全 文 ：第 wt卷 第 v期
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林 业 科 学
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°Œr甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用 3
杨 莉 徐昌杰 陈昆松
k浙江大学园艺系 农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室 杭州 vtssu|l
摘 要 } 介绍了一种可在植物转基因中应用的新型筛选方法 ) ) ) 磷酸甘露糖异构酶k°Œl法 o与传统筛选体系
不同 o它以甘露糖为筛选剂对转化细胞进行正筛选 ∀ °Œ能将甘露糖 p y p磷酸转化成果糖 p y p磷酸 o使转化细胞
以甘露糖为唯一或主要碳源而正常生长 ~非转化细胞由于不能利用甘露糖而停止生长 ∀该筛选体系受基因型 !培
养基中其他糖和磷酸根离子浓度及培养条件等因素的影响 ∀目前已应用于多种模式植物和经济作物的转基因筛
选 o在木本植物甜橙上也首获成功 ∀其检测方法多样 o除了常规转基因检测方法外 o还可对酶活性进行检测 o其中
氯酚红法简单可靠 o且无需昂贵试剂 ∀安全评估结果表明 °Œ基因对人体健康和环境无害 ∀ °Œr甘露糖筛选体系
有望成为植物转基因的又一有效筛选手段 ∀
关键词 } 磷酸甘露糖异构酶k°Œl基因 ~甘露糖 ~植物 ~转基因
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlsv p stvz p sx
收稿日期 }ussv p tu p s| ∀
基金项目 }国家重点基础研究发展规划k|zvl项目kŠusssswy{syl o国家自然科学基金kvstsstuxl和浙江省自然科学基金kvstu|t o⁄ssswl资
助 ∀
3 陈昆松为通讯作者 ∀
Αππλιχατιον οφ ΠΜΙrΜαννοσε Σελεχτιϖε Σψστεµ ιν Πλαντ Γενετιχ Τρανσφορµατιον
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k ∆επαρτµεντ οφ Ηορτιχυλτυρε oΖηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ Τηε Στατε Αγριχυλτυρε ΜινιστρψΛαβορατορψοφ
Ηορτιχυλτυραλ Πλαντ Γροωτηo∆εϖελοπµεντ & Βιοτεχηνολογψ Ηανγζηουvtssu|l
Αβστραχτ} „ ±²√¨ ¯ ¶¨¯¨ ¦·¬√¨ ¶¼¶·¨° ¬§¨¤¯ ©²µ ³¯¤±··µ¤±¶©²µ°¤·¬²± º¤¶¬±·µ²§∏¦¨§q ׫¨ ¶¼¶·¨° ∏¶¨¶ Εσχηεριχηια χολι
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Κεψ ωορδσ} ³«²¶³«²°¤±±²¶¨ ¬¶²°¨ µ¤¶¨k°Œl ª¨ ±¨ ~°¤±±²¶¨ ~³¯¤±·~ª¨ ±¨·¬¦·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±
t|{v年首例转基因作物的问世为人们提供了一种新的育种方法 o可将有益基因转入植物而不会改变原
有品种的优良性状 ∀抗生素或除草剂筛选是植物转基因的常规步骤 ∀但是 o抗生素或除草剂等药物对植株
转化有较大影响 o会影响转化细胞的生长及再生 o并抑制不定根再生k刘凡等 ot||vl ~其次 o标记基因的安全
性从一开始就受到了广泛争论 ∀人们担心在转基因作物的商品化种植过程中 o其中的除草剂抗性基因可能
经自然杂交 o而抗生素基因可能通过转染肠道细菌 o从而造成自然界的非转基因作物对除草剂 !人类对抗生
素产生抗性k⁄¤¯¨ot||| ~Ž∏¬³¨µετ αλqousstl ∀虽然也有不少手段可以去除转基因植物中的标记基因k≥¦∏∏ ετ
αλqoussul o但大多效率不高 o或者需要进行子代杂交 o这对木本植物来说不是十分现实 ∀针对抗性筛选对转
化及再生的不利影响 o人们试图不采用抗性筛选而直接根据报告基因的表达获取再生植株 o但也存在转化效
率低 !转基因沉默等问题k⁄²°¬±ª∏¨½ ετ αλqoussul o因而应用不是十分广泛 ∀
近年来 o人们开始采用一种新型的正筛选方法 ) ) ) 甘露糖筛选体系 ∀该体系以大肠杆菌磷酸甘露糖异
构酶k³«²¶³«²°¤±±²¶¨ ¬¶²°¨ µ¤¶¨ o°Œl基因为标记基因 o甘露糖为筛选剂进行筛选 ∀目前 o°Œr甘露糖筛选体
系已成功用于甜菜k Βετα ϖυλγαρισlk²¨µ¶¥² ετ αλqot||{ ~usssl !拟南芥kΑραβιδοπσιστηαλιαναlkײ§§ ετ αλqousstl !
玉米k Ζεα µαψσlk‘¨ªµ²·² ετ αλqousss ~• ¤±ª ετ αλqousss ~• µ¬ª«·ετ αλqousstl !小麦k Τριτιχυµ αεστιϖυµlk •µ¬ª«·ετ
αλqousstl !水稻k Ορψζα σατιϖαlk∏¦¦¤ ετ αλqousstl !木薯k Μανιηοτ εσχυλενταlk«¤±ª ετ αλqousss¤~usss¥l等植
物 ~在木本植物甜橙k Χιτρυσσινενσισlk…²¶¦¤µ¬²¯ ετ αλqoussvl和葡萄kςιτισϖινιφεραlk• ∏¨¶·¯¨ ετ αλqoussvl等上也有
报道 ∀本文主要就 °Œ基因的作用及原理 !影响因素 !在木本植物转基因中的应用 !检测方法和安全评估等
方面对 °Œr甘露糖筛选体系进行介绍 ∀
t °Œ基因的作用及原理
自然界中的植物大都没有 °Œ基因≈肉桂k Χινναµοµυµ χασσιαl和一些豆类除外 k¨¨ ετ αλqot|{wl o但它
在植物以外的生物界却广泛存在 o人们已从细菌 !酵母 !动物及人体中都分离到该基因 o并获得纯化蛋白 ∀如
图 t所示 o在上述生物以及 °Œ转基因植物中 o甘露糖经己糖激酶磷酸化生成的甘露糖 p y p磷酸 o在 °Œ的
异构作用下生成果糖 p y p磷酸 o果糖 p y p磷酸再进入糖酵解途径k• ¨¨§ ετ αλqousstl ∀
图 t 磷酸甘露糖异构酶k°Œl基因转化植株中甘露糖 !葡萄糖和果糖代谢
ƒ¬ªqt  ·¨¤¥²¯¬¶° ²© °¤±±²¶¨ oª¯∏¦²¶¨ ¤±§©µ∏¦·²¶¨ ¬±·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶«¤µ¥²µ¬±ª
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°Œ}°«²¶³«²°¤±±²¶¨ ¬¶²° µ¨¤¶¨ ~°ƒŽ}°«²¶³«²©µ∏¦·²¶¨ ®¬±¤¶¨ q
在甘露糖筛选培养基上 o转
化与未转化植物细胞中的己糖
激酶均能不断将甘露糖转变成
为甘露糖 p y p 磷酸 o但只有在
转化细胞中 °Œ的进一步催化
下才能转化成果糖 p y p 磷酸 o
继而进入糖酵解途径而被细胞
利用 o因此转基因细胞可以利用
甘露糖作为碳源而正常生长和
再生 ~而非转化细胞由于没有
°Œ基因 o不能将甘露糖 p y p磷
酸转化成果糖 p y p 磷酸 o因而
不能利用甘露糖作为碳源 o且造
成体内甘露糖 p y p 磷酸的积
累 o抑制糖酵解k• ¨¨§ ετ αλqousstl o并导致 „×°新陈代谢受阻和磷酸根离子的大量消耗 o从而生长受到抑制
k²¨µ¶¥² ετ αλqot|||l ∀该选择体系与抗生素或除草剂筛选体系的区别在于抗生素和除草剂直接/杀死0未转
化植物细胞 o而甘露糖选择体系中的未转化细胞尽管处于/碳饥饿0状态 o但不会立即死亡 ∀在该筛选体系
中 o转化细胞的生长和再生过程可以利用筛选剂甘露糖 o因而被称为正筛选 ∀
u 影响甘露糖筛选体系转化效率的因素
甘露糖筛选体系转化效率高于卡那霉素选择体系k∏¦¦¤ ετ αλqousstl o在金柑k Φορτυνελλα χρασσιφολιαl上的
试验也获得同样结果 ∀但是 o由于该体系依赖甘露糖 p y p磷酸这一不参与代谢且对植物生长有毒害作用的
己糖的积累以及 „×°和磷酸根离子的无效消耗而实现筛选作用 o从而容易受培养基或外植体内其他糖类水
平等生理因素的干扰 o导致甘露糖筛选的敏感性降低 ∀²¨µ¶¥²等kt|||l研究发现选择培养基中碳源的性质
和浓度以及磷酸根离子浓度成为制约转化效率的关键因子 o而基因型和光密度等对筛选体系的影响较小 ∀
211 葡萄糖等糖对甘露糖筛选体系的影响
在甘露糖筛选体系中 o当葡萄糖的浓度高出甘露糖浓度 tx ∗ ux倍时 o就可以完全拮抗甘露糖对甜菜细
胞生长的毒害作用k²¨µ¶¥² ετ αλqot|||l ∀果糖也会削弱甘露糖的致毒能力 o但不如葡萄糖有效 o这可能是因
为葡萄糖和甘露糖都是经己糖激酶磷酸化 o而果糖却是由果糖激酶催化磷酸化 o因而果糖不能有效地阻止己
糖激酶与甘露糖结合并催化转化 ∀麦芽糖对解除甘露糖毒害作用的能力与果糖相近 o而蔗糖的效应弱于葡
{vt 林 业 科 学 wt卷
萄糖 o但强于果糖及麦芽糖k²¨µ¶¥² ετ αλqot|||l ∀
果糖 !葡萄糖 !蔗糖和麦芽糖对甘露糖筛选体系中甜菜转化效率的影响十分明显k²¨µ¶¥² ετ αλqot|||l ∀
w种糖的加入均可提高转化效率 o其中加入适量蔗糖可使转化效率提高 ts倍以上 o麦芽糖的效应次之 o再次
是葡萄糖和果糖 ∀然而 o…²¶¦¤µ¬²¯ 等kussvl以甜橙为试材研究发现 }在只以甘露糖为碳源的培养基上即可获
得较高的转化率 o加入适量蔗糖虽可提高部分品种的转化率 o但幅度并不是很大k仅约 vs h l ∀在甘露糖筛
选培养基中加入其他己糖或蔗糖对于筛选效率有不利影响 o这在甜菜k²¨µ¶¥² ετ αλqot|||l和甜橙k…²¶¦¤µ¬²¯
ετ αλqoussvl上表现一致 ∀²¨µ¶¥²等kt|||l认为 o甘露糖筛选体系的转化效率主要取决于选择压力的大小 o
并建议在选择初期 o加入的选择压要能保证 us h ∗ vs h的外植体能够再生芽 ∀
212 磷酸根离子浓度对转化体系的影响
甘露糖与磷酸根离子的相互作用被认为是甘露糖产生致毒作用的机制之一 ∀²¨µ¶¥²等kt|||l报道高浓
度的磷酸根离子能够减轻甘露糖对甜菜细胞的致毒力 o培养基中磷酸根离子浓度与转化率呈显著正相关 o这
可能是由于植物细胞快速吸收甘露糖 o在己糖激酶的作用下短时间积累大量甘露糖 p y p磷酸并消耗大量
„×°∀因此 o°Œ转基因细胞或芽即使能够将甘露糖 p y p磷酸转化成果糖 p y p磷酸 o仍有可能发生不同程
度的磷酸根离子缺乏 ∀适度磷酸根离子缺乏会引起植物组织产生一系列的应激反应 ∀ ¤¯¥²²¥¬等kt||zl发
现磷酸根离子不足会诱导拟南芥组织产生 Βp葡萄糖苷酶 o而 Βp葡萄糖苷酶能够水解处于非活化状态的细
胞分裂素糖苷从而促进生长 ∀那么 o如果 °Œ转化植株中磷酸根离子不足 o转化细胞或组织也可能诱导产
生 Βp葡萄糖苷酶 o从而刺激生长和再生 o这可能就是甘露糖筛选体系的转化率和再生率高出卡那霉素等抗
生素筛选体系许多倍的原因k²¨µ¶¥² ετ αλqot||{l ∀
213 其他因素对转化效率的影响
众所周知 o光照条件也会影响植物细胞中碳水化合物和 „×°的水平 ∀²¨µ¶¥²等kt|||l研究发现 o提高光
照强度可以减轻甘露糖对植物生长的抑制 ~但同时也发现不管培养基中是否添加甘露糖 o提高光照强度都可
促进植物生长 o并提高转化率 t1z倍 ∀这说明光照条件与甘露糖的致毒能力之间没有必然的相关性 ∀
基因型对转化效率也有影响 ∀²¨µ¶¥²等kt|||l认为他们建立的甘露糖筛选体系可适用于非常广泛的甜
菜基因型 o但根据 …²¶¦¤µ¬²¯ 等kussvl对不同甜橙品种的试验表明 o不同基因型之间甘露糖的使用浓度也应作
相应的调整 ∀
v 甘露糖筛选体系在木本植物转基因中的应用
以大肠杆菌 °Œ为筛选基因 o甘露糖为筛选剂的植物转基因筛选体系最早由 ²¨µ¶¥²小组用于甜菜转基
因 o并于 t||{年报道了首例 °Œ转基因甜菜k²¨µ¶¥² ετ αλqot||{l o随后对影响转化效率的因素作了大量的研
究k²¨µ¶¥² ετ αλqousss ~ײ§§ ετ αλqousstl ∀虽然 °Œr甘露糖筛选体系研究历史较短 o仅有部分植物采用了该
体系 o但有由模式植物向经济作物发展的趋势 ∀对一些难生根的作物 o尤其是木本植物 o采用传统的抗生素
或除草剂等筛选方法获得的转基因芽再生根相当困难 o而甘露糖筛选对转基因芽生根能力的抑制要轻得多
k…²¶¦¤µ¬²¯ ετ αλqoussvl ∀
近来 o巴西的 …²¶¦¤µ¬²¯ 等kussvl用带有 °Œ基因的农杆菌 ∞‹„tst盛染 °¨ µ¤!∂¤¯ ±¨¦¬¤!‘¤·¤¯ 和 ‹¤°¯¬± w
种甜橙实生苗上胚轴 o以 zv !zv !{w1u及 ttu1v °°²¯#pt甘露糖为碳源和筛选剂 o在 tyr{ «光r暗培养条件下
直接再生芽 o其转化率在 v h ∗ uv1{ h之间 o表明 °Œr甘露糖筛选体系十分有效 ∀然而 o• ∏¨¶·¯¨ 等kussvl研
究表明甘露糖筛选体系在葡萄转基因上效果不是很理想 o非转基因抗性芽比例很高 o转基因愈伤组织也多为
嵌合体 ∀这可能与他们未能调整好最佳的甘露糖和蔗糖比例有关 ∀
笔者在金柑上的研究表明 o当培养基中加入 z1| ª#pt甘露糖和 tx ª#pt蔗糖k二者等摩尔浓度l作为筛
选剂时 o平均每个上胚轴外植体约再生出 u个不定芽 o比卡那霉素筛选时约高出 tss倍 o检测表明 o有 ts h ∗
vs h左右的抗性芽属于转基因芽 o与卡那霉素筛选体系相近 ∀来自 u种筛选体系的转基因芽的生根能力差
异比较研究正在进行 ∀
w °Œ转基因植株的检测
由于 °Œ基因不存在于大多数植物体内 o转 °Œ基因的植株可以采用常规的转基因检测方法如 °≤• !
|vt 第 v期 杨 莉等 }°Œr甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用
• ×2°≤• !≥²∏·«¨µ±杂交 !‘²µ·«¨µ±杂交和 • ¶¨·¨µ±杂交等方法进行检测 ∀此外 o°Œ基因编码的蛋白是一种酶 o
因此 o检测酶活性的一些方法也可用于转基因 °Œ植株的检测 ∀
411 氯酚红(χηλοροπηενολ ρεδ ,ΧΠΡ)法
该方法基于甘露糖代谢时可使培养基酸化的原理 ∀³‹指示剂氯酚红在 ³‹y1s时呈红色 o随着 ³‹下降
转变成黄色 ∀将待测组织小块接种到添加甘露糖和氯酚红的 ≥液体培养基中 o在黑暗条件下 oux ∗ vs ε 培
养 w ∗ x §后 o如培养基仍呈红色或紫色 o说明没有 °Œ活性 o该材料为非转基因材料 ~如培养基呈黄色或桔
红色 o则说明 °Œ基因成功导入了外植体 ∀与 Š˜≥组织染色相比 o°Œ活性检测无需昂贵试剂 o干扰反应少 o
结果可靠 ∀该方法已成为 °Œ活性检测的最常用方法 o在转基因甜菜k²¨µ¶¥² ετ αλqot||{l !玉米k •µ¬ª«·ετ
αλqousstl !小麦k • µ¬ª«·ετ αλqousstl !水稻k∏¦¦¤ ετ αλqousstl和甜橙k…²¶¦¤µ¬²¯ ετ αλqoussvl上均已有应用 ∀
412 分光光度计检测法
°Œ催化甘露糖 p y p磷酸转化成果糖 p y p磷酸的同时会将 ‘„⁄°n还原成 ‘„⁄°‹ o而 ‘„⁄°‹的增加
会造成 vws ±°处的吸光度上升k∂¤± ≥¦«¤©·¬±ª¨± ετ αλqot||xl ∀因而 o用分光光度计检测 vws ±°处 ‘„⁄°‹吸
收值的上升速度 o就可以检测 °Œ活性 ∀从非转基因植株如甜橙和玉米中没有检测到 °Œ活性 o而在转基
因甜橙k…²¶¦¤µ¬²¯ ετ αλqoussvl和玉米k • ¤±ª ετ αλqousssl中则检测到 °Œ活性 ∀
413 蛋白质电泳及染色
利用蛋白质电泳及染色检测 °Œ的原理与分光光度计检测法相似 o°Œ催化甘露糖 p y p磷酸转化成果
糖 p y p磷酸的同时会将 ‘„⁄°n 还原成 ‘„⁄°‹ o‘„⁄°‹ 又可将其电子转移给电子传递剂吩嗪硫酸甲酯
k°≥l o还原态的电子传递剂可直接还原噻唑蓝k××l o生成深蓝色的不溶于水的甲 k©²µ°¤½¤±lkŠ¬¥²± ετ
αλqousstl o在凝胶上显现条带 ∀因此 o待测组织的蛋白经电泳和染色后 o如果有蓝带出现 o则说明 °Œ基因
导入外植体 ~反之 o表明转基因不成功 ∀该方法已成功应用在转基因甜橙的检测上k…²¶¦¤µ¬²¯ ετ αλqoussvl ∀
x °Œr甘露糖筛选体系的生物安全评估
对一种筛选体系进行生物安全评估主要是对标记或筛选基因所编码的蛋白进行过敏性分析 !毒性检测 !
农业性状分析以及与食物中其他成分相互作用分析 ∀ • ¨¨§等kusstl对转基因玉米和甜菜中 °Œ基因所编
码的蛋白质进行了全面的分析 o认为甘露糖筛选体系对人体健康和环境十分安全 ∀
• ¨¨§等kusstl从生物信息学 !体外消化和糖蛋白类型等方面进行分析和检测 o结果显示 }大肠杆菌 °Œ
基因与任何已知的毒素或过敏原没有显著的同源性 ~转基因植物表达产生的 °Œ蛋白能在胃和小肠环境中
完全分解 ∀
给 tv只小鼠喂养含过量 °Œ蛋白的食物 o连续观察 tw §o结果表明小鼠没有中毒表现 o与对照组相比也
无异常情况出现 o说明 °Œ蛋白没有毒性 ∀对 t||{年移栽到大田的 °Œ转基因玉米和非转基因玉米进行含
水量 !植物群落 !茎杆硬度 !根长 !株高和穗长等一系列农艺性状进行了全面研究 o没有发现显著区别 o说明
°Œ基因对植株的生长或其他农艺性状没有负面影响 o对环境也是安全的 ∀对转基因玉米与非转基因玉米
进行纤维 !油脂 !蛋白质 !淀粉 !Βp胡萝卜素和玉米黄质等营养指标的分析表明二者之间也无显著区别 ∀
y 结语
综上所述 o°Œr甘露糖筛选体系自 t||{年首次报道用于甜菜转基因以来 o已在不少单子叶植物和双子
叶植物上取得成功 ∀这一新的筛选基因 o为植物转化提供了不用除草剂基因或抗生素基因来筛选转化植株
的新途径 o将对植物转基因领域产生巨大的推动作用 ∀且该系统对人体和环境安全 !筛选试剂价格低廉 !不
影响转化植株的生长发育 !筛选效率高 o因此有望部分代替抗生素或除草剂等传统筛选体系 o在植物的遗传
转化过程中得到更广泛的应用 o成为植物转基因中的又一有效筛选体系 ∀
但是 o肉桂和一些豆类植物由于具有内源 °Œ活性 o因而该筛选体系在这些植物上不能应用 o对于以往
研究尚未涉及过的材料 o需先对内源 °Œ活性进行检测 ∀另外 o作为一种新的筛选体系 o它在植物 o尤其是
木本植物上的应用尚十分有限 o因而对包括葡萄在内的多数植物 o尚有必要对筛选培养基中甘露糖与其他糖
以及磷酸根离子浓度等因素进行进一步的优化 o同时还必须考虑基因型对转化的影响 ∀
swt 林 业 科 学 wt卷
笔者目前正在开展 °Œ基因转化金柑的研究 o根据初步试验结果 o发现金柑不能利用甘露糖 o因而具备
应用该筛选体系的前提条件 ∀与卡那霉素筛选体系相比 o采用甘露糖筛选体系可以获得较多的转基因芽 o而
且转基因芽的生长势较强 ∀°Œ转基因组织块的氯酚红检测法所需试剂价格低廉 o操作十分简单 o干扰少 ∀
本研究小组现已将转基因芽转移到生根培养基中进行生根 o后续研究正在进行 ∀
参 考 文 献
刘 凡 o曹鸣庆 o佐藤隆德 qt||v q几种抗生素对离体培养中植物形态发生的影响 q华北农学报 o{ktl }wz p xt
…²¶¦¤µ¬²¯ • o„¯ ° ¬¨§¤ • „ …o⁄¨µ¥¼¶«¬µ¨  × ∂ ≤ oετ αλqussv1 ׫¨ ∏¶¨ ²©·«¨ °ŒΠ°¤±±²¶¨ ¶¨¯¨ ¦·¬²±¶¼¶·¨°·²µ¨¦²√¨ µ·µ¤±¶ª¨ ±¬¦¶º¨¨·²µ¤±ª¨ ³¯¤±·¶k Χιτρυσ
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twt 第 v期 杨 莉等 }°Œr甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用