全 文 ：第 wu卷 第 tt期
u s s y年 tt 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1wu o‘²1tt
‘²√ qou s s y
杨树 ‘¤nΠ‹ n反向运输蛋白基因kΠτΝΗΞ1 !ΠτΝΗΞ6l
的克隆和检测
张德强 赵树堂 卢孟柱 田 林
k中国林业科学研究院林业研究所 国家林业局林木培育重点实验室 北京 tsss|tl
摘 要 } ‘¤nΠ‹ n反向运输蛋白基因k ΝΗΞl是在细菌 !植物和动物体内普遍存在的一类膜蛋白基因家族 ∀迄今已
在模式植物拟南芥中分离出 ΑτΝΗΞ1 !ΑτΝΗΞ2 !ΑτΝΗΞ3 ! ΑτΝΗΞ4 ! ΑτΝΗΞ5 和 ΑτΝΗΞ6 共 y个成员 o并发现部分成员对
盐胁迫有不同程度的响应 ∀以 ΑτΝΗΞ1 和 ΑτΝΗΞ6 的 ¦⁄‘„核苷酸序列为信息探针 o基于可利用的杨树 ∞≥×数据库
和毛果杨全基因组测序结果 o通过电子杂交辅助的克隆技术 o从毛白杨形成层 ¦⁄‘„中分离得到长度分别为 t yvx ¥³
和 t zs| ¥³的 u个 ¦⁄‘„ o其分别含有编码 xww个和 xuy个氨基酸残基的完整开放阅读框 ∀由它们所推导的蛋白质
序列与拟南芥 !水稻 !小麦和玉米的 ΝΗΞ1 和 ΝΗΞ6 基因的蛋白质序列高度同源 o同源性分别为 z| h !zy h !y| h和
zw h以及 {u h !{u h !uz h 和 uy h o故将其命名为 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 k Š¨ ±…¤±® 注册号分别为 „≠yyszw| 和
„≠{vu|tul ∀≥²∏·«¨µ±杂交分析表明 o ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 均为低拷贝基因k或有一些高度同源的基因l o在杨树基因
组中以 t ∗ w个拷贝形式存在 ∀组织特异性 • ×2°≤• 结果显示 o ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因在杨树根 !茎和叶片中均有
表达 o但其表达模式稍有不同 }ΠτΝΗΞ1 在根部 !形成层 !未成熟木质部 !成熟叶和嫩叶中均高度表达 o在韧皮部和成
熟木质部中有少量表达 o而 ΠτΝΗΞ6 在根部 !成熟叶和嫩叶中表达丰度较高 o在韧皮部 !形成层 !未成熟木质部表达
丰度较低 o在成熟木质部中表达丰度极低 ∀ ‘¤≤¯ 诱导的杨树叶片差异表达 • ×2°≤• 检测结果初步表明 oΠτΝΗΞ1 和
ΠτΝΗΞ6 基因均受盐诱导表达 o当溶液中 ‘¤≤¯ 浓度在 tss ∗ wss °°²¯#pt内 o随着盐浓度的提高 oΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6
基因的表达丰度逐渐增强 o但超过 wss °°²¯#pt后 o其表达丰度均有所降低 o这与所测定的叶片 „…„含量匹配 ∀
关键词 } 杨树 ~‘¤nΠ‹ n反向运输蛋白 ~反转录 °≤• ~盐诱导的差异表达
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussyltt p ssu| p s{
收稿日期 }ussy p sv p uw ∀
基金项目 }国家自然科学基金项目k vswztws|l和国家重大基础研究项目kŠt|||sstyssul资助 ∀
Ισολατιον ανδ Χηαραχτεριζατιον οφ Τωο ΝαΧλ2Ινδυχιβλε ς αχυολαρ ΝαnΠΗn
Αντιπορτερ ΓενεσkΠτΝΗΞ1 o ΠτΝΗΞ6l ιν Ποπυλυσ
«¤±ª ⁄¨ ¬´¤±ª «¤² ≥«∏·¤±ª ∏ ±¨ª½«∏ ׬¤± ¬±
k Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ Φορεστρψo ΧΑΦ ΚεψΛαβορατορψοφ Τρεε Βρεεδινγ ανδ Χυλτιϖατιον o Στατε Φορεστρψ Αδµινιστρατιον Βειϕινγ tsss|tl
Αβστραχτ } ׫¨ ‘¤nΠ‹ n ¤±·¬³²µ·¨µ¬¶¤ ∏¥¬´∏¬·²∏¶ °¨ °¥µ¤±¨ ³µ²·¨¬± ª¨ ±¨ ©¤°¬¯¼ ²© ¥¤¦·¨µ¬¤o ³¯¤±·¶¤±§ °¤°°¤¯¶qŒ±
Αραβιδοπσιστηαλιαναo¶¬¬ ΝΗΞ ¬¶²©²µ°¶«¤√¨ ¥¨ ±¨ ¬§¨±·¬©¬¨§·² §¤·¨ ¤±§¶²°¨ ²© º«¬¦««¤√¨ ¤ °¤­²µ©∏±¦·¬²±¬± µ¨¶³²±¶¨ ·²
‘¤≤¯ q׫¨ Ποπυλυσ ΝΗΞ1 ¤±§ ΝΗΞ6 ¦⁄‘„¬¶²¯¤·¬²± º¤¶³¨µ©²µ°¨ §¥¼∏±§¨µ¯¼¬±ª·«¨ ¨¯ ¦¨·µ²±¬¦¦¯²±¬±ª·¨¦«±¬´∏¨ o¥¤¶¨§²±·«¨
Ποπυλυσ ∞≥× §¤·¤¥¤¶¨¶ ¤±§ Πq τριχηοχαρπα ª¨ ±²°¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨ ∏¶¬±ª ΑτΝΗΞ1 ¤±§ ΑτΝΗΞ6 ±∏¦¯¨ ²·¬§¨ ¦⁄‘„ ¶¨ ∏´¨±¦¨
¬±©²µ°¤·¬²±q׺²¦⁄‘„ ¦¯²±¨ ¶ ±¨¦²§¬±ª ΝΗΞ º¨ µ¨ ¬¶²¯¤·¨§©µ²°·«¨ ¦⁄‘„ ³µ¨³¤µ¨§©µ²°¦¤°¥¬¤¯ ½²±¨ ²© Ποπυλυστοµεντοσα¥¼
·«¨ • ×2°≤• °¨ ·«²§q׫¨ ¶¨ ·º²¦⁄‘„¶¤µ¨ t yvx ¥³¤±§t zs| ¥³¬± ¯¨ ±ª·« º¬·«¦²µµ¨¶³²±§¬±ª²³¨ ± µ¨¤§¬±ª©µ¤°¨ ¶k’• ƒ¶l
º«¬¦«¤µ¨ ¦¤³¤¥¯¨²© ±¨¦²§¬±ª·«¨ ³µ²·¨¬± ²©xww ¤±§xuy ¤°¬±² ¤¦¬§¶k¤¤l oµ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ q ׫¨ §¨§∏¦¨§¤¤ ¶¨ ∏´¨±¦¨ ²©·«¨
ΠτΝΗΞ1 ¤±§ ΠτΝΗΞ6 kŠ¨ ±…¤±® ¤¦¦¨¶¶¬²± ±∏°¥¨µ„≠yyszw| ¤±§ „≠{vu|tul ³µ²·¨¬±¶¶«¤µ¨¶z| h ozy h oy| h ozw h ¤±§
{u h o{u h ouz h ouy h ¬§¨±·¬·¼ º¬·«·«¨ ²·«¨µµ¨¦¨±·¯¼¬¶²¯¤·¨§ Αqτηαλιαναo Ορψζα σατιϖαo Τριτιχυµ αεστιϖυµ ¤±§ Ζεα µαψσ
ΝΗΞ1 ¤±§ ΝΗΞ6 oµ¨¶³¨¦·¬√¨ ¼¯ q • «¨ ± ³²³¯¤µª¨±²°¬¦⁄‘„ º¤¶§¬ª¨¶·¨§º¬·«¶¨¯¨ ¦·¨§µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨½¼°¨ ¶¤±§·«¨ ± ¤±¤¯¼¶¨§²±
¤≥²∏·«¨µ± ¥¯²·oº¨ ©²∏±§²±¨ ·²©²∏µ¥¤±§¶·«¤·º¨ µ¨ ¤¯¥¨¯¯ §¨o¶∏ªª¨¶·¬±ª¤ ²¯º2¦²³¼ ª¨ ±¨ k²µ¤©¨ º «¬ª«¯¼ «²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ¶l
º¬·«¬± ·«¨ ³²³¯¤µª¨±²°¨ q ׬¶¶∏¨ §¬©©¨µ¨±·¬¤¯ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¬±§¬¦¤·¨§·«¤·ΠτΝΗΞ1 ¤±§ ΠτΝΗΞ6 ·µ¤±¶¦µ¬³·¶«¤√¨ ·«¨¬µ°• ‘„
³µ²§∏¦·¶¬±µ²²·¶o¶·¨°¶¤±§¯¨ ¤√¨ ¶o¥∏·«¤√¨ ¶²°¨ §¬©©¨µ¨±¦¨¶¬± ΠτΝΗΞ1 ¤±§ ΠτΝΗΞ6 ª¨ ±¨ q„¶©²µΠτΝΗΞ1 o¬·º¤¶ ¬¨³µ¨¶¶¨§
³µ¨§²°¬±¤±·¯¼¬±µ²²·¶o¦¤°¥¬∏°o¬°°¤·∏µ¨ ¬¼¯ °¨ o¼²∏±ª¯¨ ¤©¤±§°¤·∏µ¨ ¯¨ ¤©oº¬·«¶²°¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¬±·«¨ ³«¯²¨ ° ¤±§°¤·∏µ¨
¬¼¯ °¨ ½²±¨ ²©·«¨ ¶·¨°q׫¨ ΠτΝΗΞ6 ·µ¤±¶¦µ¬³·¶¤µ¨ ·«¨ °²¶·¤¥∏±§¤±·°• ‘„ ³µ²§∏¦·¶¬±µ²²·¶o¼²∏±ª¤±§°¤·∏µ¨ ¯¨ ¤©o¤±§¤
²¯ºp¤¥∏±§¤±¦¨ º¤¶§¨·¨¦·¨§¬± ³«¯²¨ °o¦¤°¥¬∏° ¤±§¬¼¯ °¨ qײ¦²±©¬µ°·«¨ ³²¶¶¬¥¯¨µ¨ª∏¯¤·¬²± ²© ΠτΝΗΞ1 ¤±§ ΠτΝΗΞ6 ª¨ ±¨
¬¨³µ¨¶¶¬²±¥¼ ‘¤≤¯ o·«¨ • ×p°≤• §¨·¨¦·¬²± ²©·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤¥∏±§¤±¦¨ ²©·«¨ ΠτΝΗΞ1 ¤±§ ΠτΝΗΞ6 ª¨ ±¨ ¶º¤¶³¨µ©²µ°¨ §¤·
§¬©©¨µ¨±·‘¤≤¯ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± k©µ²° tss·²yss °°²¯#ptl ¤©·¨µ¨ ¬³²¶∏µ¨·²·«¨ ¶¤¯··µ¨¤·°¨ ±·q׫¨ µ¨¶∏¯·¶¶«²º¨ §·«¤·ΠτΝΗΞ1
¤±§ ΠτΝΗΞ6 °¨ ¶¶¤ª¨ ¯¨ √¨ ¶¯º¨ µ¨ ¬±¦µ¨¤¶¨§©²µ·«¨ ‘¤≤¯ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±²©∏³·²wss °°²¯#pt ¥∏·§¨¦¯¬±¨ §º¬·«·«¨ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±
²© °²µ¨ ·«¤± wss °°²¯#pt ¤±§·«¬¶ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ³¤·¨µ± °¤·¦«¨§·«¨ „…„ ¦²±·¨±·§¨·¨¦·¨§¬±·«¨ ¯¨ ¤√¨ ¶q׫¨ §¤·¤¶∏ªª¨¶··«¤·
ΠτΝΗΞ1 ¤±§ ΠτΝΗΞ6 ¤µ¨ ¬±§∏¦¨§¥¼¶¤¯·¶·µ¨¶¶q
Κεψ ωορδσ} Ποπυλυσ~‘¤nΠ‹ n ¤±·¬³²µ·¨µ¶~• ×p°≤• ~⁄¬©©¨µ¨±·¬¤¯ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¬±§∏¦¨§¥¼¶¤¯·¶·µ¨¶¶
土壤盐渍化是限制农林业生产和影响生态环境的一个非常重要的非生物胁迫因素 o而生物工程已成为
改良植物适应盐渍化土壤最为理想和最有前途的方法 o受到世界各国政府的高度重视 ∀国内外研究主要涉
及盐胁迫条件下 o植物在损伤蛋白的降解与修复 !钠离子运输 !渗透调节物质合成 !钙调蛋白和胚胎发育晚期
丰富蛋白等方面发生的变化以及相关基因的克隆和转化 o这些研究成果大大推动了植物耐盐遗传改良的进
程k«¤² ετ αλqoussvl ∀迄今 o已克隆了数十个与盐胁迫诱导表达相关的基因 o证实了渗调物质如甜菜碱 !脯
氨酸 !山梨醇 !甘露醇等在高等植物耐盐方面有渗透保护与调节作用 o但这些物质单独对耐盐性的作用并不
显著 o有的甚至与耐盐性无关kƒ¯ ²º¨ µ¶ousswl ∀据报道 o盐胁迫对植物生长发育的主要危害表现为 o‘¤n在
细胞质中大量累积所导致的细胞生理生化代谢活动的抑制 o以及胞内离子平衡的破坏 ∀提高植物耐盐性的
一个重要方面就是降低胞质中的 ‘¤n含量 ∀耐盐型植物把 ‘¤n排入液泡 o这样不但减少了胞质中 ‘¤n的含
量 o同时排入的 ‘¤n也可作为一种离子渗透调节剂 o来克服高盐环境所引起的水分胁迫k¨¶¦«®¨ ot|{wl ∀ ‘¤n
排入液泡主要是通过液泡膜上 ‘¤n r‹ n ¤±·¬³²µ·¨µ¶k‘‹÷l来完成 o这种反向转运由液泡膜上 ‹ n p „×°¤¶¨ 和
‹ n p °°¤¶¨ 所产生的跨膜 ‹ n梯度来驱动k…¤µ®¯¤ ετ αλqot||tl ∀
‘¤nΠ‹ n反向运输蛋白基因k ΝΗΞl是在细菌 !植物和动物体内普遍存在的一类膜蛋白基因家族 ∀第一个
ΝΗΞ基因由 ≥¤µ§¨·等kt|{|l从人体中分离出来 o而随后又相继分离出其他 y个 ΝΗΞ成员并检测出它们具有
‘¤nΠ‹ n反向运输的功能k≤²∏±¬¯¯²± ετ αλqousssl ∀借助人的 ΝΗΞ序列 o首先在模式植物拟南芥k Αραβιδοπσισ
τηαλιαναl中分离出了 y个 ΝΗΞ基因 o序列分析显示其与人 ΝΗΞ基因的同源性较高k≠²®²¬ετ αλqoussul ∀在
此基础上 o先后在主要农作物如水稻k Ορψζα σατιϖαl !小麦k Τριτιχυµ αεστιϖυµ l !玉米k Ζεα µαψσl和陆地棉
k Γοσσψπιυµ ηιρσυτυµl中以及果树如柑桔k Χιτρυσρετιχυλαταl中分离出多个 ΝΗΞ成员 ∀为了检测 ΝΗΞ1 转基因植
株对盐的耐受性 o有研究者先后将 ΑτΝΗΞ1 基因转入拟南芥 !西红柿k Λψχοπερσιχον εσχυλεντυµ l !欧洲油菜
k Βρασσιχα ναπυσl中并对转基因植株进行了耐盐测定 o研究结果表明 o转 ΑτΝΗΞ1 植株均可耐受 uss °°²¯#pt
‘¤≤¯ 水溶液的浇灌 o并能正常生长 !开花和结实k„³¶¨ ετ αλqot||| ~«¤±ª ετ αλqousst¤~usst¥l ∀
ΝΗΞ基因成员虽已从细菌 !植物和动物中分离出来并进行了功能性检测 o但对于高度杂合 !世代周期较
长 !树体高大 o对经济建设和环境保护具有重要作用的用材树种来说还未见关于该基因分离和检测的报道 ∀
因此 o分离用材树种 ΝΗΞ基因并对其产物的功能进行研究显得尤为必要 ∀为此 o本研究以 ΑτΝΗΞ1 和
ΑτΝΗΞ6 的 ¦⁄‘„核苷酸序列为信息探针 o基于可利用的杨树 ∞≥×数据库和毛果杨k Ποπυλυστριχηοχαρπαl全基
因组测序结果 o通过电子杂交辅助的克隆技术 o从毛白杨k Ποπυλυσ τοµεντοσαl形成层 ¦⁄‘„ 中分离得到 u个
ΝΗΞ基因成员 ∀在此基础上 o进行了杨树基因组 ≥²∏·«¨µ±杂交分析以及组织特异性和盐诱导的差异表达分
析 ∀本研究为分离其他树种 ΝΗΞ成员以及阐明 ΝΗΞ的功能奠定了重要的基础 ∀
t 材料和方法
111 植物材料
从河北省邱县 w年生易县毛白杨雌株上取根部组织 !韧皮部 !形成层 !未成熟木质部 !成熟木质部 !嫩叶
和成熟叶片材料并置于液氮中冻存备用 ∀
112 总 ∆ΝΑ的提取
按 ∏µµ¤¼和 ׫²°³¶²± kt|{sl描述的方法进行 ∀
sv 林 业 科 学 wu卷
113 ΡΝΑ提取和 χ∆ΝΑ的合成
毛白杨根部组织 !韧皮部 !形成层 !未成熟木质部 !成熟木质部 !嫩叶和成熟叶片材料总 • ‘„的提取和
¦⁄‘„的合成分别按 • ‘¨¤¶¼ °¯¤±·¬±¬Ž¬·¶k±¬¤ª¨±oŒ±¦qo∂¤¯ ±¨¦¬¤o≤„ o˜≥„l和 ≤¯ ²±¨ ·¨¦«试剂盒描述的方法
进行 ∀
114 电子杂交
以 ΑτΝΗΞ1 和 ΑτΝΗΞ6 ¦⁄‘„ 序列kŠ¨ ±…¤±®注册号分别为 ‘ p tuux|z和 „ƒw|sx|sl为信息探针 o将其输
入瑞典和法国杨树 ∞≥×数据库k≥·¨µ®¼ ετ αλqousswl以及毛果杨全基因组数据库k • ∏¯¯ ¶¦«¯ ª¨¨µετ αλqoussul同
源比较服务器进行 …„≥ב分析k„¯·¶¦«∏¯ ετ αλqot||zl o筛选出同源性在 zx h以上的 ∞≥׶和 ≤²±·¬ª¶作为候
选序列 o然后逐一将这些序列送 Š¨ ±…¤±®核酸数据库检索 o后将这些序列进行整合拼接 o获得统计上完整的序列 ∀
115 电子杂交探针制备
根据所得的 ∞≥×重叠群整合序列 o在其可能的开放阅读框两端设计一对寡聚核苷酸引物 }
°·‘‹÷tƒ }xχ2„׊ oŠ„× o≤×× o„„≤ oŠ×Š o„Š× o×≤„ o„2vχ °·‘‹÷t • }xχ2×≤„ o„׊ o≤≤„ o×׊ o„×× o≤ŠŠ o„Š2vχ
°·‘‹÷yƒ }xχ2„׊ o≤„Š o„ׄ o×≤„ o≤≤Š oŠ≤„ oŠŠ„2vχ °·‘‹÷y • }xχ2ŠŠ≤ o„„Š o„׊ o≤„× o„„≤ o׊≤ o„Š×2vχ
应用 ux ˏ⁄‘„聚合酶链反应k°≤• l体系 o以毛白杨形成层 ¦⁄‘„为模板 o加入 u1x ˏts ≅ ¥∏©©¨µo
t1{ ˏux °°²¯#pt ª≤¯ u ot ˏts °°²¯#pt §‘×° oפ´ ⁄‘„聚合酶 t1s ˜k以上试剂购自 °µ²°¨ ª¤公司l otss
±°²¯#pt引物各 t ˏo加适量双蒸水至 ux ˏ∀于 |w ε ov °¬± ψk|v ε ovs ¶ ψxw ε ovs ¶ψ zu ε ot °¬±l
vx个循环 ψzu ε ox °¬±热循环条件下 o扩增出长约 t zss ¥³的 ¦⁄‘„ 片段 ∀
116 ΠΧΡ 产物的克隆 !测序及计算机分析
将 °≤• 扩增得到的目的基因片断回收后连接于 ³Š∞2×上 ∀连接产物转化大肠杆菌 ⁄‹x~ o筛选阳性克
隆 o送上海联合基因公司测序 ∀提取其质粒经酶切和 °≤• 扩增来验证目的基因 ∀应用 ⁄‘„„‘w1s软件和
≤˜≥ׄ÷ 软件包程序推导出氨基酸序列并进行 ‘≤…Œ检索分析 o然后分别估算和预测推导蛋白质的分子量
和等电点 ∀
117 基因组 ∆ΝΑ Σουτηερν βλοττινγ
用 ∆ρα´ !Ηιν§¶ !Ξβα´ !Νχο ´ !Εχο• ´分别酶切 ts Λª毛白杨基因组总 ⁄‘„ ∀以 …¬²·¬±标记的 ΠτΝΗΞ1
和 ΠτΝΗΞ6 基因的编码区为探针 o按照 ‘²µ·«u≥²∏·«× …¬²·¬± •¤±§²° °µ¬°¨ Ž¬·和 ‘²µ·«u≥²∏·« ≤«¨ °¬¯∏°¬±¨ ¶¦¨±·
‹¼¥µ¬§¬½¤·¬²± ¤±§ ⁄¨·¨¦·¬²± Ž¬·试剂盒说明进行 ≥²∏·«¨µ±杂交 ∀
118 杨树苗木 ΝαΧλ处理
将 t年生毛白杨苗木的根部浸入 ‹²¤ª¯¤±§营养液中 o含 s ∗ yss °°²¯#pt的 ‘¤≤¯ 浓度处理 x «后取其
叶片进行 „…„测定和 • ‘„提取 ∀
119 ΡΤ2ΠΧΡ 反应
依据 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因的编码区 o分别设计一对能够扩增出 wss ¥³左右 ¦⁄‘„ 片段的引物 o• ×2
°≤• 引物序列如下 }
°·‘‹÷t • ׃ }xχ2„׊ o„׊ o≤≤„ o≤„× o≤„Šo׊Šo׊≤2vχ °·‘‹÷t • ו }xχ2≤×≤ o„„× oŠ×≤ o≤„ŠoŠŠ≤ o„×≤ o≤„×2vχ
°·‘‹÷y • ׃ }xχ2„׊ o≤×× oŠ≤„ oŠ„„ oŠŠ× o≤×× oŠŠ≤2vχ °·‘‹÷y • ו }xχ2≤≤„ o×Š× o≤≤× o×≤× oŠŠ„ o„Š„ o×≤„2vχ
以逆转录合成的 ¦⁄‘„ 第 t链为模板 ∀样品经 |w ε 预变性 v °¬±o后进行 |w ε ovs ¶oxw ε ovs ¶o
zu ε ot °¬±ou{个循环 ozu ε 延伸 x °¬±作 °≤• 反应 ∀
u 结果与讨论
211 毛白杨 ΝΗΞ同源 χ∆ΝΑ的克隆及其结构特征分析
为了分离杨树 ΝΗΞ蛋白基因¦⁄‘„序列 o从拟南芥 ΑτΝΗΞ1 和 ΑτΝΗΞ6 ¦⁄‘„序列出发 o筛选杨树 ∞≥×和
毛果杨全基因组数据库 ∀对于 ΝΗΞ1 o共获得了 x 个候选序列 ו ∞∞vsv||{1¥u ! ÷÷Œ ywt w{s1¥t !
ו ∞∞ttvu{x1¥u !Œ°Š≤2swsvvs1tw{zx1≤t和 ≥ stwŠtt1u1v° ³• q¤¥tk图 t„l o而对于 ΝΗΞ6 o共获得了 v个候选序
列 ˜…xu⁄°ƒs| !≠ƒ≥ vwv{v1ªu和 ∂ swx⁄stk图 t…l o这些候选的 ∞≥׶和 ≤²±·¬ª¶与拟南芥的 ΝΗΞ同源性均在
zx h以上 o应用 ⁄‘„„‘w1s软件包 „≥≥∞…∞程序拼接出较为完整的杨树 ΝΗΞ ¦⁄‘„ 序列 o整合后的
tv 第 tt期 张德强等 }杨树 ‘¤nΠ‹ n反向运输蛋白基因k ΠτΝΗΞ1 !ΠτΝΗΞ6l的克隆和检测
ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 的 ¦⁄‘„序列全长分别为 t yvx ¥³和 t zs| ¥³左右k图 tl ∀根据理论序列 o设计了能扩增
出编码区全长的 u对引物 °·‘‹÷tƒ 和 °·‘‹÷t • 以及 °·‘‹÷yƒ和 °·‘‹÷y • o以毛白杨形成层总 ¦⁄‘„为模板
进行 °≤• 扩增 ∀扩增产物经 s1{ h琼脂糖凝胶电泳分离k图 ul o在大小分别约为 t yvx ¥³和 t zs| ¥³处各扩
增出一条明亮的特异条带 ∀将扩增的特异片段回收 !纯化并与 ³Š∞p×载体连接后克隆测序 ∀测序结果表
明 o克隆的这 u个杨树 ΝΗΞ ¦⁄‘„总长分别为 t yvx ¥³和 t zs| ¥³o与理论上 ∞≥× 整合的核苷酸序列完全一
致 o故将其命名为 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 ∀在 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 序列中 o基因内部含有完整的开放阅读框架 o大
小分别为 t yvx ¥³和 t x{t ¥³o可编码长度分别为 xww和 xuy个氨基酸残基的蛋白质k基因注册号分别为
„≠yyszw|和 „≠{vu|tul ∀运用 ⁄‘„„‘w1s软件估算推导的这 u个蛋白质的分子量分别约为 ys1u ®⁄和
xz1y ®⁄o其等电点分别为 z1ws和 x1w{ ∀
图 t 电子杂交获得的 ΠτΝΗΞ1k„l和 ΠτΝΗΞ6k…l表达序列标签k∞≥׶l和 ≤²±·¬ª¶重叠群示意图
ƒ¬ªqt ’√¨ µ¯¤³§¬¤ªµ¤° ²© ∞≥׶¤±§≤²±·¬ª¶¤√¤¬¯¤¥¯¨©²µΠτΝΗΞ1k„l ¤±§ ΠτΝΗΞ6k…l º¬·«¨¯ ¦¨·µ¬¦«¼¥µ¬§¬½¤·¬²±
图 u 从毛白杨形成层 ¦⁄‘„中扩增的 ΠτΝΗΞ1
k„l和 ΠτΝΗΞ6k…l ¦⁄‘„电泳图
ƒ¬ªqu ׫¨ ¦⁄‘„ ©µ¤ª° ±¨·²© ΠτΝΗΞ1k„l ¤±§
ΠτΝΗΞ6k…l ³µ²§∏¦¨§¥¼ • ×2°≤•
 qt ®¥ ⁄‘„ ¤¯§§¨µ~
t q从毛白杨形成层 ¦⁄‘„中扩增出的特异片段
Š¨ ±¨ ¶³¨¦¬©¬¦°≤• ©µ¤ª° ±¨·¤°³¯¬©¬¨§©µ²°
¦¤°¥¬∏° ¦⁄‘„ ²© Πqτοµεντοσα q
212 χ∆ΝΑ序列查新 !预测的蛋白质一级结构及其系统发育进
化分析
将 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因序列与已公开的拟南芥基因序
列进行同源比较 o发现它们与拟南芥的 ΑτΝΗΞ1 和 ΑτΝΗΞ6
kŠ¨ ±…¤±®注册号分别为 ‘ p tuux|z和 „ƒw|sx|sl高度同源 o同
源性分别为 zx h和 z| h ∀ ‘≤…Œ检索结果初步表明 oΠτΝΗΞ1 和
ΠτΝΗΞ6 是林木中首次克隆的 ‘‹÷ 蛋白基因 ∀为了分析 °·‘‹÷t
和 °·‘‹÷y 蛋白质的一级结构特征 o将 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 ¦⁄‘„
推导的氨基酸序列与拟南芥的 ΑτΝΗΞ1 和 ΑτΝΗΞ6 !水稻的
ΟσΝΗΞ1 以及西红柿的 ΛεΝΗΞ1 和 ΛεΝΗΞ2 进行了同源比较和结
构分析 o结果见图 v ∀ °·‘‹÷t 与拟南芥 !水稻和西红柿的 ‘‹÷t
蛋白质氨基酸序列高度同源 o同源性分别为 z| h !zy h和 zs h o
而 °·‘‹÷y 与 „·‘‹÷y 和 ¨‘‹÷u 高度同源 o同源性分别为 {u h
和 {v h o但 °·‘‹÷t 和 °·‘‹÷y 蛋白质氨基酸同源性则很低 o仅
为 ux h ∀由图 v 显示的 ‘‹÷ 蛋白质一级结构可见 o无论
°·‘‹÷t 和 °·‘‹÷y 之间以及与拟南芥 !水稻和西红柿 ‘‹÷ 的同
源性高与低 o它们都含有 tu个转膜区域k由 ´ o µ o ¶ , ¿等表
示l ∀在这 tu 个转膜区域中 o°·‘‹÷t 与 „·‘‹÷t !’¶‘‹÷t 和
¨‘‹÷t 以及 °·‘‹÷y 与 „·‘‹÷y 和 ¨‘‹÷u 氨基酸序列高度相似 o特别是 ¶至 ¿相似度更高 o其中 √ 和 º 被
认为参与了 ‘¤nΠ‹ n反向运输活动k≠²®²¬ετ αλqoussul ∀
uv 林 业 科 学 wu卷
图 v °·‘‹÷t 和 °·‘‹÷y 与其他植物 ‘‹÷ 蛋白质一级结构比较
ƒ¬ªqv ≤²°³¤µ¬¶²± ²©·«¨ ³µ¬°¤µ¼ ¶·µ∏¦·∏µ¨ ²©‘‹÷ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶©µ²° §¬©©¨µ¨±·²µª¤±¬¶°¶
为了分析杨树 °·‘‹÷t 和 °·‘‹÷y 与其他生物 ‘‹÷ 蛋白的系统发育进化关系 o利用 ≤¯ ∏¶·¤¯÷ 软件
k׫²°³¶²± ετ αλqot||zl将在 ‘≤…Œ注册的拟南芥k„·‘‹÷t ∗ yl !玉米k°‘‹÷t ∗ yl !水稻k’¶‘‹÷t ! ’¶‘‹÷u 和
vv 第 tt期 张德强等 }杨树 ‘¤nΠ‹ n反向运输蛋白基因k ΠτΝΗΞ1 !ΠτΝΗΞ6l的克隆和检测
图 w °·‘‹÷t 和 °·‘‹÷y 与部分其他生物 ‘‹÷ 的无根系统发育进化树
ƒ¬ªqw ˜±µ²²·¨§³«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¨¨²©°·‘‹÷t ¤±§°·‘‹÷y º¬·«·«¨ ²·«¨µ³¤µ·¬¤¯ ²µª¤±¬¶°¶‘‹÷
’¶‘‹÷wl !小麦kפ‘‹÷t 和 פ‘‹÷ul !大麦k Ηορδευµ ϖυλγαρεlk‹√‘‹÷tl !西红柿k¨‘‹÷t 和 ¨‘‹÷ul !陆地棉
kŠ«‘‹÷tl !柑桔k≤µ‘‹÷tl !欧洲油菜k…±‘‹÷tl !番薯k Ιποµοεα νιλlkŒ±‘‹÷tl !海蓬子k Σαλιχορνια ευροπαεαl
k≥¨ ‘‹÷tl !盐地碱蓬k Συαεδα σαλσαlk≥¶‘‹÷tl !老鼠k Μυσ µυσχυλυσlk °‘‹∞{l !果蝇k ∆ροσοπηιλα µελανογαστερl
k⁄°‘‹∞tl !酵母kΣχηιζοσαχχηαροµψχεσ ποµβεlk≥³‘‹∞l等 tz个物种共 vu个 ‘‹÷ 蛋白氨基酸序列进行了序列
排列 o后利用 ×µ¨ √¨¬¨º软件k°¤ª¨ ot||yl得到了这些 ‘‹÷ 蛋白的系统进化树k图 wl ∀从图 w可见 o‘‹÷ 蛋白
由极点向 v个方向发生了进化 o其中有一分支在进化中占有主导地位 o共有 uw个 ‘‹÷ 蛋白属于该类 o该类
全部由植物 ‘‹÷ 蛋白组成 ∀研究结果初步表明 o占主导地位的这一分支的 ‘‹÷ 蛋白主要附着在液泡膜上 o
起 ‘¤nΠ‹ n反向运输的作用k°¤¶¦¤¯ ετ αλqousstl o而本研究中克隆的 °·‘‹÷t 就属于该类 ~第 u分支包括 x个
‘‹÷ 蛋白 o该分支在进化过程的起始阶段就分成了 u个小分支 o一为植物 ‘‹÷ 蛋白 o另一为真菌酵母 ‘‹÷
蛋白 ∀有研究表明这一类 ‘‹÷ 蛋白与 ŽnΠ‹ n 反向运输的功能有关 o对 ‘¤n 盐不太敏感k∂ ±¨¨ °¤ ετ αλqo
ussvl ~第 v个分支包括 v个 ‘‹∞蛋白 o它们均属于动物类 ‘‹∞蛋白 o该类蛋白附着在动物体内质膜上 o对
‘¤nΠ‹ n反向运输有重要作用k∂ ±¨¨ °¤ ετ αλqoussvl ∀
213 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因的 Σουτηερν 杂交分析
利用能够酶切充分且探针内部不含有所用内切酶位点的限制性内切酶 ∆ρα ´ !Ηιν§¶ !Ξβα ´ !Νχο ´ !
Εχο• ´分别酶切 ts Λª杨树总 ⁄‘„ ∀以 …¬²·¬±标记的 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因的编码区为探针 o按照
‘²µ·«u≥²∏·«× …¬²·¬± •¤±§²° °µ¬°¨ Ž¬·和 ‘²µ·«u≥²∏·« ≤«¨ °¬¯∏°¬±¨ ¶¦¨±·‹¼¥µ¬§¬½¤·¬²± ¤±§ ⁄¨·¨¦·¬²± Ž¬·试剂盒说
明进行 ≥²∏·«¨µ±杂交分析 o得到如图 x所示的图谱 ∀由图 x可见 o对于 ΠτΝΗΞ1 基因 o用 ∆ρα´ !Ηιν§¶ !Ξβα
´酶切杨树总 ⁄‘„ 时 o≥²∏·«¨µ±杂交分析均能得到 w条杂交信号条带 o而对于 ΠτΝΗΞ6 基因 o用 ∆ρα ´ !Νχο
´ !Εχο• ´酶切时 o能得到 t ∗ w条杂交信号带 o考虑到树木属于高度杂合类型的物种 o因此 o可以推测
ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 均为低拷贝基因k或有一些高度同源的基因l o在杨树基因组中以 t ∗ w个拷贝形式存在 ∀
wv 林 业 科 学 wu卷
图 x ΠτΝΗΞ1k„l 和 ΠτΝΗΞ6k…l
基因的 ≥²∏·«¨µ±杂交分析
ƒ¬ªqx Š¨ ±²°¬¦⁄‘„ ª¨¯ ¥¯²·
«¼¥µ¬§¬½¤·¬²± ¤±¤¯¼¶¬¶²© ΠτΝΗΞ1k„l
¤±§ ΠτΝΗΞ6k…l
214 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因的组织表达谱分析
采用 • ‘¨¤¶¼ °¯¤±·¬±¬Ž¬·¶试剂盒分别提取杨树根部 !韧皮部 !形成
层 !未成熟木质部 !成熟木质部 !嫩叶和老叶组织的总 • ‘„并用紫外分光
光度计定量分析提取的各个组织的 • ‘„含量 ∀在此基础上 o用 u Λª总
• ‘„为模板k图 y„l o按照 ≤¯ ²±¨ ·¨¦«试剂盒描述的方法进行 • ‘„反转录
反应分别得到各个组织部分的第 t链 ¦⁄‘„ ∀为了检测转录的 ¦⁄‘„ 的
浓度和质量情况 o利用在植物体内广泛存在的杨树泛素结合酶k˜¥¬´∏¬·¬±
≤²±­∏±¦·¬²± ∞±½¼°¨ l基因序列设计的引物来扩增 ¦⁄‘„ 模板 o结果见图
y…o可见 o以这 z个组织材料的 ¦⁄‘„模板扩增的杨树泛素结合酶基因片
段的丰度基本一致 o可用于 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因的组织表达谱分析 ∀
依据 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因的编码区 o分别设计一对能够扩增出
wss ¥³ 左右的 ¦⁄‘„ 片段的引物 °·‘‹÷t • ׃ 和 °·‘‹÷t • ו o以及
°·‘‹÷y • ׃和 °·‘‹÷y • ו o以逆转录合成的 ¦⁄‘„ 第 t链为模板 ∀样品
经|w ε 预变性 v °¬±o后进行 |w ε vs¶oxw ε vs ¶ozu ε t °¬±ou{个循
环 ozu ε 延伸 x °¬±作 °≤• 反应 ∀反应产物经 s1{ h琼脂糖凝胶电泳分
离后 o用 ∞…染色后得到如图 y≤ 和 ⁄所示的结果 ∀ ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基
因在杨树根 !茎和叶片中均有表达 o但其表达模式稍有不同 }ΠτΝΗΞ1 在根
部 !形成层 !未成熟木质部 !成熟叶和嫩叶中均高度表达 o在韧皮部和成熟
木质部中有少量表达 ~而 ΠτΝΗΞ6 在根部 !成熟叶和嫩叶中表达丰度较
高 o在韧皮部 !形成层 !未成熟木质部表达丰度较低 o在成熟木质部中表达丰度极低 ∀
图 y ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因的
组织表达谱分析
ƒ¬ªqy • ¨¯¤·¬√¨·µ¤±¶¦µ¬³·¤¥∏±§¤±¦¨ ²© ΠτΝΗΞ1 ¤±§
ΠτΝΗΞ6 ª¨ ±¨ ¶¬± §¬©©¨µ¨±··¬¶¶∏¨¶
t1 根部 • ²²·~u q韧皮部 °«¯²¨ ° ~v q形成层 ≤¤°¥¬∏° ~
w q未成熟木质部 Œ°°¤·∏µ¨ ¬¼¯ °¨ ~x q成熟木质部 ¤·∏µ¨
¬¼¯ °¨ ~y q嫩叶 ≠²∏±ª¯¨ ¤©~z q成熟叶 ¤·∏µ¨ ¯¨ ¤©q
图 z ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因的
‘¤≤¯ 诱导差异表达分析
ƒ¬ªqz • ª¨∏¯¤·¬²± ²© ΠτΝΗΞ1 ¤±§ ΠτΝΗΞ6
ª¨ ±¨ ¶ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¬±§∏¦¨§¥¼ ¶¤¯·¶·µ¨¶¶
t q≤Ž~u qtss °°²¯#pt ~v quss °°²¯#pt ~w qvss °°²¯#pt ~
x qwss °°²¯#pt ~y qxss °°²¯#pt ~z qyss °°²¯#pt q
215 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因的调控表达
为了检测 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因对 ‘¤≤¯ 的诱导是否具有调控表达的作用 o且有报道当植物在盐胁迫处
理时 o植物叶片对盐的反应较为敏感 o可积累较多的盐分k≠²®²¬ετ αλqoussul ∀因此 o本研究将 t年生杨树苗
的根部浸入 ‹²¤ª¯¤±§营养液 o溶液的 ‘¤≤¯ 浓度在 s ∗ yss °°²¯#pt设 y个梯度ktss ouss ovss owss oxss o
yss °°²¯#ptl分别处理 x «后取其叶片进行 „…„测定和 • ‘„提取 ∀与 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因的组织表达
谱分析一样 o分别提取对照和不同 ‘¤≤¯ 浓度处理后的叶片总 • ‘„并进行定量分析 o用泛素来检测反转录后
所得第 t链 ¦‘⁄„的质量和数量k图 z„ !…l ∀在此基础上 o利用 • ×2°≤• 检测了 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 对不同浓
xv 第 tt期 张德强等 }杨树 ‘¤nΠ‹ n反向运输蛋白基因k ΠτΝΗΞ1 !ΠτΝΗΞ6l的克隆和检测
度 ‘¤≤¯ 溶液处理后的差异表达情况 o结果见图 z≤ !⁄o可见 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因均受盐诱导表达 o当溶液
中 ‘¤≤¯ 浓度在 tss ∗ wss °°²¯#pt范围内 o随着盐浓度的提高 oΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 基因的表达丰度逐渐增
强 o但超过 wss °°²¯#pt后 o其表达丰度均有所降低 o这与所测定的叶片 „…„含量相匹配k图 zl o但 ΠτΝΗΞ6
对 ‘¤≤¯ 的诱导表达不如 ΠτΝΗΞ1 敏感 ∀因此 o该研究初步表明 o所分离的 ΠτΝΗΞ1 和 ΠτΝΗΞ6 均为受 ‘¤≤¯ 胁
迫诱导的基因 ∀
参 考 文 献
„¯·¶¦«∏¯ ≥ ƒ o ¤§§¨± × o≥¦«¤©©¨µ„ „ o ετ αλqt||z1 Š¤³³¨ §…„≥× ¤±§°≥Œp…„≥× }¤ ±¨ º ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ²©³µ²·¨¬± §¤·¤¥¤¶¨ ¶¨¤µ¦«³µ²ªµ¤°¶q‘∏¦¯ ¬¨¦„¦¬§¶
• ¶¨oux }vv{| p vwsu
„³¶¨  ° o„«¤µ²± Š ≥ o≥±¨ §§¨± • „ o ετ αλqt|||1 ≥¤¯··²¯ µ¨¤±¦¨ ¦²±©¨µµ¨§¥¼ ²√¨ µ¨¬³µ¨¶¶¬²± ²©¤√¤¦∏²¯¤µ‘¤nΠ‹ n ¤±·¬³²µ·¬± Αραβιδοπσισq≥¦¬¨±¦¨ ou{x }
tuxy p tux{
…¤µ®¯¤ … o …¯∏°º¤¯§∞qt||t1 Œ§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²©¤tzs ®⁄¤³µ²·¨¬± ¤¶¶²¦¬¤·¨§º¬·«·«¨ √¤¦∏²¯¤µ‘¤nΠ‹ n ²© Βετα ϖυλγαρισq°‘„≥ o{{ }tttzz p ttt{t
≤²∏±¬¯¯²± o°²∏¼¶¶¨ª∏µqusss1 ׫¨ ¬¨³¤±§¬±ª©¤°¬¯¼ ²© ∏¨®¤µ¼²·¬¦‘¤nΠ‹ n ¬¨¦«¤±ª¨µ¶q…¬²¯ ≤«¨ ° ouzx }t p w
ƒ¯ ²º µ¨¶× qussw1 Œ°³µ²√¬±ª¦µ²³¶¤¯··²¯ µ¨¤±¦¨ q²∏µ±¤¯ ²© ∞¬³¨µ¬° ±¨·¤¯ …²·¤±¼oxx }vsz p vt|
¨¶¦«®¨ • ⁄qt|{w1 Žnp‘¤n ¬¨¦«¤±ª¨ ¤·¦¨¯¯∏¯¤µ°¨ °¥µ¤±¨ ¶o¬±·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µ¦²°³¤µ·°¨ ±·¤·¬²± ²©¦¤·¬²±¶o¤±§¶¤¯··²¯ µ¨¤±¦¨ Μ≥·¤³¯ ¶¨ • ≤ oײ¨ ±±¬¨¶¶¨± ≤ ‹ q
≥¤¯¬±¬·¼·²¯ µ¨¤±¦¨ ¬± ³¯¤±·¶¶·µ¤·¨ª¬¨¶©²µ¦µ²³¬°³µ²√ °¨ ±¨·q ‘¨º ≠²µ®} • ¬¯¨ ¼pŒ±·¨µ¶¦¬¨±¦¨ ovz p yy
∏µµ¤¼  Š o׫²°³¶²± • ƒ qt|{s1 •¤³¬§¬¶²¯¤·¬²± ²©«¬ª«p°²¯ ¦¨∏¯¤µpº ¬¨ª«·³¯¤±·⁄‘„ q‘∏¦¯ ¬¨¦„¦¬§¶• ¶¨o{ }wvut p wvux
°¤ª¨ • ⁄qt||y1 ×µ¨ ∂¨¬¨º }¤± ¤³³¯¬¦¤·¬²±·²§¬¶³¯¤¼ ³«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¨ ¶¨²± ³¨µ¶²±¤¯ ¦²°³∏·¨µ¶q≤²°³∏·„³³¯ …¬²¶¦¬otu }vxz p vx{
°¤¶¦¤¯  o׫²°¬±¨ ≥ o≥¦«µ²¨ §¨µŒo ετ αλqusst1 °«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³¶º¬·«¬± ¦¤·¬²±·µ¤±¶³²µ·¨µ©¤°¬¯¬¨¶²© Αραβιδοπσισq °¯ ¤±·°«¼¶¬²¯²ª¼otuy }tywy p
tyyz
≥¤µ§¨·≤ oƒµ¤±¦«¬„ o°²∏¼¶¶¨ qt|{|1 ²¯ ¦¨∏¯¤µ¦¯²±¬±ªo³µ¬°¤µ¼ ¶·µ∏¦·∏µ¨ o¤±§ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©·«¨ «∏°¤± ªµ²º·«©¤¦·²µ¤¦·¬√¤·¤¥¯¨‘¤nΠ‹ n ¤±·¬³²µ·¨µq≤¨¯¯o
xy }uzt p u{s
≥·¨µ®¼ ƒ o…«¤¯ µ¨¤² • • o ˜±±¨ ¥¨µª° o ετ αλqussw1 „ Ποπυλυσ ∞≥× µ¨¶²∏µ¦¨ ©²µ³¯¤±·©∏±¦·¬²±¤¯ ª¨ ±²°¬¦¶q°µ²¦‘¤·¯ „¦¤§≥¦¬˜≥„ otst }tv|xt p tv|xy
׫²°³¶²± ⁄oŠ¬¥¶²± × o°¯ º¨±¬¤® ƒ o ετ αλqt||z1 ׫¨ ≤˜≥ׄ÷ º¬±§²º¶¬±·¨µ©¤¦¨ }©¯ ¬¨¬¥¯¨¶·µ¤·¨ª¬¨¶©²µ°∏¯·¬³¯¨¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¤¯¬ª±° ±¨·¤¬§¨§¥¼ ∏´¤¯¬·¼
¤±¤¯¼¶¬¶·²²¯¶q‘∏¦¯ ¬¨¦„¦¬§¶• ¶¨oux }w{zy p w{{u
∂ ±¨¨ °¤Žo …¨ √¯¨ µ„ o ¤µς±2¤±½¤±²  ≤ o ετ αλqussv1 „ ±²√¨ ¯¬±·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µŽnΠ‹ n ¤±·¬³²µ·¨µµ¨ ¤¯·¨§·² ‘¤nΠ‹ n ¤±·¬³²µ·¨µ¶¬¶¬°³²µ·¤±·©²µŽn ¬²±
«²°¨ ²¶·¤¶¬¶¬± ³¯¤±·¶q׫¨ ²∏µ±¤¯ ²© …¬²¯²ª¬¦¤¯ ≤«¨ °¬¶·µ¼ouz{ }uuwxv p uuwx|
• ∏¯ ¶¯¦«¯ ª¨¨µ≥ ⁄o¤±¶¶²± ≥ qussu1 Š¨ ±²°¬¦¶¤±§©²µ¨¶·¥¬²¯²ª¼ } Ποπυλυσ °¨ µ¨ª¨¶¤¶·«¨ ³¨µ¨±±¬¤¯ ©¤√²µ¬·¨q׫¨ °¯ ¤±·≤¨¯¯otw }uyxt p uyxx
≠²®²¬≥ o±∏¬±·¨µ² ƒ o≤∏¥¨µ² …o ετ αλqussu1 ⁄¬©©¨µ¨±·¬¤¯ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¤±§©∏±¦·¬²±²© Αραβιδοπσιστηαλιανα ‘‹÷ ‘¤nΠ‹ n ¤±·¬³²µ·¨µ¶¬±·«¨ ¶¤¯·¶·µ¨¶¶µ¨¶³²±¶¨ q
׫¨ °¯ ¤±·²∏µ±¤¯ ovs }xu| p xv|
«¤±ª ‹²±ª¬¬¤o …¯∏°º¤¯§∞qusst¤q×µ¤±¶ª¨ ±¬¦¶¤¯·p·²¯ µ¨¤±··²°¤·² ³¯¤±·¶¤¦¦∏°∏¯¤·¨ ¶¤¯·¬±©²¯¬¤ª¨ ¥∏·±²·¬±©µ∏¬·q‘¤·…¬²·¨¦«±²¯ ot| }zyx p zy{
«¤±ª ‹²±ª¬¬¤o ‹²§¶²± ‘o • ¬¯¯¬¤°¶° o ετ αλqusst¥q∞±ª¬±¨ µ¨¬±ª¶¤¯·p·²¯ µ¨¤±·Βρασσιχα ³¯¤±·¶}≤«¤µ¤¦·¨µ¬½¤·¬²± ²©¼¬¨ §¯¤±§¶¨ §¨²¬¯ ∏´¤¯¬·¼¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦
³¯¤±·¶º¬·«¬±¦µ¨¤¶¨§√¤¦∏²¯¤µ¶²§¬∏° ¤¦¦∏°∏¯¤·¬²±q°‘„≥ o|{ }tu{vu p tu{vy
«¤² ƒ ±¨ª¼∏±oŠ∏² ≥«¤±¯¬o • ¤±ª  ±¨ª¯¤±o ετ αλqussv1 • ¦¨¨±·¤§√¤±¦¨¶¬± ¶·∏§¼ ²± ·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶©²µ¶¤¯··²¯ µ¨¤±¦¨ q²∏µ±¤¯ ²© °¯ ¤±·°«¼¶¬²¯²ª¼ ¤±§
²¯ ¦¨∏¯¤µ…¬²¯²ª¼ ou| }tzt p tz{
k责任编辑 徐 红l
yv 林 业 科 学 wu卷