全 文 ：第 wv卷 第 w期
u s s z年 w 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
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„³µqou s s z
一个毛白杨  „⁄≥盒基因的克隆与功能分析
樊金会t 陈 静u 李文卿v 李 青t 邹 琦u
kt1 山东农业大学林学院 泰安 uztst{ ~ u1 山东农业大学生命科学学院 泰安 uztst{ ~ v1 中国农业大学生物学院 北京 tsss|wl
摘 要 } 利用 °≤• 技术 o从毛白杨花序材料中分离出一个  „⁄≥盒基因 ΠτΣΕΠ3 ∀蛋白序列比较和同源树分析表
明 o该基因与拟南芥 ΣΕΠ3 同源 ∀表达分析显示 ΠτΣΕΠ3 不仅在成年植株雌蕊和雄蕊中表达 o也在幼茎 !幼叶和顶芽
中表达 ∀在 vx≥启动子驱动下 oΠτΣΕΠ3 超表达的毛白杨转基因植株发生了明显的形态变化 o表现为叶序不规则 o在
同一节间常数枚集生 ~并且叶片基部形态与野生型的心形不同 o大部分为楔形 ∀在离体条件下 o在芽分化培养基
上 oΠτΣΕΠ3 转基因株系的根和叶外植体可以诱导发生带有花柱和子房室的子房状结构 ∀试验结果说明 ΠτΣΕΠ3 参
与了毛白杨花器官的发生 o并可能在维持茎端分生组织分化出正常形态的叶片中也起着作用 ∀
关键词 } 毛白杨 ~花器官发育 ~  „⁄≥盒基因 ~ ΠτΣΕΠ3
中图分类号 }≥zt{1wy ~ ±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusszlsw p ssvy p sz
收稿日期 }ussy p sv p ut ∀
基金项目 }山东农业大学博士后基金资助 ∀
Ισολατιον ανδ Φυνχτιοναλ Αναλψσισ οφ α ΜΑ∆Σ Βοξ Γενειν Ποπυλυστοµεντοσα
ƒ¤±¬±«∏¬t ≤«¨ ±¬±ªu ¬• ±¨´ ¬±ªv ¬±¬±ªt ²∏±¬u
kt1 Χολλεγε οφ Φορεστρψo Σηανδονγ Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ταιπαν uztst{ ~ u1 Χολλεγε οφ Λιφε Σχιενχε o Σηανδονγ Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ταιπαν uztst{ ~
v1 Χολλεγε οφ ΒιολογιχαλΣχιενχε o Χηινα Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Βειϕινγ tsss|wl
Αβστραχτ} „ „⁄≥ ¥²¬ ª¨ ±¨ ΠτΣΕΠ3 º¤¶¬¶²¯¤·¨§©µ²° ¼²∏±ª©¨ °¤¯¨ ©¯²º¨ µ²© Ποπυλυσ τοµεντοσα ∏¶¬±ª °≤• ¶·µ¤·¨ª¼q
„¯¬ª±°¨ ±·¤±§«²°²¯²ª·µ¨¨¤±¤¯¼¶¨¶¶«²º·«¤·ΠτΣΕΠ3 ¬¶¤«²°²¯²ª²∏¶ª¨ ±¨ ²© Αραβιδοπσισ ΣΕΠ3 q ΠτΣΕΠ3 ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¦¤± ¥¨
§¨·¨¦·¨§±²·²±¯¼¬± ³¬¶·¬¯¤±§¶·¤°¨ ±o¥∏·¼²∏±ª¶«²²·o·¨µ°¬±¤¯ ¥∏§¤±§¼²∏±ª¯¨ ¤©²©¤±¤§∏¯··µ¨¨q⁄µ¬√¨ ± ¥¼ vx≥ ³µ²°²·¨µo
ΠτΣΕΠ3 ²√¨ µ2 ¬¨³µ¨¶¶¬²±¯¨ ¤§¶·²¶¨√¨ µ¨ °²µ³«²¯²ª¬¦¤¯·¨µ¤·¬²±¶¬±¯¨ ¤©³«¼¯ ²¯·¤¬¬¶¤±§¬±¯¨ ¤©©²µ°qŒ±·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶o¶¨√¨ µ¤¯
¯¨ ¤√¨ ¶∏¶∏¤¯ ¼¯¬±¬·¬¤¯ ©µ²° ²±¨ ¶·¨° ±²§¨ ¤±§¯¨ ¤©¥¤¶¨ °²¶·¤µ¨ ¦∏±¨ ¤·¨oº«¬¦«¤µ¨ ²¥√¬²∏¶¯¼ §¬©©¨µ¨±·©µ²° ¤¯·¨µ±¤·¨ ³«¼¯ ²¯·¤¬¬¶
¤±§¦²µ§¤·¨ ¯¨ ¤© ¥¤¶¨ ¬± º¬¯§·¼³¨ q ’√¤µ¼2¯¬®¨ ¶·µ∏¦·∏µ¨¶ ¤¨¦« º¬·«t ∗ u ¶·¼¯ ¶¨¤±§¤± ²√¤·¨2©²µ° º²°¥¦¤± ¥¨ ¬±§∏¦¨§¬±
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ΠτΣΕΠ3 ²√¨ µ2 ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¬¯±¨ ¶¦²°¥¬±¨ § º¬·«¬·¶ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ³¤·¨µ± ¶∏ªª¨¶·¬·³¯¤¼ µ²¯ ¶¨¬± µ¨ª∏¯¤·¬±ª©¯²µ¤¯ ²µª¤± ¬±¬·¬¤·¬²±o
³µ²¥¤¥¯¼¬± °¤¬±·¨±¤±¦¨ ²©¶«²²·°¨ µ¬¶·¨° ³µ²³¨µ·¼©²µ¦²µµ¨¦·¬±¬·¬¤·¬²± ²©±²µ°¤¯ ¯¨ ¤√¨ ¶q
Κεψ ωορδσ} Ποπυλυστοµεντοσα~©¯²µ¤¯ ²µª¤± §¨ √¨ ²¯³°¨ ±·~ „⁄≥ ¥²¬ª¨ ±¨ ~ ΠτΣΕΠ3
高等植物花发育相关分子机制的研究一直是人们感兴趣的问题 o≤²¨ ±等kt||tl在对模式植物拟南芥
kΑραβιδοπσιστηαλιαναl !矮牵牛k Πετυνια ηψβριδαl和金鱼草k Αντιρρηινυµ µαϕυσl突变体及其基因功能分析的基础
上 o提出了花器官发育的 „…≤模型 ∀经过逐步完善 o„…≤模型已发展为 „…≤⁄∞模型k׫¨¬¶¶¨±ousstl ∀目前 o
这一模型作为解释花器官发育的基本分子机制 o已得到广泛认可 ∀
当矮牵牛 ΦΛΟΡΑΛ ΒΙΝ∆ΙΝΓ ΠΡΟΤΕΙΝ 7( ΦΒΠ7)基因和 ΦΒΠ11基因组成性表达时 o转基因植株花的花被
器官上形成异域的胚珠 o因此 o它们被认为是控制胚珠发育的主要基因k≤²¯²°¥² ετ αλqot||xl ∀在拟南芥中 o
与 ΦΒΠ7 和 ΦΒΠ11 功能相似的基因为 ΣΕΕ∆ΣΤΙΧΚ( ΣΤΚΠΑΓΛ11) !ΣΗΑΤΤΕΡΠΡΟΟΦ1( ΣΗΠ1ΠΑΓΛ1)和 ΣΗΠ2
(ΑΓΛ5)kƒ¤√¤µ² ετ αλqoussvl ∀这样 o将胚珠看作花器官的第 x轮 o把上述基因视为 ⁄类基因 o从而产生了
„…≤⁄模型k≤²¯²°¥² ετ αλqot||xl ∀
最早发现的 ∞类基因是矮牵牛的 ΦΒΠ2 ,该基因反义转化和共抑制植株表现为内 3轮花器官均被花萼所
替代 o并且失去了花的有限性k„±ª¨ ±¨ ±·ετ αλqot||ul ∀随后在矮牵牛中又发现了 ΦΒΠ5和 ΦΒΠ9 ,其反义转化
和共抑制表型均与 ΦΒΠ2类似k„±ª¨ ±¨ ±·ετ αλqot||u ~t||w ~ ¤±§¨¯ ετ αλqot||{ ~ƒ¯ ¤±¤ª¤± ετ αλqot||{ ~Œ°°¬±®
ετ αλqoussul ∀在拟南芥中 oΑΓΛ2 !ΑΓΛ4 和 ΑΓΛ9 分别是 ΦΒΠ2 !ΦΒΠ5 和 ΦΒΠ9 的同源基因 , αγλ2 !αγλ4 !αγλ9
三个基因同时突变的突变体也表现为内 v轮花器官转变为花萼 o但 v个基因中任何 t个或任何 u个发生突
变 o对花器官的特异性均无明显影响k°¨ ¤¯½ ετ αλqousssl ∀ ΑΓΛ9 !ΑΓΛ4 !ΑΓΛ2分别被重命名为 ΣΕΠ1 !ΣΕΠ2和
ΣΕΠ3 o认为它们是花瓣 !雄蕊和心皮内 v轮花器官发育所必需的新一类的花器官特征基因 ∀于是 o把 ΣΕΠ
类基因确定为 ∞类基因 o„…≤⁄模型也修改为 „…≤⁄∞模型 k°¨ ¤¯½ ετ αλqousss ~׫¨¬¶¶¨±ousstl ∀
在拟南芥中 o过量表达 ΑΠ32 ΠΙ2 ΣΕΠ3 !ΑΠ12 ΠΙ2 ΣΕΠ3或 ΑΠ12 ΑΠ32 ΠΙ2 ΣΕΠ3 o叶转变成花瓣 ~过量表达 ΠΙ2
ΑΠ32 ΣΕΠ32 ΑΓ o叶转变成雄蕊 ~过量表达 ΣΕΠ32ΑΓ o叶转变为心皮k‹²±°¤ ετ αλqousstl o说明 ΣΕΠ类与 „类 !
…类和 ≤类基因共同作用可以将叶转变为花器官 ∀
杨属k Ποπυλυσl是木本植物生物学研究的重要模式植物 ∀随着对毛果杨k Πq τριχηοχαρπαl全基因组测序的
完成 o对它的分子水平的研究引起世界范围内的关注 ∀由于杨属植物为单性无被花 o其花结构不同于拟南
芥 !金鱼草等植物的花结构 o因此 o用 „…≤模型来解释杨属植物花器官的发育显然存在困难 ∀
本文以毛白杨k Πq τοµεντοσαl为材料 o分离出了一类似拟南芥 ΣΕΠ类的基因 ΠτΣΕΠ3k Ποπυλυσ τοµεντοσα
ΣΕΠ3 ¬¯®¨ l o此基因对毛白杨进行遗传转化显示它控制心皮发生 o也影响叶的发生和形态 ∀对 ΠτΣΕΠ3 基因的
序列的比较 !转基因植株表型的分析和表达模式的分析 o可以有助于理解杨树单性无被花发育的机制 ∀
t 材料与方法
111 植物材料与培养
试验所用植物材料主要取自毛白杨−易县雌株. k Πq τοµεντοσα ¦√ q− ηοπεινιχα. l ∀该品种为雌性 o具有开
花结实早的特点 ∀在表达分析中 o所用幼茎 !茎尖 !幼叶和雌蕊材料取自此品种 ts年生的同一开花期植株 o
而根则取自此品种通过组培繁殖的大田栽植苗 o为白色新根k下称幼根l ∀在表达分析中所用雄蕊取自其他
普通毛白杨植株 ∀
野生型和转基因型毛白杨的组织培养主要参考了崔 等kt|{xl的方法 ∀以 ≥为基本培养基kv h蔗糖 o
s1{ h琼脂 o³‹ x1yl o附加 s1ux °ª#pt y2…„ os1ux °ª#pt ×和 s1ux °ª#pt Œ„„作为叶圆盘的芽分化培养
基 ~附加 ts °ª#pt ∂ …t和 s1ux °ª#pt Œ…„作为芽生根培养基 ∀遗传转化所用的外植体取自维持在生根培
养基上的无菌苗 o而后取转基因毛白杨无菌苗的 t ¦°长根段作为外植体 o在芽分化培养基上培养观察其分
化变化 ∀
组织培养条件为 }温度kux ? tl ε ~光r暗培养为 ty «Π{ «~光照强度为 u sss ¬¯∀
112 ΠτΣΕΠ3基因的分离与序列分析
以从毛白杨入冬后的休眠花芽剥离的幼花序为材料 o利用 וŒ’试剂盒提取不同材料的总 • ‘„ o取
u Λª进行反转录 o合成 ¦⁄‘„的第一条链 o所用反转录酶为 2∂kפŽ¤•¤l ∀以反转录产物为模板 o用 °≤•
技术分离基因 ∀首先根据保守的蛋白序列 Œ∞‘ŽŒ‘和 ±Ž≤‘≠Š设计一对兼并引物 o≥∞°v2t和 ≥∞°x2t o获得保
守的中间片段 ∀再根据中间片段的测序结果 o设计特异引物 ≥∞°v2• o结合 ’¯ ¬ª²2§× 通用引物 …uy o通过
vχ• „≤∞ °≤•分离基因的 vχ端片段 ∀用 ×§× 对反转录产物的 ¦⁄‘„ o在 xχ端加多聚 §≤×° o再设计特异引物
≥∞°x2• o利用通用引物 „„° o进行 xχ• „≤∞ °≤• o获得基因的 xχ端片段 ∀对基因两端片段进行测序 o获得基因
的全序列 ∀最后 o在基因两端 o设计特异引物 ≥∞°2°和 ≥∞°2• o分别附加有 Βαµ ‹ ´和 Σαχ ´限制性内切酶酶
切位点 o分离含读码框的近乎全长kt ∗ t sx{ ¥³l o进行测序验证 ∀ °≤• 循环参数为 }|w ε 变性 t °¬±oxy ε
t °¬±ozu ε 延伸 t1x °¬±o运行 vx个循环 ∀
基因分离过程所用的克隆载体为 ³Š∞2× ∞¤¶¼ √¨ ¦·²µk°µ²°¨ ª¤l o大肠杆菌转化的受体菌株为 ⁄‹xΑ∀
本试验所用引物 }
≥∞°v2t }xχ2„×k„Π×ЊlŠ„k„ΠŠl„Šk×Π≤l„„k„ΠŠl„×k„Π×Π≤l„„2vχ ~
≥∞°x2t }xχ2≤„k„ΠŠl„„k„ΠŠl׊k≤Π×l„„k×Π≤lׄk×Π≤lŠŠ2vχ ~
≥∞°v2• }xχ2Š„„Š„„„Š≤≤ׄ׊„Š≤2vχ ~
≥∞°x2• }xχ2ׄ≤„Š≤×××≤≤×≤ׄ××2vχ ~
≥∞°2° }xχ2„„ŠŠ„×≤≤„××≤Š≤Š„Š„Š≤≤„׊Š2vχ k Βαµ ‹ ´l ~
≥∞°2• }xχ2„„Š„Š≤×≤Š≤׊Š„Š×„×≤×ׄ׊Š×2vχkσαχ´l ~
…uy }xχ2Š„≤×≤Š„Š×≤Š„≤„×≤Š„××××××××××××××××2vχ ~
„„° }xχ2ŠŠ≤≤„≤Š≤Š×≤Š„≤ׄŠ×„≤ŠŠŠŒŒŠŠŠŒŒŠŠŠŒŒŠ2vχ ~
zv 第 w期 樊金会等 }一个毛白杨  „⁄≥盒基因的克隆与功能分析
˜…Œƒ }xχ2≤„„„≤≤≤×≤≤×≤≤×≤≤×≤≤2vχ ~
˜…Œ• }xχ2××≤„≤Š„„≤×≤׊≤Š„×׊2vχ ∀
用 ‘≤…Œ …„≥×和 ⁄‘„°¤± w1s软件进行基因有关的序列分析 ∀
113 毛白杨的遗传转化
根据质粒载体和外源基因所携带的酶切位点k Βαµ ‹ ´和 Σαχ ´l o将经限制性内切酶 Βαµ ‹ ´和 Σαχ ´
酶切后的片段插入载体 ³…Œtut o载体构建过程见图 t ∀
图 t ΠτΣΕΠ3 表达载体构建示意图
ƒ¬ªqt ≤²±¶·µ∏¦·¬²± ²© ΠτΣΕΠ3 ¬¨³µ¨¶¶¬±ª√¨ ¦·²µ
用冻融法将表达载体转入农杆菌
kΑγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσlŠ∂vtst o转化毛白
杨 ∀毛白杨遗传转化采用王善平等kt||sl的
叶圆盘方法 ∀叶圆盘在芽分化培养基上预
培养 u §后 o再与 x ≅ ts{ ¦¨¯¯#°pt浓度的农
杆菌菌液共培养 u §o接种于附加 xs °ª#pt
卡那霉素kŽ°l和 xss °ª#pt头胞塞亏那
k≤ ©¨l的筛选培养基上 o获得抗性芽 ∀然后将
抗性芽转至 ≥ 附加 xs °ª#pt Ž°和 xss
°ª#pt ≤ ©¨的生根培养基上 o获得抗性植株 ∀
组织培养条件同在 t1t中所述 ∀
遗传转化植株和野生型对照植株用拟
南芥培养介质k营养土 !蛭石和沙按 tΒtΒt的
体积混合l盆栽 o定期浸 tΠ{ ≥培养基矿质
液体 ∀栽培温室环境 }温度 t{ ∗ u{ ε o光照
强度至少 u sss ¬¯o光期Π暗期为 ty «Π{ «∀
114 基因表达的 ΡΤ2ΠΧΡ 分析
以毛白杨植株的叶片 !幼茎 !幼根 !雌蕊
和雄蕊 o以及转基因系再生芽体在生根培养
基上所发生的根为材料提取总 • ‘„ ∀取 t Λª的总 • ‘„用 us ˏ的 2∂kפŽ¤•¤l酶反应体系反转录合成
¦⁄‘„的第一条链 ∀在加入反转录酶前 o先加入 t ˏ不含 • „‘酶的 ⁄‘¤¶¨ „kt ∏±¬·#ˏpt oŒ±√¬·µ²ª¨±l o在vz ε
反应 vs °¬±o去除基因组 ⁄‘„ ∀采用目的基因特异引物 ≥∞°2°和 ≥∞°2• 进行 °≤• 扩增 ∀以泛素载体蛋白基
因 ˜…Œk„≠yyszxsl序列设计引物 ˜…ŒƒΠ˜…Œ• o • ×2°≤• 扩增产物作为总 • ‘„模板定量的内标 ∀ • ×2°≤• 反应
条件为 }|w ε 预变性 v °¬±~循环参数为 |w ε 变性 t °¬±ox{ ε 退火 t °¬±ozu ε 延伸 ts °¬±o运行 vs个循环
后 ozu ε 延伸 ts °¬±o而 ˜…Œ±˜Œ×Œ‘的 °≤• 反应为 ux个循环 ∀ °≤• 产物电泳用溴化乙锭显色 ∀ ˜…Œ±˜Œ×Œ‘
的扩增产物连接于 ³Š∞2× ∞¤¶¼ √¨ ¦·²µ进行测序验证 ∀
115 切片制作
所显示切片为常规石蜡切片 ∀培养的子房状结构材料固定于 ƒ„„中 ∀固定后的材料经脱水 !透明 !透
蜡 !包埋后进行切片 ∀切片厚度为 ts ∗ tu Λ° o切片后进行脱蜡 !复水 o再用番红 p固绿对染 ∀经再脱水 !透
明等处理 o最后以加拿大树胶封固 ∀封片后用 ’≠ °˜≥ …‹2u型显微镜观察 o拍照 ∀
u 结果与分析
211 ΠτΣΕΠ3基因序列的分析
用以上方法获得了长度为 t tsz ¥³的 ¦⁄‘„ o命名为 ΠτΣΕΠ3 o并在 Š¨ ±…¤±®中登记 k序列号为
⁄±wwxs|wl ∀该基因具有一个 zu| ¥³的完整的读码框 o用 ‘≤…Œ …„≥× 工具推测出的蛋白序列显示 ΠτΣΕΠ3
为一 „⁄≥盒基因 ∀ ΠτΣΕΠ3所编码的蛋白含有 uwv个氨基酸残基 ∀由于 °·≥∞°v氨基酸序列与拟南芥  „⁄≥
盒基因 „ŠyΠ≥∞°分支同源性最高 o把 °·≥∞°v蛋白与拟南芥 „ŠyΠ≥∞°分支的 „⁄≥盒蛋白比较k图 ul o结果
显示 °·≥∞°v与这一分支的蛋白序列高度同源 o其中与 ≥∞°v相同性最高 o同源性为 zy h ∀它们的蛋白序列在
„⁄≥盒区kt ∗ xy氨基酸残基l同源性高达 |x h o而在其他区段保守性较差 ∀
{v 林 业 科 学 wv卷
图 u °·≥∞°v与拟南芥 ≥∞°类和 „ŠyΠ„Štv族蛋白序列之间的比较
ƒ¬ªqu „ ¬¯ª±°¨ ±·¤°²±ª°·≥∞°v ³µ²·¨¬± º¬·« Αραβιδοπσισ ≥∞° ¦¯¤§¨ ¤±§„ŠyΠ„Štv ¦¯¤§¨
序列比较所涉及的拟南芥  „⁄≥ 盒基因包括 } ΣΕΠ1 k „·xªtx{ssl ! ΑΓΛ3
k„·uªsvztsl !ΣΕΠ2 k„·vªsuvtsl !ΣΕΠ3 k„·tªuwuysl和 ΑΓΛ6 k„·uªwxyxsl ∀图中加
黑部分为高度相似的氨基酸残基 ∀  „⁄≥2¥²¬ ª¨ ±¨ ¶²© Αραβιδοπσισ ¤¶¶²¦¬¤·¨§¤¥²√¨
¤±¤¯¼¶¨¶¤µ¨ ¤¶©²¯ ²¯º¬±ªo ΣΕΠ1 k„·xªtx{ssl o ΑΓΛ3 k„·uªsvztsl o ΣΕΠ2 k„·vªsuvtsl o
ΣΕΠ3 k„·tªuwuysl ¤±§ ΑΓΛ6 k„·uªwxyxsl q׫¨ ¥²¯§ º²µ§¶¤µ¨ ·«¨ ¤°¬±² ¤¦¬§µ¨¶¬§∏¨¶
º¬·«·«¨ «¬ª«¨¶·¬§¨±·¬·¼q
用 ⁄‘„°¤± w1s软件对 °·≥∞°v与拟南
芥 „ŠyΠ≥∞°分支的 „⁄≥盒基因的氨基
酸序列进行同源分析k图 vl o所产生的同源
树显示 o在蛋白水平上 °·≥∞°v与 ≥∞°v最
为相似 ∀因此 o从序列上 o初步可以判断
ΠτΣΕΠ3为 ΣΕΠ3的同源基因 ∀
212 ΠτΣΕΠ3转基因植株的形态
在 vx≥启动子的驱动下 o用叶圆盘法
转化 ΠτΣΕΠ3 o获得了毛白杨的转基因植
株 ∀温室条件下栽培的 t年生转基因植株
生长正常 o没有开花 ∀在形态上出现显著
变化 o一是叶序变得十分混乱 o常常 v ∗ w
枚叶片集生于同一节 o同时存在一节部着
生 t枚叶片k图版 ´ p tl ~二是转基因植株
的大部分叶片的叶基为楔形k图版 ´ p wl ∀
在同一植株上 o同时也生长心形叶基的叶
片 o可能是转基因植株为嵌合体的缘故 ∀
野生型植株的叶为心形叶基 o互生叶序k图
版 ´ p u oxl ∀由于 ΠτΣΕΠ3 在地上部分的
营养器官中表达 o因此 o初步认为在茎顶端
分生组织中 oΠτΣΕΠ3 在决定叶原基发生和
叶片形态方面起着重要作用 ∀这在对拟南
芥的相关研究中是没有出现的现象 ∀
213 在离体条件下 ΠτΣΕΠ3超表达植株的
外植体可诱导发生子房状结构
°≤• 检测结果表明 o抗性植株为超表
达 ΠτΣΕΠ3转基因植株 ∀在筛选培养基上 o
叶外植体可以产生抗性芽 o同时也可以直
接产生子房状结构 ∀转基因芽或转基因植
株k无菌苗l的叶外植体在芽分化培养基
上 o能够分化出大量的子房状结构体 o具有
t ∗ u枚明显的柱头状结构 ∀这些子房结构
的外部形态与野生型的子房相似 o但没有
花苞片和花盘的形态结构k图版 ´ p u ov o
y o{l ∀野生型叶外植体只能够产生营养
芽 ∀ ΠτΣΕΠ3 转基因植株的根在分化培养
基上 o也可以分化出子房状结构体k图版 ´
p |l o而野生型根外植体在芽分化培养基上 o在 v个月试验期内不能够进行器官的分化 ∀子房状结构的石蜡
切片显示在其中下部有一团排列紧密 !体积小 !内含物丰富的细胞组成的卵形子房室状轮廓 o相对应外围细
胞则排列较松散 !体积较大 !内含物较少k图版 ´ p zl ∀没有观察到其他子房形态特征结构 o如胚珠 ∀由此 o
在离体条件下 vx≥ ϑ ΠτΣΕΠ3诱发了子房结构 ∀
214 ΠτΣΕΠ3的表达模式
ΠτΣΕΠ3在毛白杨花器官和营养器官均可表达 ∀ • ×2°≤• 分析结果k图 wl显示 o像预期的一样 oΠτΣΕΠ3 在
雌蕊和雄蕊中表达 o在开花植株的营养器官的幼叶和幼茎中 o以及顶芽中也表达 o但在根中未能检测到其表
达 ∀ ΠτΣΕΠ3的 °• ‘„则出现在抗性植株的根中 o说明抗性植株为有 ΠτΣΕΠ3 °• ‘„转录的转化植株 ∀因此 o
|v 第 w期 樊金会等 }一个毛白杨  „⁄≥盒基因的克隆与功能分析
图 v 毛白杨 ΠτΣΕΠ3 基因的蛋白序列的同源树分析
ƒ¬ªqv ‹²°²¯²ª¼·µ¨¨¤±¤¯¼¶¨¶²© Ποπυλυστοµεντοσα ΠτΣΕΠ3 ª¨ ±¨
°·≥∞°v与拟南芥 ≥∞°类 和 „ŠyΠ„Štv族蛋白序列的同源树
分析 ∀有关的拟南芥  „⁄≥2¥²¬基因同图 u ∀ ‹²°²¯²ª¼·µ¨¨º¤¶
³µ²§∏¦¨§¤°²±ª °·≥∞°v o Αραβιδοπσισ ≥∞° ¦¯¤§¨ ¤±§ „ŠyΠ„Štv
¦¯¤§¨ ª¨ ±¨ ³µ²·¨¬±¶q  „⁄≥2¥²¬ª¨ ±¨ ¶²© Αραβιδοπσι󬱷«¬¶©¬ª∏µ¨ ¤µ¨
¤¦¦²µ§¬±ªº¬·«ª¨ ±¨ ¶¬±·«¨ ƒ¬ªqu1
根据拟南芥 ΣΕΠ3 的功能特点 oΠτΣΕΠ3 在花器官中起着
重要作用 ∀在叶的发育中可能也具有其功能 o或者由于
ΠτΣΕΠ3的过量表达干扰了叶片的发育和叶片形态 ∀
v 讨论
木本植物生命周期长 o研究其花器官发育有很大的
困难 o杨属植物作为木本植物生物学研究的模式植物 o也
不例外 o研究资料较少 ∀与花器官发育研究的模式植物
比较 o杨属的单性无被花具有其特殊的结构特点 o开展对
其花器官形成的研究有很大意义 ∀为了解  „⁄≥盒基因
在杨树花器官发育中的功能 o因此分离出 ΠτΣΕΠ3 o从基因
的蛋白序列比较结果上可以判断其与拟南芥 ΣΕΠ类基因
同源 ∀由于拟南芥 ΣΕΠ类基因属于 „⁄≥盒基因家族 o
其进一步的归类主要是基于 ≤ 区的序列特征和它们的功
能k¬·¤ ετ αλqoussvl ∀ ΠτΣΕΠ3与拟南芥 ΣΕΠ类基因的蛋
白序列之间存在一定的差异 o反映出在不同的植物种类
中 oΣΕΠ类基因的分化 o可能它们的功能也存在着差异 ∀
从功能上来看 o毛白杨 ΠτΣΕΠ3 基因与拟南芥 ΣΕΠ类
图 w ΠτΣΕΠ3 表达的 • ×2°≤• 检测
ƒ¬ªqw ΠτΣΕΠ3 ¬¨³µ¨¶¶¬²± ³¤·¨µ± §¨·¨¦·¨§¥¼ • ×2°≤•
上部电泳图 t ∗ y 泳道的 °≤• 产物 o其所用的反转录模板
°• ‘„分别来自于野生型植株的根 !幼茎 !茎尖 !幼叶 !雄蕊和
雌蕊 o第 z 泳道则来自转基因植株的根 ∀下部电泳图为
ΥΒΙΘΥΙΤΙΝ °≤• 扩增产物对照 ∀用溴化乙锭显色 °≤• 产物 ∀
 为 ¤µ®¨µ ⁄usss ∀ ׫¨ ∏³³¨µ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨ªµ¤° ¶«²º¶ °≤•
³µ²§∏¦·¶²©t¶·∗ y·« ¤¯±¨ ©µ²°·¨°³¯¤·¨ °• ‘„ ²©µ²²·o¼²∏±ª¶·¨° o
¼²∏±ª ¯¨ ¤©o ·¨µ°¬±¤¯ ¥∏§o ¶·¤° ±¨ o ³¬¶·¬¯ °¤·¨µ¬¤¯¶ ²© º¬¯§ ·¼³¨
µ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼ o¤±§·«¨ z·« ¤¯±¨ ©µ²°µ²²·°¤·¨µ¬¤¯ ²©·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶q
׫¨ ¥¨ ²¯º ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨ªµ¤° ¶«²º¶ °≤• ³µ²§∏¦·¶ ²© ΥΒΙΘΥΙΤΙΝ
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至少是二者都在心皮发育中起作用 ∀根据 „…≤⁄∞模型 o
拟南芥雌蕊发育是由 ≤ 类和 ∞类基因共同决定的 o单独
的 ≤类基因 ΑΓ超表达出现花萼转化为心皮结构 o花瓣转
化为雄蕊状结构k¬½∏®¤°¬ετ αλqot||ul ∀在拟南芥中 o单
独过量表达 ΣΕΠ类基因出现植株开花提前 o而花结构没
有发生变化k×½¨ ±ª ετ αλqoussvl ~ ΣΕΠ3与 ΑΓ同时超表达
植株 o叶转变为心皮k‹²±°¤ ετ αλqousstl o由于 ΣΕΠ类基
因在四轮花器官原基和花分生组织中均有表达 o因此 o它
们既为花器官特征基因 o又在花分生组织特性决定中起
作用 ∀ ΠτΣΕΠ3转基因型在调控花器官的发育方面所展示
的功能与拟南芥 ΣΕΠ类功能是一致的 ∀其一 o超表达
ΠτΣΕΠ3使得本应该分化为芽的营养顶端分生组织可能具
有了心皮原基的性质 o而形成了子房 ∀在拟南芥花器官
发育决定中 o有关的  „⁄≥盒蛋白是通过同源或异源聚
合体来决定花器官分生组织特性的k‹²±°¤ ετ αλqousst ~
ƒ¤√¤µ² ετ αλqoussv ~ƒ¤± ετ αλqot||zl ∀心皮原基则是由具
有 ∞类基因功能的 ΣΕΠ类和具有 ≤类基因功能的 ΑΓ类
共同决定的 ∀毛白杨离体发生的子房可能也需要有 ΑΓ
类相应功能的基因的参与 ∀在拟南芥中 o最新的研究证
明 oΣΕΠ类可以激活 ΑΓ类基因的表达k≤¤¶·¬¯¯ ­¨² ετ αλqo
ussxl o在毛白杨中也可能存在这样的机制 ∀在毛果杨中 o
ΑΓ有 u个成员 ΠΤΑΓ1 和 ΠΤΑΓ2 ,在营养器官中具有一定
水平的表达k…µ∏±±¨ µετ αλqousssl ∀因此 oΠτΣΕΠ3 可能与
毛白杨的 ΑΓ类基因共同作用 o在离体条件下促进子房的形成 ∀其二 o由于杨树的花为单性无被花 o对于雌
花来说 o一个雌蕊也可能是一朵完整的雌花 ∀转基因型形成的子房状结构应当是由营养顶端转化而来的 o似
乎是 ΠτΣΕΠ3在顶端分生组织的特性决定中起着关键作用 ∀以上的 u种情况可能同时存在 ∀
在温室条件下生长的 t年生 ΠτΣΕΠ3的转基因毛白杨植株没有开花 ∀ ΣΕΠ3超表达植株在发生 t ∗ v枚
sw 林 业 科 学 wv卷
真叶后即开花 o在调节开花时间方面与拟南芥有所不同 ∀许多研究都说明在不同种类中的 ΣΕΠ类同源基因
具有不同的功能 ∀例如 o非洲菊k Γερβερα ηψβριδαl的一个 ΣΕΠ类同源基因 ΓΡΧ∆1 o反义表达的转基因植株的
雌花的不育雄蕊转化成了花瓣 kŽ²·¬¯¤¬±¨ ± ετ αλqousssl ∀水稻k Ορψζα σατιϖαl的 v个 ΣΕΠ类基因 ΟσΜΑ∆Σ5 !
ΟσΜΑ∆Σ7和 ΟσΜΑ∆Σ8控制开花时间kŽ¤±ª ετ αλqot||z¤~t||z¥l ∀抑制番茄k Λψχοπερσιχον εσχυλεντυµl的 ΣΕΠ3
同源基因 ΤΜ5的表达的转基因植株 o每轮花器官数目都发生了变化 o并且增加了一轮花器官 ~花瓣绿色 o雄
蕊和雌蕊不育k°±¨ ∏¯¬ετ αλqot||wl ∀ ΠτΣΕΠ3与拟南芥 ΣΕΠ3在表达的时空模式和功能上也存在差异 o再加上
杨树与拟南芥的花结构差距很大 o因此 o用 „…≤模型来解释杨树花器官发育还需更多的试验证据 ∀
叶片起源于茎顶端分生组织 ∀近年的研究结果显示叶片发生的数量是由生长素诱导的 o叶序也是由生
长素在茎顶端分生组织的不同细胞之间的运输决定的 ∀在  „⁄≥盒基因家族内 o影响叶片发生的因子还很
少报道 o一拟南芥 „⁄≥盒基因 ΚΝ1通过促进细胞分裂素的合成影响叶片形态k¬±¦²¯± ετ αλqot||w ~•∏³³ ετ
αλqot|||l ∀从毛白杨 ΠτΣΕΠ3转基因植株的叶片形态和叶序所发生的变化来看 oΠτΣΕΠ3 不但在开花器官分
生组织或花分生组织中起作用 o在营养顶端特性保持中可能也起一定的作用 o并进一步影响叶片的形态 ∀
在基因表达上 oΠτΣΕΠ3在雌蕊和雄蕊中表达 o也在除了根以外的营养器官中表达 o还在营养芽中表达 ∀
拟南芥 ΣΕΠ类基因在花分生组织中表达 o在四轮花器官以及胚珠中均表达 o但在营养器官不表达 o结合其在
拟南芥花发育中的功能 o认为它们均为花器官特异基因 o并确定花原基的有限性 ∀ ΠτΣΕΠ3 的表达模式与拟
南芥 ΣΕΠ类明显不同 ∀在美洲山杨k Πqτρεµυλοιδεσl中 o存在 ΠΤΜ3 ! ΠΤΜ4和 ΠΤΜ6三个 ΣΕΠ类的同源基因 o
其中的 ΠΤΜ3和 ΠΤΜ4除了在花分生组织和花器官表达外 o也在芽 !幼叶和幼茎中表达k≤¶¨®¨ ετ αλqoussxl o
这与 ΠτΣΕΠ3的表达模式是一致的 ∀
根据 ΠτΣΕΠ3基因的序列 !转基因表型和表达模式 o以及与拟南芥 ΣΕΠ类的比较 o可以初步得出 o毛白杨
ΠτΣΕΠ3在花分生组织中控制花器官的特性 o在营养顶端分生组织中起作用从而影响叶片的形态发生 ∀
参 考 文 献
崔 o桂跃林 qt|{x q经济植物的组织培养与快速繁殖 q北京 }农业出版社 ot|x p t||
王善平 o许智宏 o卫志明 qt||s q毛白杨叶外植体的遗传转化 q植物学报 ovukvl }tzu p tzz
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k责任编辑 徐 红l
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