全 文 ：园艺学报，2016，43 (7)：1225–1235.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0202；http：//www. ahs. ac. cn 1225
收稿日期：2016–05–05；修回日期：2016–06–30
基金项目：国家重点基础研究发展计划（‘973’）项目（2013CB945103）；国家自然科学基金项目（31272142，31471854）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xfwang2004@163.com；youchunxiang@126.com）
苹果 6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因 Md6PGDH1
的克隆和功能分析
苏 玲，刘 鑫，安建平，李浩浩，赵 锦，郝玉金，王小非*，由春香*
（山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，农业部黄淮地区园艺作物生物学与种质创制重
点实验室，山东泰安 271018）
摘 要：以‘嘎拉’苹果为材料，克隆了 6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因 Md6PGDH1（序列号：
MDP0000279299）全长。序列分析显示，该基因包含一个长为 1 047 bp 完整的开放阅读框，编码 347 个
氨基酸，分子量为 36.430 kD，预测等电点为 9.24。同源性分析表明 Md6PGDH1 还有另外 3 个同源基因；
功能域分析表明 Md6PGDH 蛋白含有两个保守的绑定域；亚细胞预测表明 Md6PGDH 定位存在差异。分
析 Md6PGDH1 启动子发现存在多个响应非生物胁迫的顺式作用元件。定量分析显示，Md6PGDH1 在苹果
的不同组织中都有表达，且受非生物胁迫诱导。原核诱导 Md6PGDH1 蛋白并进行蛋白酶活的测定，为后
续蛋白功能鉴定奠定了基础。Md6PGDH1 在苹果愈伤组织中过量表达，提高其抗盐胁迫的能力。
关键词：苹果；Md6PGDH；表达分析；Md6PGDH1；原核诱导；愈伤组织
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）07-1225-11

Molecular Cloning and Functional Analysis of a 6-phosphoglueonate
Dehydrogenase Gene Md6PGDH1 in Apple
SU Ling，LIU Xin，AN Jian-ping，LI Hao-hao，ZHAO Jin，HAO Yu-jin，WANG Xiao-fei*，and YOU
Chun-xiang*
（College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，State Key Laboratory of Crop
Biology，MOA Key Laboratory of Horticultural Crop Biology（Huanghuai Region）and Germplasm Innovation，Tai’an，
Shandong 271018，China）
Abstract：A 6-phosphoglueonate dehydrogenase gene named Md6PGDH1（MDP0000279299）was
cloned from‘Royal Gala’apple（Malus × domestica Borkh.）. Sequence analysis indicated that the length
of Md6PGDH1 gene was 1 047 bp，which encoded 347 amino acids. It was predicted that the molecular
mass of this protein was 36.430 kD，and pI was 9.24. Homology analysis showed that there were three
other homologous genes；Analysis of functional domain showed that the Md6PGDHs protein included two
conserved binding domains；the prediction of subcellular localization showed that there were differences in
Md6PGDHs protein. In silico analysis suggested that the promoter sequence contained several cis-acting
elements，including abiotic stresses responsive elements and hormone responsive elements. qRT-PCRs
were performed to determine the expression levels of apple Md6PGDH1 in different tissues and in

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Molecular cloning and functional analysis of a 6-phosphoglueonate dehydrogenase gene Md6PGDH1 in apple.
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response to abiotic stresses. Prokaryotic expression and activity assay of the Md6PGDH1，which laid a
foundation for protein function identification. Overexpression of Md6PGDH1 in apple callus increased the
tolerance of transgenic apple callus to high salinity.
Key words：Malus × domestica；Md6PGDH；expression analysis；Md6PGDH1；prokaryotic
expression；callus

植物磷酸戊糖途径是细胞中重要的初生代谢途径（Wood，1986），其主要功能是产生供生物合
成所需的还原剂（力）NADPH，核酸合成所需的戊糖和氨基酸，脂肪酸合成所需的一些中间产物
（Neuhaus & Emes，2000），同时在保持植物细胞的氧化还原平衡方面也起到非常重要的作用（Juhnke
et al.，1996；Esposito et al.，2003）。磷酸戊糖途径发生在细胞质、质体或过氧化物酶体中（Kruger &
von Schaewen，2003；Reumann et al.，2004），包括氧化和非氧化两个阶段。氧化阶段含有两步脱氢
反应，葡萄糖–6–磷酸脱氢酶（G6PDH）和 6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH）是磷酸戊糖途径
中的两个关键酶（Ap Rees，1985）。两步脱氢反应在生理条件下是不可逆的，是整个途径的限速反
应（Dennis & Blakeley，2000）。目前葡萄糖–6–磷酸脱氢酶和 6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶在植物的多
个物种中都有了初步研究。
在 G6PDH 基因表达调控方面的研究表明，基因表达水平或活性在氧化胁迫、病原菌侵入、渗
透胁迫以及离子毒害等环境因子胁迫下有明显的提高（Ślaski et al.，1996；Pugin et al.，1997；Debnam
et al.，2004；Liu et al.，2007；Wang et al.，2008）。目前，在马铃薯（Graeve et al.，1994）、小麦（Nemoto
& Sasakuma，2000）、水稻（Huang et al.，2001）、菠菜（Lendzian & Bassham，1975）和拟南芥（Wakao
& Benning，2005）等物种中都分离到了 G6PDH 基因。另外，在植物生长发育方面，研究较多的是
G6PDH 酶活力与种子萌发、休眠和一些次级代谢产物等的关系。例如在马铃薯中 G6PDH 的活性和
其生长发育相关（Hauschild & von Schaewen，2003）；正常生长条件下，水稻细胞质雄性不育系的
花药和幼穗中的 G6PDH 和 6PGDH 活性均降低，在叶片中则无显著差异（张明永和梁承邺，1998）；
在研究西洋参种子萌发过程中发现呼吸抑制剂 NaN3 可以增加 G6PDH 和 6PGDH 的活性，加速西洋
参种子休眠的解除（赵永华 等，2001）。
6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶作为磷酸戊糖途径中另一个重要的限速酶，它催化 6–磷酸葡萄糖酸脱
氢生成 5–磷酸核酮糖和 CO2，同时伴随 NADP+还原的过程。相对于 G6PDH，6PGDH 在植物中的
研究较少。基因表达方面，在种子萌发及盐、重金属离子毒害和病原菌侵染等环境因子胁迫下，
6PGDH 的表达水平显著增强（Huang et al.，2003；Kishor et al.，2005；Hou et al.，2007）。目前 6PGDH
已在玉米（Bailey & Nguyen，1992）、大豆（Hanks et al.，1983）、苜蓿（Fahrendorf et al.，1995）、
菠菜（Krepinsky et al.，2001）和水稻（Huang et al.，2003）等物种中被研究报道。但是对于 6PGDH
与植物逆境响应方面的研究较少。现在的研究表明，6PGDH 在调节生物代谢产物抵抗外界环境的破
坏中起着重要的作用，可以通过增强糖代谢途径提高作物的抗逆性（Hou et al.，2007）。研究表明，
水稻中的 Os6PGDH1 与稻穗发育密切相关，可能是因为戊糖磷酸途径在幼穗中比较活跃，为幼穗的
发育提供所需的磷酸戊糖和其它一些中间产物（Grivet et al.，2001）。Os6PGDH1 在水稻幼苗中的表
达受高盐、低温、干旱和 ABA 等不同程度诱导，并且在这些非生物胁迫下水稻幼苗中 6PGDH1 酶
活性显著增强，表明 Os6PGDH1 参与并调节植物对非生物胁迫的应答（丁林云，2007）。
在水稻（Huang et al.，2003）、烟草（Knight et al.，2001）与甜瓜（魏跃 等，2009）等植物中
已有 6PGDH 基因的初步研究，但是在果树，特别是苹果等多年生木本植物中尚未见相关研究报道。
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本研究中通过对苹果中 Md6PGDH 的克隆和逆境胁迫下表达响应，并利用转基因愈伤验证其生物学
功能，为提高苹果树对非生物胁迫的抗性提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2013 年 3 月开始，以栽种在山东农业大学园艺科学与工程学院园艺试验站的 5 年生‘嘎拉’苹
果树的生长根、幼茎、新生叶、初生花和花后 30 d 的幼果作为样品，液氮冷冻–80 ℃保存，用于
RNA 提取。
以继代 20 d，生长良好的‘嘎拉’组培苗为材料，分别用 100 mmol · L-1 NaCl、100 μmol · L-1 ABA、
15% PEG、4 ℃处理，取样液氮冷冻，用于 RNA 的提取。
1.2 苹果 Md6PGDH 基因的确定及生物信息学的分析
从蔷薇科基因组（https：//www.rosaceae.org/）中检索并下载对应的苹果 Md6PGDH 的核酸和蛋
白序列。利用 DNAMAN 软件对苹果 Md6PGDHs 蛋白进行序列同源性分析，并将其命名，分析
Md6PGDH 家族基因的功能域（http：//smart.embl-heidelberg.de/）。
1.3 苹果总 RNA 的提取
采用RNA plant plus Reagent试剂盒，利用反转录试剂盒 PrimeScript® RT Reagent Kit（Perfect Real
Time，TaKaRa）获得用于 qRT-PCR 的 cDNA。试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。通过
对苹果基因组中 Md6PGDH 家族基因序列分析，设计定量引物（表 1）。qRT-PCR 参照 Hu 等（2012）
的方法。

表 1 特异引物
Table 1 Specific primers
基因
Gene
上游引物（5′–3′）
Forward primer（5′–3′）
下游引物（5′–3′）
Reverse primer（5′–3′）
Md6PGDH1 AGTCCAAATCCTGCTCAGCT GGCGAAGATCATACCCTCCA
Md6PGDH2 GCGATCAAATGTCCTCCACC GAGTTTGCCTTCTCTAGCGC
Md6PGDH3 TGCGACGTTGTTTTCACCAT AGTTTTCCCTCCCTAGCACC
Md6PGDH4 TCAGGCATGGCTTCAAGGTA CAAACACCACCGAAAGAGCA

1.4 原核表达及酶活性测定
构建表达载体 PET32a-Md6PGDH1，将连接产物转化到大肠杆菌 BL21 质粒中。加入 0.5
mmol · L-1 IPTG 后在 0、6、12 和 18 h 分别取样，诱导产物进行 SDS-PAGE 检测。将 SDS-PAGE 胶
放到考马斯亮蓝溶液中（100 mg 考马斯亮蓝 G-250 溶于 50 mL 95%乙醇中，然后加 100 mL 85%磷
酸，ddH2O 定容至 1 L，过滤后 4 ℃保存），染色 0.5 h 后放入脱色液（ddH2O 200 mL，乙醇 80 mL，
冰醋酸 20 mL）中脱色，拍照。
Md6PGDH1 酶活性测定参照 Šindelář 等（1999）的方法。吸 6 mL 的原核诱导菌液 4 000 r · min-1，
4 ℃离心 4 min，弃上清液，加入 3 mL 含 20 mmol · L-1 Tris-HCl 和 5 mmol · L-1咪唑，pH 为 7.8 的裂解
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图 1 苹果 Md6PGDH1 的 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 PCR amplification result on agarose
gel of Md6PGDH1

缓冲液悬浮；超声波破碎后离心，上清液即酶粗提液。取酶粗提取液 160 μL 加入 40 μL 反应缓冲液
（50 mmol · L-1 Triethanolamine，pH 7.5，5 mmol · L-1 MgCl2，0.18 mmol · L-1 NADP+，1 mmol · L-1
6PG），将总体积为 200 μL 的酶反应混合液于酶标仪（PerkinElmer VICTORTM X4）上进行活性测定
（波长 340 nm，25 ℃，OD 值为 1），每 10 s 观察并记录 1 次吸光值，反应 10 min，以 NADP+ 的减
少来确定 Md6PGDH1 酶的活性，未加菌液的反应缓冲液为对照。
1.5 农杆菌介导的苹果愈伤组织遗传转化
将 Md6PGDH1 序列连接到带有 HA 标签的 T 载体上，参照 Hu 等（2012）的方法进行苹果愈伤
组织的遗传转化。将农杆菌侵染后的愈伤组织转移至抗性培养基（30 mg · L-1 hygromycin B）进行筛
选，继代筛选 3 ~ 5 次后获得稳定生长的抗性愈伤组织，从中提取 RNA，用于定量 PCR 鉴定。
1.6 愈伤组织鲜质量和相对电导率的测定
用电子天平称取愈伤组织在盐处理 21 d 后的质量，即为愈伤组织的鲜质量。
利用浸泡法测定愈伤组织的相对电导率：将愈伤组织用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗 3 次，用
滤纸吸干表面水分，快速称取鲜样 3 份，每份 0.1 g，分别置于 10 mL 去离子水的刻度试管中，盖上
玻璃塞于室温下浸泡 12 h，用相对电导仪（Mettler Toledo Inlab® 738）测定浸提液电导率（R1），然
后沸水浴加热 30 min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导率（R2）。相对电导率（%）=
R1/R2 × 100。
2 结果与分析
2.1 Md6PGDH1 的克隆
以组培苗的 cDNA 为模板，克隆得到了
一个 1 047 bp 大小的含有完整开放阅读码框
的 cDNA 序列（图 1），编码 347 个氨基酸，
分子量为 36.430 kD，预测的等电点为 9.24。
核苷酸 NCBI Conserved Domain Search 分析
发现克隆得到 cDNA 序列。将扩增得到的
cDNA 序列 BLAST 分析发现，该基因与模式
植物拟南芥中 6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶家族
成员 At6PGDH1（At4G29120）高度同源，故
将 其 命 名 为 Md6PGDH1 （ 基 因 序 列 号
MDP0000279299）。
将 Md6PGDH1 编码的氨基酸序列提交至 NCBI 的蛋白序列数据库（http：//blast.ncbi.nlm.
nih.gov/Blast.cgi）进行 Blast 分析。结果显示，在苹果中 Md6PGDH1 存在另外 3 个同源基因，序列
号分别是 MDP0000164478、MDP0000640923 和 MDP0000149834，分别命名为 Md6PGDH2、
Md6PGDH3 和 Md6PGDH4（图 2）。功能分析发现这 4 个基因都含有保守的 6–磷酸葡萄糖酸脱氢
酶的 NAD 绑定域和 3–羟基异丁酸脱氢酶的 NAD 绑定域（图 3）。

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图 2 Md6PGDH1 蛋白的同源性分析
Fig. 2 The phylogenetic relationships of Md6PGDH1

图 3 Md6PGDH1 ~ Md6PGDH4 结构域预测
Fig. 3 Prediction of the conserved domains of
Md6PGDH1–Md6PGDH4









利用 PSORT 和 SoftBerry ProtComp 9.0 进行亚细胞定位预测发现，Md6PGDH1 ~ Md6PGDH4
在细胞质基质、细胞核和线粒体中均有定位，但是它们的主要的定位区域存在差异。Md6PGDH1 主
要定位于细胞外基质和线粒体中，Md6PGDH2 主要定位于细胞质基质和线粒体中，Md6PGDH3 主
要定位于内质网和高尔基体中，Md6PGDH4 主要定位于细胞质基质中（表 2）。

表 2 Md6PGDH1 ~ Md6PGDH4 蛋白的亚细胞定位预测
Table 2 Prediction of the sub-cellular localization of Md6PGDH1–Md6PGDH4 %
蛋白
Protein
细胞质基质
Cytoplasmic
matrix
细胞核
Nuclear
线粒体
Mitochondrial
内质网
Endoplasmic
reticulum
高尔基体
Golgi
液泡
Vacuolar
细胞外基质
Extra cellular
细胞骨架
Cytoskeletal
其他
Others
Md6PGDH1 11.1 11.1 22.2 11.1 11.1 11.1 22.2 0.1
Md6PGDH2 34.8 13.0 47.8 4.3 0.1
Md6PGDH3 11.1 11.1 11.1 44.4 22.2 0.1
Md6PGDH4 60.9 17.4 13.0 4.3 4.4

2.3 Md6PGDH1 启动子顺式作用元件分析
对 Md6PGDH1 上游的启动子序列进行分析，结果如表 3 显示。
Md6PGDH1 启动子序列含有多个抗性相关的响应元件，例如脱落酸响应元件 ABRE，与低温响
应元件 LTR，干旱诱导相关的 MYB 结合位点 MBS 及响应激发子、伤害、病原菌的 W-box。
同时，Md6PGDH1 基因上游的启动子序列中还有一些与植物激素相关的响应元件，例如与茉莉
酸响应元件 CGTCA-motif，乙烯响应元件 ERE，赤霉素响应元件 GARE-motif，生长素响应元件
TGA-box 等。这些植物激素都参与植物的逆境响应过程，进一步说明 Md6PGDH1 基因的功能可能
与植物的抗性反应相关。
此外，Md6PGDH1 基因上游的启动子序列中也含有生长素相关的响应元件，表明 Md6PGDH1
也可能参与生长素响应过程。



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图 4 Md6PGDH1 在苹果不同组织中的表达水平
Fig. 4 Expression of Md6PGDH1 gene in
different tissues of apple
表 3 Md6PGDH1 基因上游调控序列顺式作用元件分析
Table 3 cis-acting regulatory elements in the upstream regulatory sequences of Md6PGDH1
顺式元件名称
cis-element
name
信号序列
cis-element
sequence
功能
Function
起始位点
Start site
终止位点
Termination
site
ABRE


ACGTGGC 与脱落酸响应相关的作用元件
cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness
–137
–110
–132
–71
–64
–131
–103
–127
–66
–57
ARE TGGTTT 厌氧感应所需的顺势调控元件
cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction
–487
–408
–284
–224
–136
–482
–403
–279
–219
–131
Box-W1 TTGACC 真菌诱导子响应元件 Fungal elicitor responsive element –347
–332
–342
–327
CGTCA-motif CGTCA 与茉莉酸响应相关的作用元件
cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
–320 –315
ERE ATTTCAAA 乙烯响应元件 Ethylene-responsive element –495 –488
GARE-motif TCTGTT 赤霉素响应元件 Gibberellin-responsive element –1 220
–404
–1 214
–398
LTR CCGAAA 与低温响应相关的作用元件
cis-acting element involved in low-temperature responsiveness
–195 –190

MBS CAACTG 与干旱诱导相关的 MYB 绑定位点
MYB binding site involved in drought-inducibility
–149 –144
TGA-box TGACGTGGC 部分的生长素响应元件 Part of an auxin-responsive element –1 252
–745
–313
–47
–1 243
–736
–304
–38
circadian CAANNNNATC 与昼夜节律相关的作用元件 cis-acting regulatory element involved in circadian control –254 –244

2.4 Md6PGDH1 在不同组织中的表达
荧光实时定量 PCR 分析表明，Md6PGDH1
在‘嘎拉’苹果的根、茎、叶、花和果实中均
有表达，在茎中表达量最高，在根中相对较低,
说明该基因具有一定的组织特异性（图 4）。
2.5 Md6PGDH1 的非生物胁迫响应
‘嘎拉’苹果植株在盐胁迫处理条件下，
Md6GPDH1 的表达受到不同程度的诱导，并
且表达模式呈现先上升后下降的趋势，在处
理 2 h 后即可检测到明显上调，6 h 时表达量
达到最高，随着时间的延长表达量虽然有所下降，但是仍高于对照（图 5）。
在 ABA 处理条件下 Md6PGDH1 的表达受到诱导而上调，12 h 表达量达最高，之后下降（图 5）。
在 PEG 处理下，Md6PGDH1 的表达量在 6 h 上调，之后下降（图 5）。
在低温（4 ℃）处理下，Md6PGDH1 呈现先上升后下降的趋势，并且在 12 h 处理后表达量相
对于其他时间处理后达到最高，随后下降（图 5）。
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图 5 盐、ABA、PEG 处理和低温胁迫条件下 Md6PGDH1 的表达水平
Fig. 5 Expression of Md6PGDH1 gene in response to high salinity，ABA and PEG treatment，cold stress

2.6 Md6PGDH1 蛋白的原核诱导表达和酶活测定
为了进一步研究 Md6PGDH1 是否具有响应的酶活性，构建 Md6PGDH1 的原核表达载体，进行
原核诱导后，经 SDS-PAGE 凝胶电泳检测。考马斯亮蓝染色后发现有大约 55 kD 的条带，包含 His
标签的载体序列大小为 20 kD 左右，所以诱导蛋白的实际大小约为 35 kD，这与 Md6PGDH1 预测蛋
白的大小（34.3 kD）接近（图 6）。
以原核诱导的 His-Md6PGDH1 为粗酶提取液，加入反应缓冲液进行 Md6PGDH1 融合蛋白的酶
活性测定。由曲线斜率计算得到细菌蛋白的相对活性，结果表明，原核诱导的 Md6PGDH1 融合蛋
白相对酶活性明显高于空载体细菌的相对酶活性（图 7）。

图 7 PET32a-Md6PGDH1 的酶活性分析
Fig. 7 Activity assay of the PET32a-Md6PGDH1
图 6 PET32-Md6PGDH1 的原核诱导表达
Fig. 6 Prokaryotic expression of the PET32-Md6PGDH1
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图 8 实时定量 RT-PCR 检测野生型（WT）和 Md6PGDH1 过量
表达（Md6PGDH1-OX）愈伤组织
Fig. 8 Identification of Md6PGDH1 expression in wild type
（WT）overexpression transgenic calluses（Md6PGDH1-OX）
by real-time quantitative PCR
2.7 在苹果愈伤组织中过量表达 Md6PGDH1 提高盐胁迫抗性
构建 Md6PGDH1 的过表达载体，转入愈
伤组织中，用定量 PCR 检测 Md6PGDH1 的表
达量，确定Md6PGDH1转入愈伤组织中（图8）。
用不同盐浓度的培养基处理野生型（WT）
和 Md6PGDH1 过表达（Md6PGDH1-OX）的
愈伤组织，培养 21 d 后观察表型。结果显示，
WT 和 Md6PGDH1-OX 愈伤组织在未加入盐的
对照培养基上长势基本一致，生长较好，但随
着盐浓度的增加，长势越来越差。100 mmol · L-1
NaCl 处理时，Md6PGDH1-OX 愈伤组织的长势
明显优于对照（图 9），说明过表达 Md6PGDH1
提高了苹果愈伤组织抵抗盐胁迫的能力。

图 9 WT 和 Md6PGDH1-OX 愈伤组织在 NaCl 处理 21 d 后的生长状态
Fig. 9 Growth status of WT and Md6PGDH1-OX calluses under NaCl stress after 21 days

WT 和 Md6PGDH1-OX 的愈伤组织鲜质量相差不大，而在加入 100 mmol · L-1 NaCl 的培养基中
过表达 Md6PGDH1 的长势明显好于野生型（图 10）。另外，盐处理条件下，Md6PGDH1-OX 的愈伤
愈伤组织的相对电导率低于野生型（图 10）。

图 10 盐胁迫条件下 WT 和 Md6PGDH1-OX 愈伤组织的鲜质量和相对电导率
Fig. 10 Fresh weight and relative electronic conductivity of WT and Md6PGDH1-OX calluses under NaCl stress
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3 讨论
在环境胁迫条件下，磷酸戊糖途径产生的一些中间产物参与一些合成代谢或是胁迫环境下的解
毒反应等。磷酸戊糖途径与糖酵解途径及三羧酸循环一样，对植物生长发育及代谢反应具有同等重
要的作用，分析磷酸戊糖途径的发生与该路径中关键酶基因的功能对作物的胁迫应答研究意义深远。
本研究中从苹果果实中分离克隆了 1 个 6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因，将其命名为 Md6PGDH1。
这是首次在苹果中克隆到 6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因。同源性分析发现它是拟南芥 6–磷酸葡萄糖
酸脱氢酶家族蛋白的同源基因，结构域分析发现它也含有 6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶的 NAD 绑定域，
上述结果也表明 Md6PGDH1 属于苹果 6PGDH 基因和命名的合理性。同源性和结构域分析还发现在
苹果中 Md6PGDH1 存在另外的 3 个高度同源基因，暗示它们之间可能存在功能冗余性。
大多数研究认为植物戊糖磷酸途径发生在质体的基质中，也有研究认为发生在细胞质中（潘瑞
炽和董愚得，1995）。植物中 6PGDH 存在细胞质 6PGDH（cytosolic 6PGDH）和质体 6PGDH（plastidic
6PGDH）两种形式，其中质体 6PGDH 氨基酸的 N 端显著长于细胞质 6PGDH，编码 1 个转运肽（transit
peptide）序列（黄骥 等，2004；Spielbauer et al.，2013）。Md6PGDH1、Md6PGDH3 的结构域分析
显示其除了含有 6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶的 NAD 绑定域外，N 端还存在 1 个转运肽，由此推测它们
是质体 6PGDH。而 Md6PGDH2、Md6PGDH4 的 N 端不存在转运肽，说明它们是胞质 6PGDH。明
确 Md6PGDHs 蛋白在细胞内的位置，将有助于研究 Md6PGDHs 蛋白的功能。
启动子是基因转录水平上重要的调控元件，在时间及空间上对基因的表达进行严格的调控。通
过对启动子顺式作用元件预测可以作为了解启动子的生物学功能以及研究基因的表达调控的新策
略。利用软件对 Md6PGDH1 的启动子分析，Md6PGDH1 启动子区域含有 ABA 应答元件 ABRE
（Narusaka et al.，2003）、MYB 绑定元件（Prouse & Campbell，2012）、LTR（Maruyama et al.，2012）、
W-box（Liu et al.，2016），可能参与干旱、低温、创伤等非生物胁迫应答反应，这与前人对水稻
Os6PGDH1 启动子的预测（丁林云，2007）一致。另外还发现 Md6PGDH1 的启动子上含有激素相
关的作用元件，这是在之前相关研究中没有报道的。因此，通过对苹果 Md6PGDH1 启动子的研究，
对于了解 Md6PGDH1 基因的功能有一定的指导意义。
已有的研究证明，Os6PGDH1 的转录水平受高盐、低温、干旱和 ABA 等非生物胁迫的诱导（Hou
et al.，2007）。本研究中也发现，Md6PGDH1 也受到这些非生物胁迫不同程度的诱导，与前人的研究
结果一致。原核诱导表达 Md6PGDH1 的融合蛋白，融合蛋白 6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性明显上升，
暗示 Md6PGDH1 具有相关酶的活性，同时，在苹果愈伤组织中过量表达 Md6PGDH1，能够提高苹
果愈伤组织的抗盐性，表明 Md6PGDH1 在苹果逆境响应过程中具有特定的生物学功能。以上结果
为进一步解析 Md6PGDH1 基因的功能提供了理论依据。本试验中所得到的结果对苹果中磷酸戊糖
途径中相关基因的表达调控和非生物胁迫相关性的研究奠定了基础，有利于进一步揭示磷酸戊糖途
径在苹果等果树中的功能。
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