全 文 ：园艺学报，2015，42 (2)：271–279.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0789；http：//www. ahs. ac. cn 271
收稿日期：2014–10–27；修回日期：2014–12–15
基金项目：东北林业大学国家基础科学人才培养基金项目（201220A5）；国家自然科学基金项目（30800082，31272200）；中央高校基
本科研业务费专项资金项目（DL11CA03，2572014EA03-02）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：bozhou2003@163.com）
番茄 LemiR390 及其预测靶基因 LeTAS3 的鉴定
与表达分析
于丽丽，刘伟伟，方 媛，周 莹，王如意，李 洋，周 波*
（东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）
摘 要：以番茄（Lycopersicon esculentum）紫色花青素积累品系 Aft 基因型‘LA1996’为试验材料，
以番茄总 RNA 反转录的 cDNA 文库为模板，根据 mirbase 数据库中 MIR390 基因和番茄 unigene 数据库预
测到的靶基因序列，克隆番茄 LemiR390 前体基因及其预测靶基因 LeTAS3；采用定量 PCR 技术检测
LemiR390 及其预测靶基因 LeTAS3 在番茄果实不同发育阶段的表达情况，利用 RLM 5′RACE 技术验证
LemiR390 对靶基因 mRNA 的剪切作用。结果表明，克隆到两个 LemiR390 的前体，分别与 MIR390a 和
MIR390b 一致，含有完整的茎环结构。LemiR390 与其靶基因 LeTAS3 在番茄果实不同发育时期表达量不
同，果实发育前期特别是花后 1 ~ 2 周幼果期表达量高，发育后期均下降为微量表达，并且在幼果期
LemiR390 与 LeTAS3 表达呈负调控关系。LemiR390 能够靶作用于 LeTAS3 的转录本调控其降解，其剪切位
点为 LemiR390 序列 5′端的第 10 位碱基。
关键词：番茄；LemiR390；LeTAS3；基因表达；miRNA
中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）02-0271-09

Identification and Expression Character Analysis of LemiR390 and Its
Potential Target LeTAS3 in Tomato
YU Li-li，LIU Wei-wei，FANG Yuan，ZHOU Ying，WANG Ru-yi，LI Yang，and ZHOU Bo*
（College of Life Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）
Abstract：In this research，tomato（Lycopersicon esculentum）cultivar LA1996 was used as materials.
Based on the sequence of MIR390 in mirbase and unigene database of tomato，fragments of premiR390 and
potential target LeTAS3 were obtained through PCR using cDNA as template. Transcript levels of
LemiR390 and its potential target gene LeTAS3 in tomato fruits were determined by real-time quantitative
PCR. LemiR390 guided-cleavage and target site for the putative Trans-Acting SiRNA3（LeTAS3）mRNA
was validated using RLM-5′RACE. The results showed that two precursors of miR390 were obtained，with
sequences that were consistent with MIR390b and MIR390a and able to form a hairpin structure.
Expression of LemiR390 and its target gene LeTAS3 in tomato fruits differed in developmental stage.
During the early stage，especially 1–2 weeks after flowering，the transcription levels of LemiR390 and
LeTAS3 were high，and LemiR390 negatively regulated the expression of LeTAS3；However，in late stage

Yu Li-li，Liu Wei-wei，Fang Yuan，Zhou Ying，Wang Ru-yi，Li Yang，Zhou Bo.
Identification and expression character analysis of LemiR390 and its potential target LeTAS3 in tomato.
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（3–7 weeks after flowering），their expression levels were low. The mature LemiR390 targeted a
sequence of high complementarity in LeTAS3 mRNA and sheared the 10th site of LeTAS4 mRNA from the
LemiR390 5 end.
Key words：tomato；LemiR390；LeTAS3；gene expression；miRNA

microRNA（miRNA）通过对靶基因 mRNA 的降解或者抑制其翻译等在转录后水平上特异调控
靶基因的表达（Bartel，2004；Jones-Rhoades & Bartel，2004）。在植物中，miRNAs 与其所作用的靶
基因的碱基互补性很高，靶 mRNA 的剪切多数发生在 mRNA-miRNA 复合体的中间，距离 miRNA 5′
末端的第 10 位和第 11 位碱基之间（Rhoades et al.，2002；German et al.，2008）。而且 miRNA 调控
的靶基因很多是调控植物生长发育的重要转录因子和蛋白（Rhoades et al.，2002）。因此，miRNA
参与调控植物生长发育的全过程，如细胞分化、信号转导以及逆境胁迫响应等生物学过程（Kidner &
Martienssen，2005；Zhang et al.，2006）。近年对植物 miRNA 的研究表明，它在植物器官的形态建
成（Zhao et al.，2007；Huang et al.，2012；Sun et al.，2013）、激素应答反应（Chen et al.，2011）、
逆境胁迫（Ding et al.，2009；Kantar et al.，2011）、营养代谢（Hsieh et al.，2009）以及自身代谢的
反馈调节（Marin et al.，2010；Kantar et al.，2011；Luo et al.，2012）等方面起着重要的作用。miRNA
的相关研究对阐明生物体复杂的生命调控机制具有非常重要的意义。
miRNA390 是植物中较保守的 miRNA 家族。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中 miRNA390 可
引发 ta-siRNA（trans-acting small interfering RNA）的生物合成，调控生长素应答因子 ARF2、ARF3
和 ARF4（Hunter et al.，2003；Allen et al.，2005；Fahlgren et al.，2006），进而影响侧根的生长（Marin
et al.，2010）。这种 miR390-TAS3-ARFs 的调控途径高度保守，目前在苔藓植物、禾本科植物、双子
叶植物中均有发现（Axtell et al.，2006；Nagasaki et al.，2007；Douglas et al.，2010）。此外 Moxon
等（2008）利用高通量测序分析了番茄叶片和果实中的 miRNAs 表达情况，发现番茄 miRNA390 在
幼小果实中的表达量远高于叶片、未开放的花以及成熟果实中。Karlova 等（2013）对番茄果实发育
的 4 个阶段的 miRNAs 和降解组进行分析，发现 miR390 可以靶降解 TASI3a、TASI3b 和肌动蛋白相
关复合物亚基。根据这些研究基础，可以认为 miR390 参与了番茄果实发育的重要调节过程。
番茄（Lycopersicum esculentum）是植物分子生物学研究的重要模式植物，对番茄 miRNA 的生
物学功能的研究报道也越来越多。虽然 miRNA390 作为重要的转录后调控因子在拟南芥、番茄中已
经被高通量测序鉴定，但是其在 Anthocyanin fruit（Aft）基因型番茄花青素积累果实中的 MIR 前体
鉴定、表达特性、靶结合位点鉴定等还有待于进一步克隆验证和深入分析。本研究中从 Aft 基因型
番茄‘LA1996’中分离到 2 个 miR390 前体基因，并对 LemiR390 及其靶基因 LeTAS3 在果实发育的
6 个阶段的表达模式做了分析，验证确定了 LemiR390 与靶基因 LeTAS3 的剪切位点，为后期研究
LemiR390 在 Aft 基因型番茄果实生长发育及花青素生物合成代谢中的调控分析奠定基础。
1 材料与方法
1.1 番茄材料及其总 RNA 提取和 cDNA 文库的构建
番茄 Aft 基因型‘LA1996’种子为本实验室保存。根据总 RNA 提取试剂盒 TRNzol A+和 Phase
Lock GelTM 说明书提取‘LA1996’幼果期（花后 1、2 周）、膨大期（花后 3 ~ 5 周）以及成熟期（花
后 7 周）果实的总 RNA，并以提取的总 RNA 为模板，以 Random 引物通过反转录 PCR 合成 cDNA。
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番茄 LemiR390 及其预测靶基因 LeTAS3 的鉴定与表达分析.
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1.2 番茄 LemiR390 前体基因预测及克隆
在数据库 miRNA Registry Database（http：//mirbase.org/search.shtml）搜索并下载番茄的成熟
miRNA390 序列（sly-miR390b-5p MIMAT0035479，sly-miR390a-5p MIMAT0035467），将其在番茄基
因组数据库（http：//solgenomics.net/tools/blast/index.pl）中利用 Blast 工具且修改 Blast 的期望阈值
（E-value）为 1e-0 进行比对，寻找番茄 LemiR390 可能的前体序列。对预测完全与 LemiR390 成熟
序列 22 nt 匹配的基因组序列进一步筛选，选择 LemiR390 两端约 180 nt 的核苷酸序列，采用 RNA
Structure 4.6 软件分析，若其存在完整的茎环结构且成熟序列完全位于 5′端，则推测该茎环结构对应
的核苷酸序列为潜在的 LemiR390 前体（LepremiR390）。
以番茄的 cDNA 文库为模板，根据 LemiR390 含有茎环结构的基因组序列（SL2.40ch09），设计
特异性引物进行 PCR 扩增。LepremiR390 上游引物：5′-TGCATGGAGAATCTGTAAAGCTC-3′；下
游引物：5′-GCCGTGAAACTCAGGATGGA -3′。PCR 反应体系为 50 μL：包含 25 μL 的 2× Taq mix、
1 μL 上游引物（10 μmol · L-1）、1 μL 下游引物（10 μmol · L-1）、1 μL 的 cDNA（100 ng）模板、22 μL
的 ddH2O。PCR 反应程序为：95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，
30 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。PCR 扩增产物用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系
统下观察并拍照，回收目的条带并纯化，并与 T 载体连接进行转化和阳性克隆筛选。
1.3 番茄 LemiR390 的靶基因预测与克隆
将 LemiR390序列与 psRNATarget网站（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/）中的番茄 unigene，
Lycopersicon Cobined（Tomato）Unigenes，SGN Unigene 数据库进行 Blast 比对分析，成熟 LemiR390
具有高度保守结合的序列（最多允许 4 个碱基错配），初步推测为 LemiR390 的靶基因。
以番茄 cDNA 为模板，根据预测靶基因 LeTAS3 的基因序列，设计特异性引物进行 PCR 扩增
（LeTAS3 上游引物 Forward primer：5′-ACTGAAATCTCCACAAGGTAGCA-3′及下游引物 Reverse
primer：5′-ACTGACCAGTCATGATAAATTGC-3′）。PCR 产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收
PCR 产物与 T 载体连接。将连接产物转化大肠杆菌 Trans1-T1 感受态细胞，经平板培养，随机挑取
5 个单菌落进行 PCR 鉴定。将初步验证含有阳性转化子的单菌落送北京华大基因科技公司进行测序。
1.4 LemiR390 及其靶标基因 LeTAS3 的表达分析
根据 LemiR390 前体序列和 LeTAS3 序列设计 RT-PCR 引物（LemiR390 RT 引物同克隆引物，
LeTAS3 RT Forward primer：5′-CTGAAATCTCCACAAGGTAGCA-3′；LeTAS3 RT Reverse primer：5′-TG
AGGATGCGACACTCATCG-3′），内标基因引物参照 Expósito-Rodríguez 等（2008）报道的番茄 CAC
基因（SGN-U314153）引物序列进行合成（CAC RT Forward primer：5′-CCTCCGTTGTGATGTAACT
GG-3′；CAC RT Reverse primer：5′-ATTGGTGGAAAGTAACATCATCG-3′）。
以不同发育阶段番茄果实总 RNA（稀释为 1 µg · µL-1）为模板进行 cDNA 反转录（宝生物工程
有限公司 PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒）。以 cDNA 为模板，利用 DyNAmo
ColorFlash SYBR Green qPCR Kit 试剂盒，在 ABI 7500（Applied Biosystems）上进行 Real-Time PCR
反应，在 96 孔板中进行扩增，以 CAC 基因作为内参，每个模板每种引物做 3 组试验重复、3 组生
物重复。
相对表达量用 2-ΔCT（ΔCT 表示目标基因的 CT 值与内参基因的 CT 值的比值）表示（Livak &
Schmittgen，2001）。

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表 1 5′RACE PCR 所用的引物
Table 1 Primer used for 5′RACE PCR
引物 Primer 序列 Sequence（5′–3′）
5′RACE outer primer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
5′RACE inner primer CGCGGATCCACAGCCTACTGATGA
TCAGTCGATG
5′RACE NP1（GSP1） CCAAATTCACATTCATAACC
5′RACE NP2（GSP2） CCAACAAATAGGGACAATAGGGC
5′RACE NP3（GSP3） CACCACATGAATTTCCTTGAA
1.5 LemiR390 对靶基因转录本的切割位点鉴定
采用5′RACE方法验证小RNA对靶标基因
mRNA 的切割作用，取果实各时期总 RNA 进
行混合，直接连接 5′RACE Adaptor，纯化后进
行反转录获得 cDNA 库，利用 3 条基因特异引
物与试剂盒的接头引物组合（引物见表 1），采
用巢式 PCR 扩增产物，具体方法参照 5′-Full
RACE Kit（TaKaRa）说明书进行。回收扩增产
物并纯化，克隆到 pEASY-T5 Zero Cloning Vector 测序。通过序列比对来分析靶基因切割的位点。
2 结果与分析
2.1 番茄 LemiR390 的前体序列预测及克隆
在番茄基因组数据库（http：//solgenomics.
Net /index. pl）中进行 Blast 序列比对，搜索到
基因组序列 SL2.40ch09与成熟 LemiR390序列
完全匹配；SL2.40ch09 基因组上对应的序列能
够形成完整的茎环结构且符合植物 miRNA 前
体的特征。因此推测该茎环结构对应的核苷酸
序列为潜在 LemiR390 的前体（LepremiR390）。
以番茄 cDNA 文库为模板，加入 LepremiR390
上、下游引物，进行 PCR 扩增，其产物大小与
预期的一致（图 1）。
回收片段进行克隆测序分析，结果得到两个序列有差异的克隆。将获得的序列进行二级结构预
测发现其均能形成稳定完整的茎环结构（图 2）。












图 2 番茄 LemiR390 前体序列的发夹结构
Fig. 2 Hairpin structure of tomato LemiR390
图 1 番茄 miR390 前体片段的 PCR 产物
M：Trans 2000 DNA marker；1、2 为 miR390 前体片段。
Fig. 1 PCR products of premiR390 in tomato
M：Trans 2000 DNA marker；1，2：PremiR390.
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图 4 LeTAS3 基因 cDNA 扩增片段全长
Fig. 4 LeTAS3 gene cDNA amplification fragment
序列比对发现 Sequence_1、Sequence_2 分别与 Brassica rapa 基因组数据库 SL2.40ch09 和
SL2.40ch10 上的部分序列一致，并且分别与 miRbase 中的 sly-MIR390b 和 sly-MIR390a 前体序列一
致（图 3）。

图 3 克隆的片段序列与番茄 MIR390a，MIR390b 以及 SL2.40ch09，SL2.40ch10 相应序列的比对分析
Fig. 3 Sequences alignment of cloned sequence_1 and sequence_2 with sly-MIR390a，sly-MIR390b and
corresponding sequence of SL2.40ch09，SL2.40ch10

2.2 LemiR390 靶基因的预测及克隆
将 LemiR390 序列与番茄 unigene，Lycopersicon Cobined（Tomato）Unigenes，SGN Unigene 数
据库进行比对分析，结果表明，数据库中 SGN-U597206 基因序列与成熟 LemiR390 序列相互结合位
点只有 1 个碱基错配，预测该序列为 LemiR390 的靶基因，将番茄中 LemiR390 的潜在靶基因命名为
LeTAS3。
以番茄 cDNA 为模板，利用 LeTAS3 序列特
异性引物进行 PCR 扩增，其产物大小与预期的一
致，约为 600 bp（图 4）。
将目的条带克隆进行测序，将序列与拟南芥
TAS3 基因（AT3G17185.1）比对，发现其与拟南
芥 TAS3 有很高的相似性。
进一步对所预测到的靶标基因序列进行分
析。结果表明在其序列中有两个 LemiR390 的结
合位点（图 5），而且在 miR390 剪切位点的 5′端，
每 21 个核苷酸对应 TAS3 ta-siRNA[5′D1（+）~
5′D8（+）]，据报道 TAS3 ta-siRNA[5′D8（+）]可以调控靶基因 AUXIN RESPONSE FACTOR 3（ARF3）
和 AUXIN RESPONSE FACTOR 4（ARF4）的表达（Allen et al.，2005；Fahlgren et al.，2006）。
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图 5 番茄 LeTAS3 与拟南芥 AT3G17185.1（TAS3）序列比对
图中黑色线条标注的为成熟 miR390 结合位点。
Fig. 5 Sequence alignment of LeTAS3 in Lycopersicum esculentum and AT3G17185.1（TAS3）in Arabidopsis thaliana
Sequences labeled by black line are miR390 binding site.
2.3 LemiR390 及其靶基因 LeTAS3 在果实发育中的表达
如图 6 和图 7 所示，在果实发育的初期（花后 1 ~ 2 周幼果期），LemiR390 表达量较高，而在果
实发育膨大期及成熟着色果实表达量都很低。


图 6 番茄‘LA1996’果实发育阶段
Fig. 6 The development stages of tomato‘LA1996’fruit
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图 8 LeTAS3 5′RACE 扩增产物电泳分析
Fig. 8 Electrophoresis of LeTAS3 5′RACE product
图 9 LemiR390 对 LeTAS3 剪切位点示意图
Fig. 9 A diagram of cleavage site between LemiR390 and LeTAS3
图 7 番茄 LemiR390 及靶基因 LeTAS3 表达模式
Fig. 7 The expression patterns of LemiR390 and LeTAS3

与 LemiR390 相似，靶基因 LeTAS3 在未成熟果实中（花后 1 ~ 3 周）表达量高，而在果实成熟
过程（花后 4 ~ 7 周）中表达量相对较低，呈下降趋势。整个发育过程 LemiR390 与靶基因 LeTAS3
的表达不成负相关关系，但在果实发育初期（花后第 1 周和第 2 周果实），LemiR390 转录水平与靶
基因 LeTAS3 的表达量成负调控关系，说明 LemiR390 在果实发育早期调控 LeTAS3 的表达。
2.4 LemiR390 对靶基因 LeTAS3 剪切位点的鉴定
利用 RLM 5′RACE 直接分析靶基因 mRNA 的 3′端剪切产物，结果为预期片段大小（图 8）。片
段克隆后随机挑选 15 个阳性转化子进行测序鉴定，结果显示 LemiR390 对靶标 LeTAS3 存在剪切作
用且剪切作用位点位于成熟 LemiR390 与靶基因 LeTAS3 结合序列的第 10 位和第 11 位（LemiR390
序列 5′端起始）的 AG 碱基之间（图 9），符合 microRNA 的作用规律，从而确定 LeTAS3 为 LemiR390
的靶基因之一。

3 讨论
目前随着高通量测序技术的发展，植物中已发现和分离了许多 miRNA（Hsieh et al.，2009；Zhang
et al.，2009；Li et al.，2013；Ren et al.，2013；Xu et al.，2013；Zhou et al.，2014）。随着番茄基因
组数据库的完善，利用高通量测序和降解组分析对番茄果实发育过程的 miRNAs 及靶基因已经进行
了分离和鉴定（Karlova et al.，2013），但这种结合生物信息学方法进行的预测，仍存在一定的局限
性，如有预测不准、信息不全等现象。因此，对预测到的 miRNAs 及其靶基因进行试验验证以及表
达特性分析是很有必要的。
不同植物的 miR390 具有高度保守性，可以更好地寻找到物种间靶标的同源基因。本研究中通
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过生物信息学预测和 5′RACE 技术相结合，在番茄中克隆了 miR390 两个前体基因和潜在的靶基因
LeTAS3，并检测了它们在果实发育过程中的表达（由于 miR390a、miR390b 序列高度保守，因此没
有进行区分），而且试验证明番茄 LemiR390 能够靶作用于 LeTAS3 剪切其转录本，剪切位点符合大
多数植物 miRNAs 对靶基因的剪切常常发生在结合序列中间位置的一般性规律（Jones-Rhoades &
Bartel，2004）。因为 miRNAs 对靶基因具有剪切作用，使 miRNA 与靶基因之间的表达水平表现出
负相关的特点。因此，理论上植物miRNAs与靶基因的表达模式是负调控的关系。在拟南芥中，miR398
与其靶基因 CSD1 和 CSD2 在不同组织、发育阶段的表达模式都表现出负相关关系（Sunkar et al.，
2006）。玉米（Zea mays）中 miR166 和靶基因 leaf1 之间也存在负调控表达的现象（Juarez et al.，2004）。
但拟南芥的成熟 miR393 与靶基因 AFB1 的表达模式不存在典型的互补关系（Chen et al.，2011）。本
研究中，番茄 LemiR390 并没有同其他物种中的 miRNA 与其靶基因表达水平呈现出明显的负调控现
象。只是在番茄果实早期特定发育时期出现明显的负调控表达的现象。由此推断 LemiR390 可能在
特定的时期内介导调控特定的靶基因 mRNA 的剪切降解，而不是在整个发育时期均下调靶基因表
达，因为还有其它调控因子参与到更为复杂的调控网络共同决定着其形态发育。同时本研究采用
5′RACE 技术证实，番茄 LemiR390 介导靶基因（LeTAS3）的 mRNA 剪切降解，虽然 LemiR390 与
LeTAS3 有两个结合位点，但只获得了 LemiR390 剪切 LeTAS3 3′末端结合位点的证据，这可能是受到
试验方法的限制没有检测到，也可能是果实中主要存在 3′端位点的剪切调控方式或者两个位点都剪
切调控但只能检测到 3′端位点的剪切。
本研究结果表明番茄中 LemiR390 对其靶基因 LeTAS3 在果实发育早期特定发育阶段的剪切调
控。但进一步确定 LemiR390a、LemiR390b 的表达特性，以及 LemiR390a 和 LemiR390b 与 LeTAS3
的调控关系，还需要深入研究 LeTAS3 形成的 siRNA 对下游靶基因的调控。这对于了解 LemiR390
及其靶基因 LeTAS3 在 Aft 基因型番茄‘LA1996’果实生长发育中的调控作用具有重要意义。

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