市场上购置的假松茸基因组 ⁄‘„ o并利
用 ≥≤„• 标记引物进行扩增 o结果松茸都能扩增出 {zw ¥³特征带 o而假松茸未能扩增出任何条带k图 yl ∀因
此认为该 ≥≤„• 标记对于鉴别松茸和假松茸是非常有效的分析方法 ∀
uxt 林 业 科 学 wv卷
图 x ≥≤„• 标记引物对松茸和假松茸 °≤• 结果
ƒ¬ªqx °≤• µ¨¶∏¯·¶²©≥≤„• °¤µ®¨µ³µ¬° µ¨©²µ
Τ q µατσυτακε ¤±§ Τ q βακαµατσυτακε
 }uss ¥³分子质量标准 uss ¥³ ⁄‘„ ¤¯§§¨µ~t ∗ x }松茸
Τ q µατσυτακε ~y ∗ ts }假松茸 Τ q βακαµατσυτακε q
图 y ≥≤„• 标记引物对松茸和假松茸 °≤• 结果
ƒ¬ªqy °≤• µ¨¶∏¯·¶²©≥≤„• °¤µ®¨µ³µ¬° µ¨©²µ
Τ q µατσυτακε ¤±§ Τ q βακαµατσυτακε
 }uss ¥³分子质量标准 uss ¥³ ⁄‘„ ¤¯§§¨µ~t ∗ u }长白山松茸
Τ q µατσυτακε ²© ≤«¤±ª¥¤¬²∏±·¤¬±~v }日本松茸 Τ q µατσυτακε
²©¤³¤±~w ∗ y }假松茸 Τ q βακαµατσυτακε q
3 结论与讨论
通过本研究建立的 ’°„us p {zs ¥³的 • „°⁄标记可以较快地在松茸与假松茸种群中鉴定松茸 o虽然在
本论文研究中经优化的 • „°⁄体系未出现稳定性和重复性差的现象k至少重复 v次以上l o但是由于不同实
验室所用试剂和仪器型号不一致 o有可能这个实验室的 • „°⁄流程不一定适合其他实验室 o这在很大程度上
限制了 • „°⁄标记的应用 ∀通过将 ’°„us p {zs ¥³• „°⁄标记转化为稳定性和重复性更高的 ≥≤„• 标记 o根
据一对 us ¥³的上 !下游引物对构建基因池的松茸和假松茸个体进行 °≤• 扩增 o只有松茸检出 {zw ¥³的特异
性条带 o而假松茸未检出任何条带 o表明所筛选的 ≥≤„• 标记特异性好 o克服了通常的 • „°⁄标记不稳定 !不
易重复等缺点 ∀因此 o此标记稳定 !可靠 !操作简单 ∀
出口到日本的中国松茸价格往往与日本本土鲜松茸相比价格较低 o究其原因除了松茸的贮藏保鲜技术
没有到位之外 o松茸中掺杂一些假松茸而导致其特有的香味不足也是一个主要原因 ∀假松茸与松茸仅凭外
观和香味很难鉴别 o经本研究筛选的 • „°⁄标记和 ≥≤„• 标记可以准确 !快速地鉴定松茸和假松茸 o从而对
提高松茸的品质和价格具有比较深远的意义 ∀
参 考 文 献
傅伟杰 o许广波 o梁运江 o等 qussx1 松茸 !姬松茸生产关键技术百问百答 q北京 }中国农业出版社 ot p {
弓明钦 o陈 羽 o王风珍 o等 qt|||1 松茸 q昆明 }云南科学技术出版社 ous
莎姆布鲁克 o拉塞尔 ⁄ • qussv1 分子克隆实验指南 }v版 q黄培堂 o译 q北京 }科学出版社 ouy p vs
臧 穆 qt||s1 松茸群及其近缘种的分类地理研究 q真菌学报 o|kul }ttv p tuz
曾东方 o罗信昌 o傅伟杰 o等 qusst1 松口蘑菌丝体的分离和 • „°⁄p °≤• 分析 q微生物学报 owtkvl }uz{ p u{y
邹喻苹 o葛 颂 o王晓东 o等 qusst1 系统与进化植物学中的分子标记 q北京 }科学出版社 ovs p xt
k责任编辑 朱乾坤l
vxt 第 ts期 吴松权等 }松茸 ≥≤„• 标记的建立