全 文 ：第 ww卷 第 u期
u s s {年 u 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1ww o‘²1u
ƒ ¥¨qou s s {
白桦 ∞≥×2≥≥• 信息分析与标记的开发 3
王艳敏 魏志刚 杨传平
k东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室 哈尔滨 txsswsl
摘 要 } 对 ‘≤…Œk美国国立生物技术信息中心l中 u xw{条欧洲白桦 ∞≥׶的序列进行分析 o结果表明 }其中 uys条
∞≥׶中含有 vsy个 ≥≥•¶o为全部 ∞≥׶序列的 ts1u h o≥≥• 频率为 tu1st h ∀其中 o二核苷酸重复比例为 {t1vz h o三
核苷酸重复比例为 ty1yz h o四核苷酸重复比例为 t1|y h ∀不同软件设计引物的效率不同 o°µ¬° µ¨v设计出 tzy对
≥≥• 引物 o在白桦中扩增成功的引物比例为 x|1s| h o而具有多态性的引物比例仅为 ux1|y h ~≥≥• °µ¬° µ¨设计出 tss
对引物 o在白桦中扩增成功的引物比例为 vz h o而具有多态性的引物比例为 w{1yx h ∀
关键词 } 欧洲白桦 ~白桦 ~∞≥× ~≥≥• ~标记
中图分类号 }≥zt{1wy 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{lsu p ssz{ p sz
收稿日期 }ussy p tt p ut ∀
基金项目 }国家 {yv课题kussu„„uwts{sl o国家自然科学基金项目kvsxztxtvl o东北林业大学校基金课题 ∀
3 魏志刚为通讯作者 ∀
∆ατα Μινινγ φορ ΣΣΡσιν ΕΣΤσ ανδ ΕΣΤ2ΣΣΡ Μαρκερ ∆εϖελοπ µεντ ιν Βετυλα πλατψπηψλλα
• ¤±ª≠¤±°¬± • ¬¨«¬ª¤±ª ≠¤±ª≤«∏¤±³¬±ª
k ΚεψΛαβορατορψοφ Φορεστ Τρεε Γενετιχ Ιµπροϖεµεντ ανδ Βιοτεχηνολογψοφ Μινιστρψοφ Εδυχατιον Νορτηεαστ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Ηαρβιν txsswsl
Αβστραχτ } ׫µ²∏ª«·«¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨ ¤±¤¯¼¶¬¶²©u xw{ ∞≥׶¬± Βετυλα πενδυλα §¨³²¶¬·¨§¬± ‘≤…Œo º¨ ©²∏±§·«¤·vsy ≥≥•¶º¨ µ¨
§¬¶·µ¬¥∏·¨§¬± uys ∞≥׶²∏·²©u xw{ ∞≥׶¶¨ ∏´¨±¦¨¶o¤¦¦²∏±·¬±ª©²µts1u h ²©·«¨ º«²¯¨∞≥× ¶¨ ∏´¨±¦¨¶q׫¨ ©µ¨ ∏´¨±¦¼²©≥≥•
º¤¶tu1st h o¬± º«¬¦«o·«¨ µ¨³¨·¬·¬√¨ ³µ²³²µ·¬²±¶²©§¬±∏¦¯¨ ²·¬§¨ o·µ¬±∏¦¯¨ ²·¬§¨ o¤±§·¨·µ¤±∏¦¯¨ ²·¬§¨ º¨ µ¨ {t1vz h oty1yz h o
¤±§t1|y h o µ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ q ²µ¨²√¨ µo·«¨ ©¨©¬¦¬¨±¦¼ ²© ³µ¬°¨ µ§¨¶¬ª± º¬·« √¤µ¬²∏¶¶²©·º¤µ¨¶ º¤¶§¬©©¨µ¨±·q ׫¨ ¶²©·º¤µ¨ o
°µ¬°¨ µv o §¨¶¬ª±¨ §tzy ³¤¬µ¶²© ≥≥• ³µ¬°¨ µ¶o·«¨ ³µ²³²µ·¬²± ²© ³µ¬°¨ µ¶o º«¬¦« º¨ µ¨ ¶∏¦¦¨¶¶©∏¯¯ ¼ ∏¶¨§©²µ¤°³¯¬©¼¬±ª ⁄‘„
©µ¤ª°¨ ±·¶²© Βqπλατψπηψλλαoº¤¶x|1s| h o¤±§·«¨ ³µ²³²µ·¬²± ²©³µ¬°¨ µ¶·«¤·³µ²§∏¦¨§³²¯¼°²µ³«¬¦©µ¤ª°¨ ±·¶º¤¶ux1|y h q
׫¨ ¶²©·º¤µ¨ o≥≥• ³µ¬°¨ µo§¨¶¬ª±¨ §tss ³¤¬µ¶²©³µ¬°¨ µ¶o·«¨ ³µ²³²µ·¬²±²©³µ¬°¨ µ¶oº«¬¦«º¨ µ¨ ¶∏¦¦¨¶¶©∏¯¯ ¼ ∏¶¨§©²µ¤°³¯¬©¼¬±ª
⁄‘„ ©µ¤ª°¨ ±·¶²© Βqπλατψπηψλλαoº¤¶vz h o¤±§·«¨ ³µ²³²µ·¬²± ²©³µ¬°¨ µ¶³µ²§∏¦¬±ª³²¯¼°²µ³«¬¦©µ¤ª°¨ ±·¶º¤¶w{1yx h q
Κεψ ωορδσ} Βετυλα πενδυλα~ Βετυλα πλατψπηψλλα~∞≥× ~≥≥• ~°¤µ®¨µ
传统基因组来源的 ≥≥• 开发需要基因组文库构建 !探针杂交和克隆测序等繁杂的操作程序 o这不仅费
时 !费力 o而且开发成本很高 o极大地制约了其发展和应用kŽ²·¤ ετ αλqousstl ∀随着功能基因组学的迅速发
展 oŠ¨ ±…¤±®k基因序列数据库l中积累了许多重要物种的大量 ∞≥׶k ¬¨³µ¨¶¶¨§2¶´ ∏¨±¦¨ ·¤ª¶l序列 o这些序列已
经成为发展 ≥≥• 标记k∞≥×2≥≥• l的重要资源 ∀与来自基因组中随机分布的 ≥≥• 标记相比 o基于 ∞≥×开发的
≥≥• 标记位于基因的转录部分 o反映了基因的编码部分 o可以直接获得基因表达的信息 o因而与功能基因紧
密连锁 o而且它在近缘物种间具有高度的可转移性和通用性 ∀目前 o∞≥×2≥≥• 的开发在农作物中应用广泛 o
在甘蔗k Σαχχηαρυµ οφφιχεναρυµlk≤²µ§¨¬µ² ετ αλqousstl !小麦k Τριτιχυµ αεστιϖυµlk∞∏­¤¼¯ ετ αλqoussu ~ Š∏³·¤ ετ
αλqoussv ~Š¤² ετ αλqoussv ~ ≠∏ ετ αλqousswl !黑麦k Σεχαλε χερεαλεlk‹¤¦®¤∏© ετ αλqoussul !大麦k Ηορδευµ
ϖυλγαρεlk׫¬¨¯ ετ αλqoussvl !苜蓿k Μεδιχαγο σατιϖαlk…¤µµ¨· ετ αλqousswl !葡萄k ςιτισ ϖινιφεραlk⁄¨ ¦µ²²¦´ ετ αλqo
ussvl !水稻k Ορψζα σατιϖαlk≤«² ετ αλqousssl等中已有报道 o而在树木中只有在杏k Πρυνυσ αρµενιαχαlk÷∏ ετ
αλqoussw ~ ⁄¨ ¦µ²²¦´ ετ αλqoussvl !猕猴桃k Αχτινιδια χηινενσισlkƒµ¤¶¨µετ αλqousswl !云杉k Πιχεα ασπεραταlk•∏±ª¬¶
ετ αλqousswl和火炬松k Πινυσταεδαlk¬¨º¯ ¤®¶¤±¨ ¼¨¤±¤º¬± ετ αλqousswl等物种中有过报道 ∀
白桦k Βετυλα πλατψπηψλλαl是非常优良的短周期纸浆用材阔叶树种 ∀目前 o未见关于白桦 ∞≥×2≥≥• 方面的
报道 ∀本文从 ‘≤…Œk美国国立生物技术信息中心l数据库中查找欧洲白桦k Βετυλα πενδυλαl的 ∞≥׶序列 o并进
行 ≥≥•¶的查找和分析 ∀在此基础上 o根据 ≥≥•¶两端的保守序列设计引物 o从而开发了可以用于白桦的 ∞≥×2
≥≥• 标记 o并利用新开发的引物进行该树种的多态性研究 ∀本研究是对现有白桦资源的进一步发掘和利用 o
建立这种标记对于加速白桦 ∞≥× 资源的开发利用 !丰富其分子标记类型以及为绘制遗传图谱 !实现目标性
状的标记辅助选择具有重要的意义 ∀
t 材料与方法
111 植物材料及基因组 ∆ΝΑ的提取
材料为东北林业大学校园内的白桦和白桦强化种子园内 ts株个体k欧洲白桦 !日本白桦和来源于帽儿
山 !小北湖 !凉水 !清源 !桓仁 !乌伊岭 !辉南 !新疆的白桦l ∀每份材料取其新鲜叶片提取基因组 ⁄‘„k杨传平
等 oussxl ∀
112 白桦 ΕΣΤ2ΣΣΡ 序列的查找
从 Š¨ ±…¤±®Π§¥∞≥×k«·³}ΠΠººº q±¦¥¬q±¯ ° q±¬«qª²√Π§¥∞≥×Π¬±§¨¬q«·°¯ l下载欧洲白桦 ∞≥× 序列 o共获得了
u xw{条欧洲白桦 ∞≥׶序列 ∀
应用 ≥≥•Œ×k¶¬°³¯¨¶¨ ∏´¨±¦¨ µ¨³¨ ¤·¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²±·²²¯l 软件k«·³}ΠΠººº qªµ¤°¨ ±¨ q²µªΠ§¥Π¶¨¤µ¦«¨¶Π¶¶µ·²²¯l在线
搜索 ∞≥×2≥≥• ∀搜索的标准为 }二核苷酸 !三核苷酸 !四核苷酸重复序列的重复次数大于或等于 x ∀
113 ΕΣΤ2ΣΣΡ 引物的设计
用 °µ¬°¨ µv k«·³}ΠΠ©µ²§²qº¬q°¬·q¨§∏Π¦ª¬2¥¬±Π³µ¬°¨ µvΠ³µ¬°¨ µvl设计 ∞≥×2≥≥• 引物 o由上海生工生物技术公司
合成 ∀设计引物时设置的主要参数为 }Š≤ 含量 us h ∗ {s h o退火温度kτ°lxz ∗ yv ε o引物长约 us ¥³kt{ ∗
uz ¥³l o预期扩增产物长度 tus ∗ vxs ¥³∀
用 ≥≥• °µ¬°¨ µk«·³}ΠΠ«²µ±¥¬¯¯ q¦¶³³q¯¤·µ²¥¨ q¨§∏q¤∏Π¦ª¬2¥¬±³∏¥Π¶¶µ³µ¬°¨ µΠ¬±§¨¬¶¶µq³¯l设计 ∞≥×2≥≥• 引物 o由上
海生工生物技术公司合成 ∀设计引物时设置的主要参数为 }Š≤ 含量 us h ∗ zs h o退火温度kτ°lxx ∗ ys ε o
引物长度 t{ ∗ uv ¥³o预期扩增产物长度 tss ∗ vss ¥³∀
114 ΠΧΡ 扩增及电泳检测
°≤• 反应体积为 us ˏo内含 ⁄‘„ tss ±ªo ªun 浓度为 v °°²¯ #pt o פ´ 酶 s1x ˜ o§‘×°浓度为 s1x
°°²¯#pt o引物浓度为 s1w Λ°²¯#pt ∀反应程序为 }|w ε 预变性 x °¬±~|w ε 变性 vs ¶o复性 vs ¶k退火温度视
不同引物确定l ozu ε 延伸 vs ¶ovx个循环 ~zu ε 延伸 tx °¬±~w ε 保存 ∀°≤• 产物在 y h变性聚丙烯酰胺凝
胶中电泳 o银染 o检测多态性 ∀
u 结果与分析
211 欧洲白桦 ΕΣΤ2ΣΣΡ 分布 !频率及特点
在搜索的 u xw{个 ∞≥׶中 o共发现了分布于 uys个 ∞≥׶中的 vsy个 ≥≥•¶o含有 ≥≥• 的 ∞≥×占全部 ∞≥×
的 ts1u h o≥≥• 的出现频率是 tu1st h o这表明欧洲白桦 ∞≥×中的 ≥≥• 数量很丰富 ∀在 uys条含有 ≥≥• 的 ∞≥×
中 o只有 t个 ≥≥• 的 ∞≥×有 uty条 o含有 u个 ≥≥• 的有 wv条 o含有 w个 ≥≥• 的 ∞≥× 有 t条 ∀
表 1 欧洲白桦 ΕΣΤ中 ΣΣΡ 的出现频率
Ταβ .1 Φρεθυενχψ οφ ΣΣΡσ οχχυρρεδ ιν ΕΣΤσ οφ Β . πενδυλα
重复类型
• ³¨¨ ¤··¼³¨
重复基元种数
‘∏°¥¨µ²©
µ¨³¨ ¤·°²·¬©
≥≥• 数量
≥≥•
±∏°¥¨µ
占全部 ≥≥• 比例
°µ²³²µ·¬²±¬±
¤¯¯ ≥≥•¶Πh
在 ∞≥×中出现频率
ƒµ¨ ∏´¨ ±¦¼¬±
∞≥×Πh
二核苷酸 ⁄¬±∏¦¯ ²¨·¬§¨ | uw| {t1vz |1zz
三核苷酸 ×µ¬±∏¦¯ ²¨·¬§¨ tx xt ty1yz u1ss
四核苷酸 × ·¨µ¤±∏¦¯ ²¨·¬§¨ t y t1|y s1uw
由以上分析可以看出 o欧洲白桦
的 ∞≥×2≥≥• 主要有 v种重复类型 o即
二核苷酸重复 !三核苷酸重复 !四核苷
酸重复 o其出现频率各不相同k表 tl ∀
其中二核苷酸重复最为常见 o共有
uw|个 o在全部 ∞≥× 中的出现频率为
|1zz h o所占 ≥≥• 比例达到 {t1vz h ~
其次为三核苷酸重复 o出现频率为
u1ss h o所占 ≥≥• 比例为 ty1yz h ~四核苷酸重复的出现频率为 s1uw h o所占 ≥≥• 比例为 t1|y h ∀由此可见 o
在欧洲白桦 ∞≥×2≥≥• 中 o二核苷酸重复占主导地位 ∀
在搜索出的欧洲白桦 ∞≥×2≥≥• 中 o共观察到 ux种核苷酸重复k表 ul ∀其中二核苷酸重复中 o×≤ !Š„ !≤×
出现的次数较多 o分别占二核苷酸重复的 u{1|u h !uu1w| h !us1s{ h ~在三核苷酸重复基元中 o×≤„ !„„Š出
现较多 o占三核苷酸重复的 tv1wx h ~四核苷酸中 y个重复碱基均为 Š„Š≤ ∀
|z 第 u期 王艳敏等 }白桦 ∞≥×2≥≥• 信息分析与标记的开发
表 2 欧洲白桦 ΕΣΤ中二核苷酸 !三核苷酸 !四核苷酸重复基元
Ταβ .2 Ρεπεατ µ οτιφσ οφ δινυχλεοτιδε , τρινυχλεοτιδε ανδ τετρανυχλεοτιδειν ΕΣΤσ οφ Β . πενδυλα
重复类型
• ³¨¨ ¤··¼³¨
重复基元
• ³¨¨ ¤·°²·¬©
数量
‘∏°¥¨µ
所占比例
°µ²³²µ·¬²±Πh
二核苷酸 ⁄¬±∏¦¯ ²¨·¬§¨ ×≤ zu u{1|u
Š„ xy uu1w|
≤× xs us1s{
„Š vy tw1wy
„× t| z1yv
ׄ ts w1su
׊ v t1u
„≤ u s1{
Š× t s1w
三核苷酸 ×µ¬±∏¦¯ ²¨·¬§¨ „„Š z tv1zv
×≤„ z tv1zv
Š×Š y tt1zy
Š„× x |1{s
重复类型
• ³¨¨ ¤··¼³¨
重复基元
• ³¨¨ ¤·°²·¬©
数量
‘∏°¥¨µ
所占比例
°µ²³²µ·¬²±Πh
„„Š x |1{s
×≤× w z1{w
„׊ v x1{{
××≤ v x1{{
Š„„ v x1{{
„Š„ u v1|u
≤„× u v1|u
„„≤ t t1|y
ŠŠ× t t1|y
Š„≤ t t1|y
××≤ t t1|y
四核苷酸 × ·¨µ¤±∏¦¯ ²¨·¬§¨ Š„Š≤ y tss
212 ΕΣΤ2ΣΣΡ 引物的筛选
采用 u种软件设计白桦的 ≥≥• 引物 o其中应用 °µ¬°¨ µv设计出 tzy对引物 o用 ≥≥• °µ¬°¨ µ共设计出 tss对
引物 ∀以东北林业大学校园内白桦对照为模板对用 u种软件设计的引物进行扩增 ∀其中应用 °µ¬°¨ µv设计
出 tzy对引物共有 tsw对引物产生扩增产物 o占合成引物的 x|1s| h ~而用 ≥≥• °µ¬°¨ µ设计出的 tss对引物
中有 vz对引物产生了扩增产物 o占合成引物的 vz h ∀
图 t ts个样品在 ≥≥• °µ¬° µ¨设计的 °…{号引物中的扩增效果
ƒ¬ªqt ׫¨ ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± µ¨¶∏¯·²©·¨± ¶¤°³¯ ¶¨¬± °…{ §¨¶¬ª±¨ §¥¼ ≥≥• °µ¬°¨ µ
t q欧洲白桦 Β q πενδυλα ~u q日本白桦 Β qϕαπονιχα ~v p ts q不同种源白桦 Β qπλατψπηψλλᬱ §¬©©¨µ¨±·³µ²√¨ ±¤±¦¨¶
kv q帽儿山 ¤²¨µ¶«¤±~w q小北湖 ÷¬¤²¥¨¬«∏~x q凉水 ¬¤±ª¶«∏¬~y q清源 ±¬±ª¼∏¤±~z q桓仁 ‹∏¤±µ¨± ~{ q乌伊岭
• ∏¼¬¯¬±ª~| q辉南 ‹∏¬±¤±~ts q新疆 ÷¬±­¬¤±ªl q下同 ∀׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
图 u ts个样品在 °µ¬° µ¨v软件设计的 °tsz引物中的扩增效果
ƒ¬ªqu ׫¨ ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± µ¨¶∏¯·²©·¨± ¶¤°³¯ ¶¨¬± °tsz §¨¶¬ª±¨ §¥¼ °µ¬°¨ µv
s{ 林 业 科 学 ww卷
213 白桦 ΕΣΤ2ΣΣΡ 的多态性分析
为了进一步研究所设计引物的多态性 o对能扩增出条带的 twt对引物用 ts株个体进行测试 o结果用 ≥≥•
°µ¬°¨ µ设计出的 vz对引物中共有 t{对引物具有多态性 o占产生扩增产物引物总数的 w{1yx h k图 t o表 vl ~
而用 °µ¬°¨ µv设计的产生扩增产物的 tsw对引物中仅有 uz对引物具有多态性 o仅占产生扩增产物引物总数
的 ux1|y h k图 u o表 wl ∀由此可见 o应用 u种不同的设计软件所设计出的引物有所不同 ∀
表 3 ΣΣΡ Πριµερ设计出 18 对 ΕΣΤ2ΣΣΡ 引物的信息
Ταβ .3 Ινφορµατιον οφ 18 ΕΣΤ2ΣΣΡ πριµερ παιρσ δεσιγνεδ βψ ΣΣΡ Πριµερ
引物名称
‘¤°¨²©³µ¬°¨ µ
重复基元
• ³¨¨ ¤·¨§ °²·¬©
引物序列
°µ¬°¨ µ¶´∏¨±¦¨
退火温度
τ°Πε
预期产物片段大小
°≤• ³µ²§∏¦·¶¬½¨ Π¥³
°…t k≤×lts ≤×≤≤×׊„≤Š××≤×≤׊„„≤ xx1tx t|w
×ׄŠ≤„Š≤××ׄ„×≤≤≤„„≤ xw1||
°…u k≤×lz Š„„Š„„„≤≤××≤„≤׊„„×≤„Š xx1xt us{
Š„„××≤„Š≤≤Š×≤„„Š×ׄ≤ xx1tu
°…v k×≤„lx Š„≤Š≤„Š„≤××≤××≤„„≤׊ xx1tu t{u
„„„ׄŠ×≤≤„„≤≤„Š≤≤„×× xw1zz
°…z k„×l| Š×≤×≤×≤Š≤„Š×≤„„≤Š×× xw1{z u|t
ׄ≤××≤≤≤ׄ„„Š„×׊Š≤× xx1sz
°…{ k×≤lts ׄׄ„Š≤ׄ≤Š≤×≤Š≤×≤×× xw1|v utx
ׄ≤××≤≤≤ׄ„„Š„×׊Š≤„ xx1sz
°…tt k×≤„lx Š„≤Š≤„Š„≤××≤××≤„„≤׊ xx1tu tys
≤„≤≤„××≤×ׄ„ׄ׊≤„≤≤ xw1uy
°…tu k×≤lx ≤„Š≤×≤„≤××≤×≤×≤×≤×≤׊ xv1xx vxz
≤×≤„„Š×≤≤≤„×≤„≤„„×≤„ xx1st
°…tx kŠ„ly ≤„׊׊׊„Š„Š„Š„׊≤׊ xx1tz utv
≤≤≤„„Š„ŠŠ„„××≤ׄ„≤„„ xw1wx
°…ty k„Š„lx Š„׊≤׊„„„×׊„Š„Š„Š≤ xx1tw uss
≤≤≤„„Š„ŠŠ„„××≤ׄ„≤„„ xw1wx
°…uw kׄlz ≤×≤×≤××≤×≤×××≤Š××≤≤Š xx1zw usu
ׄ≤≤≤„׊„×≤Š„≤××≤×׊ xx1tt
°…u| k„Šly ŠŠ„≤„×ׄ≤„„„ׄŠ≤≤„≤Š xw1x| usx
Š„Š××≤××≤Š≤„×≤××≤„׊ xw1|z
°…v{ k„„≤lx ×≤„Š„×××≤×≤×××≤„„Š≤Š xw1zs uw|
„„ŠŠ≤≤ׄŠ×Š×Š„ŠŠŠ×„„ xx1vx
°…xs k≤×ltw ×××≤≤„≤„Š≤„„×××≤ׄ≤Š xx1v{ tvw
Š×≤≤„Š„„ŠŠŠ×Š„„×׊×× xx1sv
°…yy k׊≤lz ≤׊≤×≤×׊׊׊„„Š×≤„× xw1|x vw{
≤„Š×ׄ×≤„Š≤××≤≤≤„Š×Š xw1|v
°…{x kׄlx ≤≤×≤„„Š×ŠŠ××׊„≤„„Š„ xx1t| tuz
„≤„≤„׊≤„Š≤„≤„„ׄ×≤„ xw1sx
°…{y k×≤„lx Š„≤Š≤„Š„≤××≤××≤„„≤׊ xx1tu tuz
≤„≤ŠŠ„ŠŠ„××≤ׄ„≤„„„≤ xw1|z
°…{| k×≤lts „„≤„„≤××≤×××≤„„׊Š×Š× xw1{x vsv
Š„„„≤ׄ≤≤„≤Š×Š„„≤≤„„ xw1|z
°…|w k„×ltt „Š„„Š≤„≤≤„≤„„„≤„××׊ xx1uz uus
׊׊≤≤×≤××≤„×≤××≤×ׄ xx1sz
v 讨论
随着 ∞≥×和 ¦⁄‘„大规模测序的开展 o∞≥×2≥≥• 引物的开发展现了广阔的前景 ∀但到目前为止 o相关研
究还比较少 o有待进一步加强 ∞≥×2≥≥• 的开发与应用研究 ∀本次试验共对 u xw{个欧洲白桦 ∞≥×进行了搜
索 o发现了 vsz个 ≥≥•¶o出现频率是 tu1sx h ∀这个比率远高于其他物种 ∞≥×数据库中筛选的 ≥≥• 比率 o如甘
蔗的 u1| h k≤²µ§¨¬µ² ετ αλqousstl !水稻的 w1z h kŽ¤±·¨·¼ ετ αλqoussul !普通小麦的 x1w h kŠ∏³·¤ ετ αλqoussvl !
白菜k Βρασσιχα πεκινενσισl的 ts1vw h k忻雅等 oussyl o这种差异可能是物种间的真实 ≥≥• 信息差异或搜寻 ≥≥•
时所用长度最低标准不同造成的k‘¬¦²·ετ αλqousswl ∀当 w种不同的碱基随机组合时 o若 ∞≥×2≥≥• 数目足够
t{ 第 u期 王艳敏等 }白桦 ∞≥×2≥≥• 信息分析与标记的开发
表 4 Πριµερ3 设计的 27 对 ΕΣΤ2ΣΣΡ 引物信息
Ταβ .4 Ινφορµ ατιον οφ 27 ΕΣΤ2ΣΣΡ πριµερ παιρσ δεσιγνεδ βψ Πριµερ3
引物名称
‘¤°¨²©³µ¬°¨ µ
重复基元
• ³¨¨ ¤·¨§ °²·¬©
引物序列
°µ¬°¨ µ¶´∏¨±¦¨
退火温度
τ°Πε
预期产物片段大小
°≤• ³µ²§∏¦·¶¬½¨ Π¥³
°t kŠ„lx ××≤××≤≤≤≤׊≤׊×××≤„Š ys1uv utt
×≤׊≤׊Š„Š„≤„≤Š„„××≤ x|1|{
°{ k×≤lx ≤≤„≤≤„„„„ŠŠ××≤„„„„ŠŠ x|1x| tx{
×≤„Š×ŠŠ„Š„„„„„Š≤Š×Š× x|1xz
°| kŠ„„lz ≤×≤××≤Š„ŠŠ≤„Š≤„„„×׊ ys1ts uux
≤„≤≤ŠŠ„„„ŠŠ„≤׊××׊„ ys1st
°tw k„„Šly ≤≤„׊„„≤„„Š„Š≤Š×≤„Š× x|1|{ txz
„„„≤ŠŠŠ××≤„ׄŠ≤≤„≤×≤ x|1||
°t{ kŠ„ly Š≤≤≤≤„≤××≤≤××≤××≤×ׄ x|1y| ty{
ŠŠ≤≤„Š„„„≤≤≤„×≤××≤ׄ ys1ww
°u{ kŠ×Šly ׄ׊„Š≤„׊Š×Š„Š≤„„Š≤ x|1{u uwu
׊„≤≤„≤≤„×≤„׊×≤≤„׊ ys1t|
°vs kŠ„ly Š„Š„Š„Š„Š„„„≤≤Š≤Š„׊ ys1ts t{z
„≤≤≤ׄ„×××≤ŠŠ„≤≤≤„„Š ys1t{
°vz kŠ„×lx „≤Š„Š××≤≤×≤×≤׊≤≤„„„ x|1|| uty
≤„ŠŠ„Š≤„Š≤„×≤„„≤׊„„ ys1tw
°wx kŠ„l{ ≤≤≤׊≤≤×≤××≤×≤׊×≤„Š x|1|| uvv
Š≤≤„ׄ„Š≤≤×≤≤„„×≤×≤× ys1t{
°xv k„×l| ׊ׄŠ≤„Š„Š„׊Š≤≤××Š× x|1xx utx
Š×„Š≤≤„׊Š××׊Š„ŠŠ„× x|1|v
°xw k„Šlx Š×„×≤Š„„ŠŠ×ŠŠ„Š≤≤„„× ys1sz tz{
×≤„≤„„„≤׊≤≤ŠŠ×„׊„× ys1tt
°xz kŠ×l{ ŠŠ„×≤„×≤×≤׊≤ŠŠ×Š×ׄ ys1s{ txu
≤≤Š×≤×≤≤≤≤„≤׊„ׄ„Š× ys1sz
°yw k„„≤lx Š„≤≤„„„≤≤„≤≤„„„≤≤„×≤ ys1sz tx{
׊Š×„×׊ Š×׊Š„ŠŠŠ„„„ ys1ty
°{w k„Š„lz „„„≤≤Š„≤Š„Š≤×≤„„Š„„× x|1|| uuu
≤ŠŠ×≤×≤„„×≤×≤≤„≤Š×ׄ ys1tt
°{{ k≤×ly „Š≤׊„Š≤≤≤×׊׊׊„Š„ ys1sy txy
×׊≤„„≤×××≤≤×׊≤„××≤ x|1{x
°|s kŠ„l{ „Š×Š×ŠŠŠ×„Š≤ŠŠ„Š„Š„× x|1{z t{v
×ׄ„×≤≤≤ŠŠ„Š„ŠŠ×„Š≤Š ys1wt
°|u kŠ„Š≤lx Š„Š≤Š„Š≤Š„Š„Š„≤„Š„≤„ ys1sw tyx
≤≤Š„××××≤×ׄŠŠ„Š≤Š„×≤ yt1sx
°|w kׄlx ≤„Š„≤Š„≤„„„Š≤„„Š≤×Š× ys1vu utv
≤„׊≤×≤„≤„ׄ≤„„ŠŠ≤„„× x|1zw
°|x k≤×ltx „≤≤„„„≤×≤≤„„„Š≤Š≤×„× x|1{{ uvz
××׊≤Š„Š„„≤Š„××׊„×≤ x|1{t
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u{ 林 业 科 学 ww卷
大且无偏倚性 o将可能分别产生 u !w !ts !vv !tsu和 vxs种单 !二 !三 !四 !五 !六核苷酸重复k•²·¤ ετ αλqoussxl ∀
在一些物种中三核苷酸重复占主要类型 o如甘蔗 ∞≥×中三核苷酸重复占 |s h以上k≤²µ§¨¬µ² ετ αλqousstl !普
通小麦 ∞≥×中三核苷酸 ≥≥• 占 yz1tu h kŠ∏³·¤ ετ αλqoussvl ∀而二核苷酸重复序列在多数植物基因组中分布
几率较高k≤¤µ§¯¨ ετ αλqousssl ∀本研究中欧洲白桦 ∞≥× 中二核苷酸重复是主导类型 o所占 ≥≥• 比例达到
{t1tu h ∀这可能与白桦 ∞≥×2≥≥• 自身的特点有关 ∀对欧洲白桦 ∞≥×2≥≥• 的分析结果显示 o大多数二核苷酸
重复均有出现 o但大多数三核苷酸重复和四核苷酸重复未出现 o表现出明显的偏倚性 ∀但本研究分析欧洲白
桦 ∞≥×序列数量不足 x sss o所出现碱基偏倚性是白桦 ∞≥×2≥≥• 的真实反映还是由于分析 ∞≥×数量较少或者
二者兼而有之所造成 o还需要进一步研究 ∀
Š„在大多数植物二核苷酸重复中是主导核苷酸重复 ∀ ׫¬¨¯等kussvl在大麦中研究得知二核苷酸重复
中 Š„出现频率最高为 xu h o‘¬¦²·等kusswl在小麦的研究中所得到的结果为二核苷酸重复中 Š„出现频率
为 wx h o也与 Ž¤±·¨·¼等kussul和 ²µª¤±·¨等kussul 对多种不同植物 ∞≥×2≥≥• 综合分析后所报道的结果相
符 ∀但在猕猴桃kƒµ¤¶¨µετ αλqousswl中频率最高的二核苷酸重复却为 ≤× kwx1v h l o其次才是 Š„kux1v h l o
在番茄kΛψχοπερσιχον εσχυλεντυµlk„µ¨¶«¦«¨ ±®²√¤ ετ αλqoussul中也不是 Š„ 而是 „× 频率高 ∀本研究中观察到
×≤ !Š„ !≤×数量较多 o分别占二核苷酸重复的 u{1|u h !uu1w| h !us1s{ h o×≤ 在二核苷酸重复中占主导类型 o
其次才是 Š„kuu1w| h l ∀欧洲白桦三核苷酸重复中 ×≤„ !„„Š数量较多kz个l o占三核苷酸重复的 tv1wx h ∀
在白菜和拟南芥kΑραβιδοπσιστηαλιαναl中 Š„„较多 o而在水稻 !大麦 !高粱k Σοργηυµ ϖυλγαρεl !玉米k Ζεα µαψσl
中 ≤≤Š则是主要三核苷酸重复kŠ¤² ετ αλqoussvl o‘¬¦²·等kusswl报道小麦三核苷酸 ≥≥• 中占优势的类型是
≤≤Š oŽ¤±·¨·¼等kussul报道却是 „„≤ ∀这种不同物种 ∞≥×2≥≥• 主导核苷酸重复的差异及同一物种中不同报
道结果的差异 o可能是由于各报道中所用 ∞≥×来源和 ∞≥×数目不同所致 ∀
本试验中 o采用 u种软件设计引物 o应用 °µ¬°¨ µv软件设计出 tzy对引物 o共有 tsw对引物产生扩增产物 o
占合成引物的 x|1s| h o其中仅有 uz对引物具有多态性 o仅占筛选引物总数的 ux1|y h ~而用 ≥≥• °µ¬°¨ µ软件
设计出的 tss对引物中有 vz对引物产生了扩增产物 o占合成引物的 vz h o其中有 t{对引物具有多态性 o占
筛选引物总数的 w{1yx h ∀由此可见 o利用 u种不同的设计软件设计 ≥≥• 引物其结果有一定的差异 o建议利
用 ∞≥×序列开发 ≥≥• 引物时尽量采用不同的软件进行设计 o以丰富 ≥≥• 的数量 ∀在所有引物中 o共有 |y对
引物能够成功扩增但是没有多态性 o这可能主要与 ∞≥×建库植株与试验材料的亲缘关系以及引物设计的特
异性有关 o并不是所有的 ∞≥×都有多态性 o有些很保守的片断没有多态性是正常的 ∀根据 ∞≥×序列设计的
引物对基因组 ⁄‘„进行 °≤• 扩增时 o扩增产物通常会比目标 ∞≥×片段长 o这在以往的报道中普遍存在 o如火
炬松的 ∞≥×作图和豌豆k Πισυµ σατιϖυµlkŽ²±²√¤¯²√ ετ αλqoussxl的 ∞≥×2≤„°≥作图 o这主要是由于内含子的存
在 ∀引物设计时尽量利用 ∞≥×序列 vχ端的 vss ¥³o将有助于去除内含子k× °¨¨ ¶ª¨ ± ετ αλqousstl ∀有 tvx对引
物不能进行有效扩增 o可能是由于模板中含有抑制反应的杂质或模板含量低 !引物和 ªun浓度过低 !退火温
度过高 !酶失活 !反应条件不合适 ∀除了进一步优化反应体系之外 o还有可能是因为引物的序列落在 u个外
显子上或两引物间有一长的内含子 o扩增不出产物 ∀目前为止 o可以搜索到 ts vsw个欧洲白桦 ∞≥×序列 o随
着 ∞≥×序列的大量增长还可以进一步开发出更高效的可应用于白桦分子标记的 ≥≥• 引物 ∀
参 考 文 献
忻 雅 o崔海瑞 o卢美贞 o等 qussy1 白菜 ∞≥×2≥≥• 信息分析与标记的建立 q园艺学报 ovvkvl }xw| p xxw q
杨传平 o潘 华 o魏志刚 qussx1 白桦 Œ≥≥•2°≤• 反应体系的优化 q东北林业大学学报 ovvkyl }t p v q
„µ¨¶«¦«¨ ±®²√¤× oŠ¤±¤¯  • qussu1≤²°³¤µ¤·¬√¨ ¤±¤¯¼¶¬¶²© ³²¯¼°²µ³«¬¶° ¤±§ ¦«µ²°²¶²°¤¯ ²¯¦¤·¬²± ²©·²°¤·² °¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨ °¤µ®¨µ¶¬¶²¯¤·¨§©µ²° §¬©©¨µ¨±·
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v{ 第 u期 王艳敏等 }白桦 ∞≥×2≥≥• 信息分析与标记的开发
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k责任编辑 徐 红l
w{ 林 业 科 学 ww卷