全 文 ： 第 vy卷 第 t期u s s s年 t 月
林 业 科 学
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杉木µ⁄‘„ Œ×≥ p t区的克隆及序列测定
尤 勇 3 洪菊生
k中国林业科学研究院林业研究所 北京 tsss|tl
关键词 } 杉木 oµ⁄‘„ o第 t转录间隔区 o亲缘关系 o克隆和测序
收稿日期 }t||{2sx2ux ∀
本研究属国家/九五0攻关课题k|y2stt2sv2stl ∀
3 现工作单位 }军事医学科学院六所九室 otss{xs ∀
ΤΗΕ ΧΛΟΝΙΝΓ ΑΝ∆ ΣΕΘΥΕΝΧΙΝΓ ΟΦ ΤΗΕ ρ∆ΝΑ ΙΝΤΕΡ ΝΑΛ ΤΡΑΝΣΧΡΙΒΕ∆
ΣΠΑΧΕΡ 1 ΡΕΓΙΟΝΣ ΟΦ ΧΗΙΝΕΣΕ ΦΙΡ
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( Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ Φορεστρψ, ΧΑΦ Βειϕινγ tsss|t)
Αβστραχτ : ׫¨ µ⁄‘„ ¬±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨§¶³¤¦¨µtkŒ×≥ p tl µ¨ª¬²±¶²©·º² ≤«¬±¨ ¶¨ ©¬µ³µ²√¤±¨ ±¦¨¶º¤¶¤°³¯¬©¬¨§
¤±§¦¯²±¨ §¥¼ °≤ • µ¨¤¦·¬²±q׫¨ °≤ • µ¨¤¦·¬²± º¤¶©²¯ ²¯º¬±ª}|z ε x °¬±∏·¨¶ψ|x ε x °¬±«·¨¶ψ „§§¬±ª·«¨ פª
³²¯¼° µ¨¤¶¨ ψ|w ε ¯°¬±xy ε t °¬±ozu ε u °¬±~·«¬µ·¼2¶¬¬¦¼¦¯¨ ¶ψzu ε ts °¬±q‹¬ª« ∏´¤¯¬·¼ ⁄‘„ ·¨°³¯¤·¨¬¶±¨ ¦2
¶¨¶¤µ¼©²µ·«¨ ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ²©Œ×≥ p t ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ o§∏µ¬±ª·«¨ °≤ • µ¨¤¦·¬²±o·¨± °¬±∏·¨¶§¨ ±¤·∏µ¤·¬²±·¬°¨¤±§xy ε
¤±±¨ ¤¯¬±ª·¨°³¨µ¤·∏µ¨ ¤µ¨ ¥¨ ±¨ ©¬¦¬¤¯ ·²¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±q׫¨ Œ×≥ p t ©µ¤ª° ±¨·º¤¶¯¬ª¤·¨§·² °˜≤t| ³¯¤¶°¬§o§¬ª¨¶·¨§
º¬·« ‹¬±§ µ ¤±§·µ¤±¶©²µ° §¨¬±·²¦²°³¨·¨±¦¨ ¦¨¯¯¶²© Ε . χολι {v ¶·µ¤¬±o·«¨ ¦¯²±¨ §¶·µ¤¬±¶«¤µ¥²µ¬±ªµ¨¦²°¥¬2
±¤±·³¯¤¶°¬§º µ¨¨ ²¥·¤¬±¨ §o·«²¶¨ µ¨¦²°¥¬±¤±·³¯¤¶°¬§¶º µ¨¨ ∏¶¨§·²¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ©²µŒ×≥ p t ©µ¤ª° ±¨·q≥¨´ ∏¨ ±¦¨ ¤±¤¯2
¼¶¬¶¬±§¬¦¤·¨§·«¤··«¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¯¨ ±ª·«¬¶uzv ¥³o·«¨ ∏¶¬±ª³¨µ¦¨±·¤ª¨ ²©„ !× !≤ !Š º¬·«¬±Œ×≥t ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©≤«¬±¨ ¶¨
©¬µº µ¨¨ uz qx h !uv h !ut qy h !uz q| h µ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼ ¤±§·«¨ Šr≤ ¦²±·¨±·²©Œ×≥t ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ º¤¶w{ qvx h q≤²°³¤µ2
¬±ª º¬·«²·«¨µ³¯¤±·¶o·«¨ Šr≤ ¦²±·¨±·²© ≤«¬±¨ ¶¨ ©¬µº¤¶¯ ¶¨¶·«¤± ²·«¨µ³¯¤±·¶oº«²¶¨ Œ×≥t µ¨ª¬²±¶«¤√¨¥¨ ±¨ ¶¨2
∏´¨ ±¦¨§q„¶·² Œ×≥Œ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ o·«¨ µ¨ º¤¶±² §¬©©¨ µ¨±¦¨ ¤°²±ª·º² ≤«¬±¨ ¶¨ ©¬µ³µ²√ ±¨¤±¦¨¶o¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¤±¤¯¼¶¬¶§¬¶2
¦¯²¶¨§·«¨ µ¨ º µ¨¨ ·º²µ¨³¨ ¤·¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶≈„„„Š ± ¤±§≈× × Š ±¤³³¨¤µ¨§ º¬·«¬± Œ×≥t ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© ≤«¬±¨ ¶¨ ©¬µq
Κεψ ωορδσ: ≤«¬±¨ ¶¨ ©¬µ( Χυννινγηαµια Λανχεολατα ‹²²®l oµ⁄‘„ oŒ±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨ §¶³¤¦¨µtkŒ×≥ p tl o
• ¨¯¤·¬²±¶«¬³¤±¤¯¼¶¬¶o≤ ²¯±¬±ª¤±§¶¨ ∏´¨ ±¦¬±ª
编码核糖体 • ‘„的基因是由一些高度重复序列组成的多基因家族 ∀µ• ‘„ 基因以串联重复形式
存在于染色体上 o每个细胞中的拷贝数目在 tsss ∗ ts osss之间 o由于 µ• ‘„ 基因中包含了进化速度不
等的编码区 !非编码转录区和非转录区 o因而可以选择其中保守程度不同的片段作分子标记研究植物
的系统发育及遗传变异 ∀
Œ×≥是核糖体 ⁄‘„中介于 t{¶和 x1{¶之间kŒ×≥ p tl以及 x1{¶和 uy¶kŒ×≥ p ul之间的转录间隔
区 o目前已研究过的被子植物 Œ×≥ p t一般小于 zss¥³k„ √¯¤µ¨½2…∏¯¼¯ ¤¯ ετ αλ. ,t||xl o而裸子植物的 Œ×≥
p t远大于 tsss¥³o由于该片段长度不大且其进化速度快 o加上协同进化k¦²±¦¨µ·¨§¨ √²¯∏·¬²±l o使得该
片段在基因不同重复单元间十分一致 o适于作为探讨科内 !属间及属下种间系统关系的标记 ∀
杉木属( Χυννινγηαµια Λανχεολατα ‹²²®l是我国南方主要用材 !造林树种 o其栽培历史悠久 o分布
区域广泛 o生态环境多样 ∀对于杉木属的系统分类研究 o长期以来学者们从杉木的化石 !形态结构 !染
色体等水平作了大量工作 o形成了多种观点k中国植物志编辑委员会 ot|z{ ~郝景盛 ot|xs ~叶培忠 o
t|z| ~王德银 ot|{u ~吴中伦 ot|{vl ∀目前大多学者认为有杉木属有一个种k吴中伦 ot|{vl杉木k而且形
成了许多的观点 oΧυννινγηαµια Λανχεολατα(k¤°¥ql‹²²®l和一个变种台湾的峦大杉( Χυννινγηαµια
κονισηιι ‹¤¼¤·¤l ∀
本实验对于杉木的 Œ×≥ p t序列进行了克隆和测序 o为杉木 Œ×≥序列的研究做了最基础的铺垫 o也
为更进一步研究杉木属的系统进化创造了条件 ∀由于杉木属 µ⁄‘„ 的研究尚未见报道 o本文在引物设
计时借鉴了已研究过植物的 Œ×≥ p t上下游序列 ∀
1 材料和方法
t1t 样品的采集 实验材料从全国杉木种源基因库中采样 o它们分别是 }福建建瓯 !四川德昌 ∀从树
木上采集到的新鲜针叶经液氮处理后 o放置在 p zs ε 冰箱内保存 ∀
t1u 杉木总 ⁄‘„提取 按文献的方法k尤 勇 ot||{l进行 ∀
t1v Œ×≥ p t序列扩增及克隆 根据已发表的植物 t{≥µ• ‘„和 x1{≥µ• ‘„的序列合成了引物 t和引
物 u ∀
引物 t }„Š„„Š× ≤ Š× „„≤ „„ŠŠ× × × ≤≤ Š× „ŠŠ
引物 u }Š„× Š≤ Š„Š„Š≤≤ Š„Š„× „„≤≤ Š× × Š
其中引物 t与 t{≥• ‘„基因 v.段序列相同 o引物 u同 x1{≥• ‘„x.端序列互补 o引物 t和 u的结合
位点及 °≤ • 扩增 Œ×≥ p t区位置见图 t
图 t 引物及其扩增区域
ƒ¬ªqt °µ¬° µ¨¶¤±§·«¨¬µ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± µ¨ª¬²±¶
Œ×≥ p t序列的扩增及补平 °≤ • 反应体系总体积为
uxˏo其中 §× ×° !§≤ ×° !§Š×°和 §„×°各 tssː o引物 t
和引物 u乃各 xs³°²¯ o模板 ⁄‘„uss±ªots ≅ °≤ • 反应缓
冲液 u1xˏoפ´ 耐热 ⁄‘„ 聚合酶 u1xˏo反应液上覆盖
wsˏ石蜡油 ∀反应的条件为 }|z ε x°¬± ψ |x ε x°¬± ψ加
入 פ´ ⁄‘„聚和酶 ψ|w ε t °¬±oxy ε t °¬±ozu ε u °¬±ovx
个循环 ψ反应产物在 zu ε 中补平 ts °¬±∀
°≤ • 产物在 t1s h 琼脂糖凝胶中电泳检查 o并用
Š ±¨¨ ¦¯¨ ¤± Ž¬·回收 o取 xss ±ª扩增产物用 ×w⁄‘„聚和酶补平 ∀
补平反应体系为 tsˏo具体成分如下 }×w ⁄‘„ ¬¯ª¤¶¨ ¯Λk≥∏¯∏l otˏt1ux °  §‘×° otˏts ≅
¥∏©©¨µk„l ozˏ°≤ • 产物 ∀补平条件为 vz ε 保温 tx °¬±o然后放入 yx ε 的水浴锅中灭活 ×w⁄‘„ ¬¯ª2
¤¶¨ ∀
Œ×≥ p t序列的克隆 取上述补平反应液与经 ‹¬±§µ完全酶切并纯化的 ³˜≤t|以 vΒt的比例在
×w⁄‘„连接酶作用下连接 o连接产物用常规方法转化大肠杆菌 {v菌株 o插入片段经 ∞¦²• Œ2‹¬±§¶
双酶切予以确认 ∀
⁄‘„序列测定 序列测定采用 ≥¤±ªª¨µ双脱氧法k• ²ª¨µot|{zl o在 Ž… ²§¨¯ usts序列仪上进
行 ∀
2 结果与分析
u1t 杉木 Œ×≥ p t序列的克隆 本实验比较了模板的质量及浓度 o扩增的程序等因素对 Œ×≥ p t序列
的扩增的影响 ∀Œ×≥ p t序列的扩增对于模板质量要求较高 o带有杂质或部分降解的模板都不能扩增
出清晰 Œ×≥ p t条带 ∀在反应程序的设计上 o延长模板变性的时间至 ts °¬±o同时将 פ´ 酶的加入放在
模板变性以后有利于 Œ×≥ p t条带的特异扩增 ∀不同植物 Œ×≥ p t扩增的退火温度也不相同 oxy ε 的温
度更适合杉木 Œ×≥ p t序列的扩增 ∀
扩增的 Œ×≥ p t序列回收后 o必须补平 o这样有利于同质粒载体的连接 ∀连接产物转化时 o本实验
使用了 ⁄‹xΑ和 {v菌株两种大肠杆菌 o转化结果基本相同 o由于 {v菌株生长较 ⁄‹xΑ菌株快 o且
阳性克隆易选择 o所以最后选择了 {v菌株 ∀
uut 林 业 科 学 vy卷
u1u 杉木 Œ×≥ p t序列的测定 利用 ⁄‘„序列测定仪测定了杉木两个种源的杉木 Œ×≥ p t序列k见图
ul ∀杉木 Œ×≥ p t序列的长度为 uzv¥³o两个种源的 Œ×≥ p t序列长度以及碱基组成完全相同 ∀该结果
说明杉木 Œ×≥ p t序列在杉木两种源间比较保守 o不存在变异 ∀从杉木 Œ×≥ p t序列中可以看出 „ !× !
≤ !Š四种碱基的使用频率分别是 uz1x h !uv h !ut1y h !uz1| h o碱基 Š的使用频率略高 o但总体上看 w
种碱基的使用频率基本一致 o不象水稻 !大豆等植物 Šr≤ 含量那么高 ∀由于杉木 Œ×≥ p t序列 Šr≤ 含
量不是太高 o所以其 Œ×≥ p t序列在测定时较 Šr≤ 含量高的植物容易 ∀另外序列分析的结果显示 o杉
木 Œ×≥ p t序列中存在≈„„„Š ±和≈× × Š ±的短重复序列 ∀
图 u 杉木k Χυννινγηαµια Λανχεολατα ‹²²®l不同种源 Œ×≥ p t序列排列阵k≥¨´ ∏¨ ±¦¨ „ ¬¯ª±° ±¨·l
ƒ¬ªqu ׫¨ Œ×≥ p t ≥¨´ ∏¨ ±¦¨ ¤¯¬ª±° ±¨·²© ≤«¬±¨ ¶¨ ©¬µ©µ²° §¬©©¨ µ¨µ·³µ²√ ±¨¤±¦¨
3 讨论
Œ×≥序列在被子植物系统学上应用时间虽然较短 o但已取得许多可喜的进展 oŒ×≥序列的分析被应
用于许多被子植物的分类学及系统学研究上k李承森 ot||zl ∀裸子植物的 Œ×≥序列的测定和应用研究
较少 o而且对 Œ×≥序列能否作为一种分子标记应用于裸子植物的系统演化及遗传变异上尚存在不同的
观点 o有的学者认为裸子植物 Œ×≥序列变异较大 !序列长度较长 o不适合作研究裸子植物系统演化及遗
传变异的标记k李承森 ot||zl o也有的学者认为 Œ×≥序列可应用于裸子植物系统学及遗传变异的研究 o
并且已做了深入的探讨k∂¬±¬±ªot||{ ~¤µ®²¶ ετ αλ. ot||{l o如 Ž¤µ√²±¨ ±的研究结果认为不同裸子植
物的 Œ×≥ p t拷贝的长度不同 o可相差约 xss¥³o有的甚至相差几千个碱基kŽ¤µ√²±¨ ±± ετ αλ. ot||wl ∀
„ √¯¤µ¨½2…∏¼¯ ¤¯通过研究裸子植物 z个科 ux个属的 Œ×≥发现裸子植物 Œ×≥明显长于被子植物 oŒ×≥的
平均长度为 txss o其中雪松属k Χεδρυσl !粗榧属k Χεπηαλοταξυσl !落羽杉属( Ταξοδι µ )的为 tsss¥³o云
杉属k Πιχεαl的可长达 vwss¥³k„ √¯¤µ¨½2…∏¯¼¯ ¤¯ ετ αλ. ot||xl ~Ž¤µ√²±¨ ±±通过研究挪威云杉发现其长度
变异主要存在于 Œ×≥ p u部分 o而且认为 Œ×≥长度的变异对于云杉的系统学研究是一个有利的工具
kŽ¤µ√²±¨ ±± ετ αλ. ot||wl ∀ „ √¯¤µ±¨ ½通过研究两个松科亚属的 tx个代表种发现 oŒ×≥序列的变异主要
存在 Œ×≥ p u部分 o并且认为 ׌≥ p u的序列变异便于揭示较高分类级别的系统进化关系 ∀从以上几例
可以看出 Œ×≥ p t和 Œ×≥ p u分别适合于不同分类层次的系统研究 ∀对于松科来讲 o其 Œ×≥ p u部分的
变异较大 o而 Œ×≥ p t部分的变异较小 ∀本实验只是克隆和测定了杉木两种源的 Œ×≥ p t序列 ∀从实验
取材上讲 o两个杉木种源分别来自福建和四川两个省 o分别位于杉木产区的东西边缘 o种源的生存环境
存在极大的差异k于永福 ot||xl ∀全国杉木种源协作组曾将德昌种源列为特殊生态类型下的种源 o建
瓯种源与德昌种源在生长状况 !材性 !抗逆性等方面存在较大差异 o建瓯种源被认定为生产力优良种
vut t期 尤 勇等 }杉木 µ⁄‘„ Œ×≥ p t区的克隆及序列测定
源 o而德昌种源为生长劣势种源k洪菊生 ot||wl ∀德昌种源还被有的学者认定为杉木属的一个新种k王
德银等 ot|{ul ∀从实验的结果看两种源间不存在 Œ×≥ p t序列上的差异 o至于杉木 Œ×≥u部分以及整个
杉木的 Œ×≥情况有待更进一步的研究 ∀
对于杉科 Œ×≥序列的研究至今尚未见报道 o从已报道的松科k°¬±¤¦¨¤¨ l !粗榧科k≤ ³¨«¤¯²·¤¬¤¦¨¤¨ l !
红豆杉科kפ¬¤¦¨¤¨ l的 Œ×≥来看 oŒ×≥的序列长度变异也很大 o从雪松 tsss¥³到云杉的 vwss¥³不等 ∀
由于杉木整个 Œ×≥序列尚未测定 o现在还不能断定其 Œ×≥的长度情况 o单从其 Œ×≥ p t的长度可以说其
较已知裸子植物的 Œ×≥ p t序列要短一些 o要了解更多的情况须借助更多杉科 Œ×≥序列的测定 ∀
参 考 文 献
郝景盛 q中国裸子植物志 q北京 }人民出版社 ot|xs
洪菊生等 q全国杉木地理种源试验专刊 q林业科学研究 ot||w oz }tvs ∗ tww
李承森等编 q植物科学进展 q第一卷 q北京 }高等教育出版社 ot||z }uu ∗ uv
王德银 o刘和林 q杉木属新种及新变种 q植物分类学报 ot|{u ouskul }uts ∗ uvu
叶培忠 q杉科树木属间杂交初步研究 q南京林产工业学院学报 ot|z|
尤 勇等 q杉木 ⁄‘„的简便提取方法 q林业科学研究 ot||{ ottktl }ttt ∗ ttv
吴中伦 q杉木 q北京 }中国林业出版社 ot|{v
于永福 q杉科植物的起源 !演化及其分布 q植物分类学报 ot||x ovvkwl }vyu ∗ v{|
中国植物志编辑委员会 q中国植物志第七卷 o北京 }科学出版社 ot|z{
„ √¯¤µ¨½2…∏¼¯ ¤¯o∞¯ ±¨¤t ¬¶·¬²±q׫¨ ±∏¦¯ ¤¨µµ¬¥²¶²°¨⁄‘„ ¬±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨ §¶³¤¦¨µ²©ª¼°±²¶³¨µ°¶¬¶¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ ²¯±ª¨µ·«¤± ¤±ª¬²¶³¨µ°¶q
°¯ ¤±·Š ±¨²°¨¶ o¤±∏¤µ¼ ot||x
Ž¤µ√²±¨ ± ° o≥½°¬§·„ ∞q¨±ª·«√¤µ¬¤·¬²±¬±·«¨ ¬±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨ §¶³¤¦¨µ¶²©µ¬¥²¶²°¤¯ ⁄‘„ ¬± Πιχεα αβιεσ ¤±§µ¨ ¤¯·¨§¶³¨¦¬¨¶q ׫¨ ²µ¨·¬¦¤¯
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¤°³¯¨©µ²° Λεσσινγιαk≤²°³²¶¬·¤¨ o„¶·¨µ¨¤¨ l q≥¼¶·¨°¤·¬¦≥ ¦¨·¬²±r¤° µ¨¬¦¤± ≥²¦¬¨·¼ ²© °¯ ¤±·×¤¬²±²°¬¶·¶ „¥¶·µ¤¦·Œ±§¨ ¬ot||{ o„±±∏¤¯
 ¨¨·¬±ª²©·«¨ …²·¤±¬¦¤¯ ≥²¦¬¨·¼ ²© „ ° µ¨¬¦¤ou ∗ y o„∏ª∏¶·ot||{ o…¤¯·¬°²µ¨ o ⁄
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∂¬±¬±ªo׫²°¤¶ƒ q‘∏¦¯ ¤¨µµ¬¥²¶²°¤¯ ⁄‘„ k±µ⁄‘„l ¬±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨ §¶³¤¦¨µtkŒ×≥tl¶∏¥µ¨³¨ ¤·¶¤±§³«¯²ª¨ ±¼ ²© Πιναχεαε .≥¼¶·¨°¤·¬¦≥ ¦¨2
·¬²±r„ ° µ¨¬¦¤± ≥²¦¬¨·¼ ²© °¯ ¤±·×¤¬²±²°¬¶·¶ „¥¶·µ¤¦·Œ±§¨ ¬ot||{ o„±±∏¤¯  ¨¨·¬±ª ²©·«¨ …²·¤±¬¦¤¯ ≥²¦¬¨·¼ ²© „ ° µ¨¬¦¤ou ∗ y o„∏ª∏¶·o
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