全 文 ：园艺学报，2016，43 (7)：1348–1356.
Acta Horticulturae Sinica
1348 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0324；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2016–05–26；修回日期：2016–07–05
基金项目：国家自然科学基金项目（31570695）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-23）；浙江省农业新品种选育重
点专项（2012C2905-4）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chenghao@tricaas.com）
茶树亚硝酸还原酶基因CsNiR 的克隆及表达分析
张 芬，王丽鸳，成 浩*，韦 康，胡 娟，张成才，刘 圆，吴立赟，
李海琳
（中国农业科学院茶叶研究所，国家茶树改良中心，杭州 310008）
摘 要：以‘龙井 43’茶树叶片的 cDNA 为模板，利用 RTPCR 技术克隆了茶树亚硝酸还原酶基因
（CsNiR），得到完整的 ORF 全长为 1 764 bp，编码 587 个氨基酸；所推导的氨基酸序列与垂枝桦（Betula
pendula）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、菠菜（Spinacia oleracea）和水稻（Oryza sativa）的同源性均
大于 76%。生物信息学分析表明，CsNiR 分子量为 68.648 kD，等电点为 6.12，为亲水性的非分泌蛋白；
二级结构的预测显示，CsNiR 具有完整的 NiR 蛋白结构，含血红素蛋白 β–化合物区域和 4Fe-4S 区域。
实时荧光定量结果表明，该基因在成熟叶片中表达量高于一芽二叶和根。采用营养液水培 3 个茶树品种，
在氮饥饿两周后分别供应正常氮素和低氮素（1 和 0.1 mmol · L-1 NH4NO3），qRT-PCR 测定发现，正常氮
素处理的 2 h 和 6 h，诱导根 CsNiR 表达量显著增加，叶片中的表达量变化延迟到 24 h 之后，且变化幅度
存在基因型之间的差异；低氮处理对 CsNiR 表达量的影响相对较小。因此，研究 CsNiR 基因的表达特性
及其在茶树氮素利用中所发挥的作用，需结合茶树基因型、组织部位、供氮水平等进行综合评价。
关键词：茶树；亚硝酸还原酶；克隆；基因表达；氮素
中图分类号：S 571.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）07-1348-09

Molecular Cloning and Expression Analysis of Nitrite Reductase Gene
CsNiR in Tea Plant
ZHANG Fen，WANG Li-yuan，CHENG Hao*，WEI Kang，HU Juan，ZHANG Cheng-cai，LIU Yuan，
WU Li-yun，and LI Hai-lin
（Tea Research Institute，the Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Center for Tea Improvement，Hangzhou
310008，China）
Abstract：Teanitrite reductase（CsNiR）was cloned by RT-PCR from cDNA isolated from leaves of
cultivar‘Longjing 43’. The complete ORF of the CsNiR was 1 764 bpencoding 587 amino acids.
Alignment of amino acid sequences showed that CsNiR sharing more than 76% similarities to NiR in
Betula pendula，Arabidopsis thaliana，Spinacia oleracea and Oryza sativa. Bioinformatics analysis
indicated that the CsNiR was a hydrophilic non-secretory protein with molecular weight 68.648 kD and
theoretical pI 6.12. Prediction results by InterProScan showed the secondary structure of CsNiR protein
comprised of a hemoprotein beta component and a 4Fe-4S region，and its 3D structure was also predicted


张 芬，王丽鸳，成 浩，韦 康，胡 娟，张成才，刘 圆，吴立赟，李海琳.
茶树亚硝酸还原酶基因 CsNiR 的克隆及表达分析.
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by Swiss Model. qRT-PCR analysis revealed that the expression abundance of CsNiR in mature leaves was
the highest among the three tested tissues（two leaves and a bud，mature leaves and roots）. Meanwhile，
the transcript changes of CsNiR responding to different nitrogen（N）levels were studied by qRT-PCR after
resupplying normal N（1 mmol · L-1 NH4NO3）and low N（0.1 mmol · L-1 NH4NO3）on hydroponic
seedlings of three tea varieties with treatment of two week N starvation. The CsNiR expression levels were
increased significantly in roots at 2 h and 6 h under normal N treatment，but they were changed since 24 h
after N supplied in leaves. Furthermore，the transcription of CsNiR was also different among varieties. The
transcript abundance of CsNiR increased more greatly under the normal N condition compared to those
under low N treatment. Thus，factors like genotypes，tissues，nitrogen levels should be taken into
consideration for the role of CsNiR in nitrogen utilization in tea plants.
Key words：Camellia sinensis；nitrite reductase；cloning；gene expression；nitrogen

茶树是氮肥需求量较高的作物，氮代谢不仅对茶树的生长发育起着重要作用，也与茶叶的产量
和品质有着密切关系。茶树对铵态氮（NH4+）的吸收效率高于硝态氮（NO3-），近几十年茶园施肥
以铵态氮为主。但茶树在吸收铵态氮后，根系会释放大量的 H+，造成了茶园土壤急速酸化（张倩 等，
2011）；且土壤中的硝化微生物能将 NH4+转化为 NO3-，因此，硝态氮也是茶树重要的氮源。研究茶
树硝态氮吸收利用机理，探讨如何协同提高茶树对硝态氮、铵态氮的吸收利用效率，对减少茶园铵
态氮的施用量，增加氮素利用率，减缓茶园土壤酸化等都有重要的指导意义。
NO3-进入植物体后需还原为 NH4+才能参与氨基酸合成蛋白质（孙菲菲，2008）。硝酸盐的同化
主要受到硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NiR）的调控，其中 NR 是 NO3-无机同化的限速酶，
NiR 是关键控制酶，二者偶联完成 NO3-的无机同化（Seith et al.，1991）。细胞质中的硝酸盐是初级
氮同化的起点，May 等（2011）指出，NR 和 NIR 基因的表达和酶活性的调控直接影响着初级氮同
化的过程。周月琴等（2013），克隆了茶树中的 NR 基因并分析了 25 个茶树品种间硝酸还原酶的表
达差异与品种特性之间的关系，但有关茶树亚硝酸还原酶的研究还未见报道。在其他物种中，Lahners
等（1988）克隆和鉴定了玉米的 NiR 基因，Eduard 等（1988）在菠菜的 cDNA 文库中分离了亚硝酸
还原酶的全序列，Andreas 等（1992）克隆并研究了垂枝桦的亚硝酸还原酶，Toshinorl 等（1994）
在拟南芥基因组中发现了 NiR 基因，而随着 NiR 基因在烟草（Kronenberger et al.，1993）、水稻
（Yoshinobu et al.，1995）、白菜（孙菲菲 等，2009）、小麦（佘茂云 等，2011）等物种中的发现，
其在提高植物组培再生能力等功能的应用（Nishimura et al.，2005）逐渐受到了学者们的普遍关注。
本研究中根据茶树根转录组测序获得的唯一 1 个亚硝酸还原酶的 cDNA 全长序列，以‘龙井 43’
叶片为材料，克隆了茶树亚硝酸还原酶基因，分析其编码氨基酸的基本特征，并研究其在不同组织、
不同氮素条件下的表达规律，以期为茶树硝态氮吸收利用机制的探索提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
试验材料为‘中茶 108’，‘中茶 302’和‘龙井 43’。采摘‘龙井 43’幼嫩叶片，迅速转入液氮
中冷冻处理，随后保存于–80 ℃冰箱中用于基因克隆。选用 3 个品种的两年生无性系茶树幼苗水培
于中国农业科学院茶叶研究所日光温室中，营养液配制参照 Ruan 等（2007）的配方。采用小型通
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气泵全天 24 h 通气，以保证根系的通氧量。在茶苗生长稳定长势良好时进行氮饥饿处理两周，随后
分别转入含 1 mmol · L-1 NH4NO3（正常氮素水平）和 0.1 mmol · L-1 NH4NO3（低氮水平）的营养液
中培养，每个处理设 3 个重复，于处理 0、2、6、24、72、120 和 168 h 取样，第 1 次取样时间为上
午 10 点，每 2 天换 1 次营养液，每个时间点取 3 株，分别取叶片和嫩根于蒸馏水中清洗，擦干后转
入液氮中，–80 ℃保存备用。
1.2 基因克隆及序列分析
总RNA的提取和 cDNA的合成：使用RNAprep pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（RNAprep
pure plant kit，天根生化科技有限公司）提取‘龙井 43’叶片总 RNA。琼脂糖凝胶电泳验证 RNA
的完整性，Nanodrop 2000微量核酸定量仪测定RNA的浓度和纯度，经鉴定合格的RNA，使用TaKaRa
cDNA 第一链合成试剂盒将总 RNA 逆转录成 cDNA 备用。
基因 ORF 全长克隆及序列分析：根据茶树转录组测序所得的全长序列，利用 Primer primer 5 软
件在序列 ORF 两端设计引物。正向引物：5′-CAGTGAACAACAATACATACGATAC-3′，反向引物：
5′-TTTGATCTAATCTTCCCTCTCCTTG-3′，产物长度为 1 845 bp；经琼脂糖凝胶鉴定后，将目的基
因片段进行割胶回收（按照 AXYGENAxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒说明书进行），回收产物连接到
大肠杆菌原核载体进行 TA 克隆（按照 TaKaRa pMD18 T Vector 试剂盒说明书进行），并转化大肠杆
菌 DH5α 感受态细胞（天根生化科技有限公司）。进行菌落 PCR 验证之后，挑选 4 个阳性克隆送上
海华津生物科技有限公司测序。
经测序所得的核苷酸序列，通过 Alignment 和 NCBI blast 比对确定测序结果的准确性，利用
DNAstar 软件对序列进行 ORF 查询并推导编码的氨基酸序列；用 ProtParam（http：//web.expasy.org/
protparam/）在线软件计算推导蛋白质的相对分子质量、理论等电点等基本理化性质，使用 NCBI 数
据库中的 Blastp 工具对推导获得的蛋白质序列进行同源性搜索。通过在线工具 Protscale（http：//web.
expasy.org/protscale/）、SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、ProtCompVersion9.0（http：
//linuxl.Softberry.com/berry.phtml）等进行蛋白的亲水性/疏水性、信号肽、亚细胞定位等分析。
1.3 qRT-PCR 检测基因在氮素处理下的相对表达量
总 RNA 的提取和 cDNA 的合成：使用天根 RNAprep pure 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒和
QIAGEN RNeasy Plant Mini kit 总 RNA 提取试剂盒，分别提取茶树叶片和根中的总 RNA，每样本重
复 3 次。以完整性、浓度和纯度鉴定合格的 RNA 为模板，使用天根 FastQuant RT Kit with gDNA Eraser
试剂盒进行反转录成 cDNA 备用。
qRT-PCR 测定基因的相对表达量：利用 NCBI 在线 Primer-blast 设计荧光定量 RT-PCR 特异引物，
正向引物：5′-GCAGAACTGGCAAATACG-3′，反向引物：5′-ACAATCTCAAACGGGTCA-3′，产物
片段长 156 bp；以茶树 GADPH 为内参基因，正向引物：5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′，反向
引物：5′-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3′，产物片段长 206 bp。将反转录的 cDNA 模板稀释至 50
ng · μL-1。使用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqII试剂进行荧光定量RCR检测，反应体系为SYBR Premix
Ex Taq 7.6 μL，上下游引物（10 μmol · L-1）各 0.4 μL，ROXDyeⅡ 0.4 μL，模板 2 μL，加 ddH2O 到
终体积 20 μL。反应在 ABI7500 实时荧光定量 PCR 仪上进行，染料为 SBYR 荧光染料。反应程序：
95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火延伸 34 s，40 个循环；将‘中茶 302’的 0 h 的表达量
设为 1，计算各处理的倍性关系。每生物学重复设置 3 次技术性重复，结果采用 2-ΔΔCT算法来计算。
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图 1 茶树 CsNiR 基因克隆电泳图
Fig. 1 The electrophoresis results of the clone of CsNiR in tea plant
2 结果与分析
2.1 基因克隆及序列分析
2.1.1 基因克隆
以 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整
性，RNA 条带清晰无拖尾现象，说明 RNA 的
完整性良好；测定 RNA 质量，D260/D280 为 1.89，
D260/D280 为 2.13，说明 RNA 纯度合格，可以
用于 cDNA 的合成。以‘龙井 43’叶片 cDNA
为模板，使用特异引物扩增出 1 845 bp 的茶树
NiR 基因的片段（图 1），其中包含完整的 ORF
全长为 1 764 bp。
2.1.2 同源性比对
通过 NCBI 将所得核苷酸序列的 ORF 序列翻译成 587 个氨基酸，并以被子植物为限定条件进行
blastp 搜索 UniProtKB/Swiss-Prot 数据库，下载垂枝桦、拟南芥、菠菜、水稻的 NiR 氨基酸序列进行
同源性比对。如图 2 所示，序列之间具有较高的同源性，其中茶树 NiR 与垂枝桦（Betula pendula，
P38500.1）和拟南芥（Arabidopsis thaliana，Q39161.1）的 NiR 的序列覆盖率达到 100%，序列相似


图 2 不同植物 NiR 氨基酸序列同源性比较
Fig. 2 Alignment of amino acid sequences of NiR among different plants
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性分别为 80%和 77%，与菠菜（Spinacia oleracea，P05314.1）、水稻（Oryza sativa，Q42997.1）NiR
的序列覆盖率达到 92%以上，序列相似性均为 77%；属于铁氧化还原蛋白依赖的亚硝酸还原酶。
2.1.3 蛋白质理化性质分析
通过在线工具 ProtParam 预测了 CsNiR 的基本理化性质，得到其编码的 587 个氨基酸所组成的
蛋白质的分子量为 65.648 kD，原子总数为 9 237，理论等电点 pI 为 6.12，不稳定指数为 39.77，表
示此蛋白是稳定的；平均疏水性值为–0.329，说明茶树亚硝酸酶为亲水性蛋白，与 Protscale 软件预
测结果一致。利用在线分析工具 SignalP 4.1 进行信号肽预测，结果显示没有明显的信号肽序列，说
明此蛋白为非分泌型蛋白。利用 softberry 网站 ProtComp v. 9.0 在线预测蛋白的亚细胞定位，表明此
酶蛋白主要定位在叶绿体上，说明其可能主要存在于叶片中。
2.1.4 蛋白活性位点和二级结构预测
利用 http：//prosite.expasy.org/对茶树亚硝酸还原酶活性位点进行预测，如图 3 所示。茶树 NiR
序列区域的 507 ~ 523 的 TGCpnsCgqvqvaDIGF 为 CsNiR 的主要活性位点，且根据在线软件的预测
标准，可信度水平（Confidence level）为 0，说明预测结果可信。


图 3 CsNiR 酶活性位点分析
Fig. 3 Active site analysis of CsNiR

通过 InterProScan sequence search（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）进行结
构域预测，茶树 NiR 具有完整的 NiR 蛋白结构，含血红素蛋白 β–化合物区域、4Fe-4S 区域以及西
罗血红素结合位点（图 4）。


图 4 CsNiR 蛋白结构域及结合位点预测
Fig. 4 Protein domain and binding site predication of CsNiR
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图 6 茶树 CsNiR 在不同组织间的表达
Fig. 6 The expression levels of CsNiR gene among
different tissues in tea plant
图 5 CsNiR 的三维结构模型
Fig. 5 3D structure model of CsNiR
2.1.5 三维结构模型
根据同源模建的原理，利用 Swiss Model（http：//swissmodel.expasy.org/）得到茶树亚硝酸还原酶
的三维结构模型（图 5），经分析，CsNiR 由 365 个 H-Bonds，33 个 Helices，38 个 Strands 和 53 个 Turns
组成，并含有 1 个钾离子。
2.2 CsNiR 组织表达特性与氮素响应表达规律分析
如图 6 所示，在正常水培条件下，‘龙井 43’茶树扦插苗 CsNiR 在成熟叶片的表达量高于一芽
二叶和根，且在 P0.05 水平上差异显著。


在正常供氮（1 mmol · L-1 NH4NO3）和低氮（0.1 mmol · L-1 NH4NO3）处理下，CsNiR 表达量随
处理时间的延长呈现不同的变化规律。如图 7 所示，在正常供氮下 3 个品种叶片中 CsNiR 基因的相
对表达量均在 24 h 之后开始呈显著增高（P < 0.05），其中‘中茶 302’的升高幅度最为明显；低氮
条件下，‘中茶 302’和‘中茶 108’中 CsNiR 表达量在氮素处理后的 24 h 表现为瞬时诱导，而‘龙
井 43’受诱导时间出现在处理后的 6 h，且升高幅度相对较低。

图 7 不同处理条件下茶树叶片中 CsNiR 基因的相对表达量
Fig. 7 Relative expression of CsNiR gene during different treatment in the leaf of tea plant
P < 0.05.
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如图 8 所示，正常供氮下，根中 CsNiR 表达量在供氮 2 h 时有显著升高，之后下降，直至供氮
72 h 时又开始呈现上升趋势，品种之间的变化规律与叶片中类似，在 3 个品种中，受正常氮素处理
诱导变化最明显的为‘中茶 302’；低氮条件下，基因的表达量受氮素的诱导变化不明显，在供氮 120
h 之后才开始有升高趋势，不同茶树品种间的变化规律也基本相同。


图 8 不同处理条件下茶树根中 CsNiR 基因的相对表达量
Fig. 8 Relative expression of CsNiR gene during different treatment in the root of tea plant
P < 0.05.
3 讨论
本研究中通过对茶树 NiR 基因的克隆，得到编码 587 个氨基酸的茶树亚硝酸还原酶的 cDNA 序
列，对氨基酸序列的分析发现 CsNiR 具有亚硝酸还原酶完整的血红素蛋白 β–化合物区域、4Fe-4S
区域以及西罗血红素结合位点（Uma et al.，2005），氨基酸序列的比对显示其属于铁氧化还原蛋白
依赖的亚硝酸还原酶。在微藻类中，亚硝酸还原酶催化 NO2-还原为 NH4+，是在叶绿体基质中完成
的（Emanuel et al.，2015），而高等植物中，铁氧化还原蛋白依赖的亚硝酸还原酶不仅存在于叶绿体
中，也存在于根等非光合组织中（Hirasawa et al.，1984）。本试验中对茶树 NiR 亚细胞定位的预测
结果显示其主要存在于叶绿体中，而组织表达特性的研究表明，CsNiR 基因在根中也有表达，表达
量虽明显低于成熟叶片但高于一芽二叶。董军美（2011）研究了橡树亚硝酸还原酶及其表达特性，
发现其在叶片中的表达高于根、花等其他组织，证明根中确实存在亚硝酸还原酶基因的表达，与本
研究结果相符。
本试验中，在正常氮素水平（1 mmol · L-1 NH4NO3）下，茶树根中 CsNiR 受氮素的诱导，在供
氮后 2 h 表达量显著升高，表现为短时间瞬时诱导效应；而叶片中表达量的升高，主要发生在供氮
24 h 之后，即受到氮素诱导而变化的时间相对滞后，且受诱导的时间较长，这可能是因为硝酸根首
先是由根部吸收，然后转运至叶片中，才导致了这种差异。低氮处理下（0.1 mmol · L-1 NH4NO3），
CsNiR 表达量的变化幅度不如正常氮素处理明显，说明在低氮肥条件下茶树对硝酸根的还原作用可
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能会相对减弱，即肥料使用量过低可能会降低茶树的生长和产量。在 3 个茶树品种中，受氮素诱导
CsNiR 表达量升高最明显的为‘中茶 302’，这可能与其高产优质、抗逆性强等特性（杨亚军 等，
2011）相符，这预示着不同的茶树品种对肥料的需求不同。综上，本研究表明，3 个茶树品种的 CsNiR
基因表达受到氮素处理诱导的变化表现为，根部变化时间早于叶片，正常氮素水平大于低氮处理，
‘中茶 302’变化幅度大于‘龙井 43’和‘中茶 108’。
植物中 NiR 的酶活性及其基因表达规律会受到各种内在和外在因素的影响，杜永成等（2012）
研究了不同氮肥水平对甜菜 NR 和 NiR 活性、叶绿素含量等的调控，陈龙正等（2009）探讨了不同
光照强度下白菜光合性能与硝酸还原酶活性的关系。而目前亚硝酸还原酶基因表达的研究更多地集
中在氮源的供应上（孙菲菲 等，2009；石晓艳 等，2011），对其他影响因素关注较少。结合前人对
NR 和 NiR 酶活性的研究，关于其它内部因子及外界环境对相关酶基因表达的调控及植物生长的影
响，还需要进一步的验证。

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