全 文 ：园艺学报，2016，43 (3)：409–418.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0830；http：//www. ahs. ac. cn 409
收稿日期：2016–01–12；修回日期：2016–03–04
基金项目：国家重点基础研究发展计划（‘973’）项目（2013CB945103）；国家自然科学基金项目（31272142，31471854）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xfwang2004@163.com；youchunxiang@126.com）
苹果乙烯信号转导相关基因 MdEIL1 的克隆及
功能鉴定
苏 玲，王淑惠，郝玉金，王小非*，由春香*
（山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，农业部黄淮地区园艺作物生物学与种质创制重
点实验室，山东泰安 271018）
摘 要：以苹果‘嘎拉’（Malus × domestic‘Royal Gala’）为试材，分离了乙烯信号转导相关的 MdEIL1
基因（基因序列号：MDP0000423881）。序列分析表明，该基因包含长为 1 980 bp 完整的开放阅读框，编
码 658 个氨基酸的蛋白。进化树分析表明 MdEIL1 属于 EIN3/EIL 转录因子家族蛋白。定量分析显示，
MdEIL1 基因在苹果的根、茎、叶、花和果实中有不同程度的表达，而且它的表达也受到乙烯、生长素和
细胞分裂素的诱导。通过原核表达试验体外诱导 MdEIL1 蛋白成功，为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。
MdEIL1 基因在拟南芥中异位表达，增强其乙烯响应，在暗处表现为下胚轴变短，并且 AtERF1 的表达量
上升，显示转基因植株对乙烯的敏感性提高。
关键词：苹果；MdEIL1；表达分析；原核表达；功能鉴定
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）03-0409-10

Molecular Cloning and Functional Characterization of the Ethylene
Signaling Related Gene MdEIL1 in Apple
SU Ling，WANG Shu-hui，HAO Yu-jin，WANG Xiao-fei*，and YOU Chun-xiang*
（College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，State Key Laboratory of Crop
Biology，MOA Key Laboratory of Horticultural Crop Biology（Huanghuai Region）and Germplasm Innovation，Tai’an，
Shandong 271018，China）
Abstract：An ethylene signal relative transcription factor named MdEIL1 was cloned from Malus ×
domestic‘Royal Gala’. Sequence analysis showed that MdEIL1 contained 1 980 nucleotides，which encoded
a protein containing 658 amino acids. Phylogenetic tree analysis showed that MdEIL1 belonged to EIN3/EIL
transcription factor family proteins. qRT-PCRs analysis indicated that MdEIL1 has different levels of
expression in apple’s roots，stems，leaves，flowers and fruits，and was induced by ethylene，auxin and
cytokinin hormones hormones in plants. We obtained the recombinant MdEIL1 protein by Prokaryotic
expression，which was essential for protein functional identification in vitro. Ectopic expression of
MdEIL1 in Arabidopsis can partially enhance ethylene response，which exhibited the short hypocotyl in
darkness and expression of AtERF1 was improved in the MdEIL1 overexpressing transgenic lines.
Key words：apple；MdEIL1；expression analysis；prokaryotic expression；functional identification

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Molecular cloning and functional characterization of the ethylene signaling related gene MdEIL1 in apple.
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乙烯的功能涉及调控植物的生长发育，如种子萌发、细胞伸长、叶片衰老、生殖、果实成熟、
衰老等（Abeles & Biles，1991；Bleecker & Kende，2000；Barry & Giovannoni，2007；Lin et al.，2009），
同时也可响应外界环境的生物和非生物胁迫（Yang & Hoffman，1984；Johnson & Ecker，1998）。
随着乙烯信号转导途径研究的逐步深入，在模式植物拟南芥中逐渐建立起乙烯信号转导的线性
模型：乙烯首先被膜受体蛋白 ETR1 等感知（Hua & Meyerowitz，1998；Hua et al.，1998；Chen et al.，
2002），进而通过一系列的信号转导过程，最终将信号传递到细胞核内并激活相应转录因子，诱导下
游基因的表达，从而完成乙烯响应（Chao et al.，1997；Qiao et al.，2009）。其中，EIN3/EIL1 作为
乙烯信号转导过程中的重要转录因子，其功能解析和调控机理的研究一直受到研究者们的关注。
EIN3/EIL1 蛋白的稳定性对乙烯信号转导过程有着重要作用。当乙烯缺乏时，EIN3/EIL1 可被
Skp、Cullin、F-box 和 EBF1/2 复合体泛素化降解（Guo & Ecker，2003；Potuschak et al.，2003；Gagne
et al.，2004）。乙烯存在时，EBF1/2 被 EIN5 降解，阻碍了 EBF1/2 对 EIN3/EIL1 的降解，因而促进
了 EIN3/EIL1 蛋白稳定性与蛋白积累，EIN3/EIL1 可以与下游基因 ERF1 等启动子相结合，启动 ERF1
基因表达，使植物完成对乙烯的响应（Chen et al.，2005）。EIN3/EIL1 不仅是乙烯信号途径中重要
的正调控因子，而且是乙烯信号与其他信号途径相互作用的节点。通过与其他信号途径相关蛋白的
互作，将其他信号途径与乙烯信号串联起来（Binder et al.，2004；Boutrot et al.，2010；Zhu et al.，
2011）。比如，EIN3 与 JAZ 和 MYC 蛋白互作参与茉莉酸信号途径（Zhu et al.，2011），与 FIT 蛋白
互作调控金属铁离子的吸收（Lingam et al.，2011），与 FLS2 蛋白互作调控植物免疫应答（Boutrot et
al.，2010），与 PIF 蛋白互作影响光信号途径（Zhong et al.，2012）和光氧化反应（Zhong et al.，2009）
等，通过抑制 CBF 基因的表达负调控植物耐寒性（Shi et al.，2012）。过量表达 EIN3/EIL1 可以提高
植物的乙烯响应，如三重反应和植株的提前衰老现象等（Grbic & Bleecker，1995）。而在番茄中，
过表达 LeEILs 促进番茄果实的成熟（Klee & Giovannoni，2011）。
在拟南芥、小麦、番茄等一年生植物中对 EIN3/EIL1 转录因子已有相对深入的研究，但是在果
树，特别是苹果等多年生木本植物中相关研究报道还比较少。本研究中利用生物信息学的手段，通
过基因表达响应分析及转基因表型鉴定等方法，对 MdEIL1 基因的蛋白结构、环境响应以及生物学
功能进行了分析与鉴定，为进一步深入研究其在苹果中的功能奠定了理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料及其处理
2013 年 3 月开始，以栽种在山东农业大学园艺科学与工程学院园艺试验站的 5 年生‘嘎拉’苹
果树的生长根、幼茎、新生叶、初生花和花后 30 d 的幼果作为样品，液氮冷冻，–80 ℃保存，用于
RNA 提取。
以培养 20 d 的‘嘎拉’组培苗为试材，分别用加入 100 μmol · L-1 ACC（1–氨基环丙烷 1–羧
酸）、100 μmol · L-1 6-BA（细胞分裂素）、100 μmol · L-1 IAA（吲哚乙酸）、50 μmol · L-1 MeJA（茉莉
酸甲酯）的继代培养基处理样品，取处理 0、1、3、6 和 12 h 后的样品液氮冷冻，用于 RNA 的提取。
1.2 MdEIL1 的克隆与同源性分析
根据在苹果基因组数据库中检索到的序列，设计引物 MdEIL1-F：5′-ATGGTGATCTTTGAGGAG
TTAGG-3′和 MdEIL1-R：5′-TCATGGGAACCAGGGGTCTT-3′，以‘嘎拉’组培苗的 cDNA 为模板
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进行 PCR 扩增。PCR 扩增反应条件：95 ℃ 预变性 10 min；95 ℃变性 40 s，56 ℃ 退火 40 s，72 ℃
延伸 2 min，36 次循环；72 ℃后延伸 2 min。PCR 产物用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳并回收目的条
带，连接到 pMD18-T 克隆载体进行测序。
根据扩增到的 DNA 序列，从 NCBI 数据库（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）中检索并下载对
应的其他物种的核酸和蛋白序列。MdEIL1 氨基酸序列比对利用 DNAMAN 软件进行。通过 MEGA6.0
软件构建 Neighbor-Joining 系统进化树。
1.3 MdEIL1 表达分析
拟南芥总 DNA 的提取使用植物基因组 DNA 试剂盒；苹果和拟南芥总 RNA 的提取采用 RNA
plant plus Reagent 试剂盒；利用反转录试剂盒 PrimeScript® RT reagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa）
获得用于 qRT-PCR 的 cDNA。以上试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司。
采用 qRT-PCR 技术对苹果不同组织和器官的及经过 ACC、MeJA、CTK、IAA 处理后的‘嘎拉’
组培苗中 MdEIL1 的表达情况进行分析。通过对 MdEIL1 的 DNA 和 CDS 序列分析，设计特异定量
引物 MdEIL1-For1：5′-CTGCAATCCACCCCAAAGAC-3′，MdEIL1-Rev1：5′-CACCAACCTTCCAAG
CCTTC-3′和内参引物 18S rRNA F：5′-GGGTTCGATTCCGGAGAGG-3′，18S rRNA R：5′-CCGTGTCA
GGATTGGGTAAT-3′。PCR 扩增反应条件：95 ℃预变性 10 min，95 ℃变性 15 s，56 ℃退火 15 s，
65 ℃延伸 10 s，40 次循环，每次循环第 3 步进行荧光采集。最后采用 2-∆∆CT 法进行定量数据分析。
1.4 原核表达
用引物 MdEIL1-For：5′-GGATCCATGGTGATCTTTGAGGAGTTAGG-3′和 MdEIL1-Rev：5′-CCC
GGGTCATGGGAACCAGGGGTC-3′扩增 MdEIL1 的序列，之后连接到 pMD18-T 载体上。分别利用
BamHⅠ和 SmaⅠ酶对克隆载体和原核表达载体 pET32a进行双酶切，构建表达载体 pET32a-MdEIL1，
将连接产物转化到大肠杆菌 BL21 质粒中。37 ℃液体培养表达载体 pET32a-MdEIL1 中加入 0.5
mmol · L-1 IPTG 后在 0、1、3 和 6 h 分别取样，诱导产物再进行 SDS-PAGE 胶检测。将 SDS-PAGE
胶放到考马斯亮蓝溶液（100 mg 考马斯亮蓝 G-250 溶于 50 mL 95%乙醇中，然后加 100 mL 85%磷
酸，ddH2O 定容至 1 L，过滤后 4 ℃保存）中，染色 0.5 h 后，放入脱色液（ddH2O 200 mL，乙醇
80 mL，冰醋酸 20 mL）中脱色，拍照。
1.5 农杆菌介导的拟南芥转化和筛选
将 MdEIL1 序列连接到带有 HA 标签的 T 载体上，参照农杆菌转染拟南芥（Bechtold et al.，1993）
的方法得到拟南芥种子。种子消毒（70%的乙醇消毒 1 min，2.6%的 NaClO 消毒 10 min）后平铺到
含有 30 mg · L-1 hygromycin B 的 MS 培养基上筛选，得到抗性苗。提取抗性苗的 DNA 并检测，筛选
含有阳性克隆的植株。收集含有阳性克隆的植株的 T2 代种子继续在抗性（30 mg · L-1 hygromycin B）
的培养基上筛选，获得纯合转基因植株。
1.6 拟南芥下胚轴表型鉴定
种植转基因拟南芥种子得到 T3 代，并进行纯合体筛选，然后将纯合的转基因及野生型拟南芥
种子进行消毒处理，平铺到 MS 培养基上，春化 2 ~ 4 d，放于暗处竖直培养。处理 10 d 后，观察各
个株系的下胚轴表型。
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图 1 苹果 MdEIL1 的 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 PCR amplification result on agarose gel of MdEIL1
2 结果与分析
2.1 MdEIL1 cDNA 的克隆和序列分析
以‘嘎拉’组培苗的 cDNA 为模板，克隆
得到一个大约 2 000 bp 的条带（图 1）。目的条
带回收测序分析是苹果的 MdEIL1 基因（基因
序列号 MDP0000423881）。序列分析发现，苹
果 MdEIL1 含有 1 980 bp 的完整开放阅读框，
编码 658 个氨基酸，预测其蛋白为 74.3 kD。
2.2 MdEIL1 编码氨基酸的同源性分析
蛋白同源比对分析显示，MdEIL1 含有典
型的 EIN3 结构域，与拟南芥 EIN3 蛋白结构域
类似，属于 EIL 家族成员（图 2）。EIN3 蛋白
结构域分析表明其在物种间具有高度保守性。

图 2 MdEIL1 基因的推测氨基酸序列与其他植物 EIL1 蛋白的多序列比对
MdEIL1：苹果（MDP0000423881）；PyEIL1：白梨（XP_009341360.1）；AtEIL1：拟南芥（At2g27050）。
Fig. 2 Alignments of the MdEIL1 deduced amino acid sequences with other EIL1 proteins from plants
MdEIL1：Malus × domestica（MDP0000423881）；PyEIL1：Pyrus × bretschneideri（XP_009341360.1）；
AtEIL1：Arabidopsis thaliana（At2g27050）.
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图 4 实时定量 PCR 检测 MdEIL1 在‘嘎拉’
苹果不同组织中的表达
Fig. 4 Expression analysis of MdEIL1 gene in different apple
tissues with qRT-PCR
MdEIL1 的 C 末端与拟南芥保守性很低，但仍有少数氨基酸序列表现为高度保守（图 2）。
MdEIL1 氨基酸序列 NCBI Blast 分析发现，MdEIL1 氨基酸与白梨的 ETHYLENE INSENSITIVE-like 1
相似性最高。同源性分析也表明，MdEIL1 蛋白同白梨 PyEIL1 蛋白的同源性也是最高（82%），它
们在 EIL1 结构域处高度保守，推断 MdEIL1 是具有生物功能的 EIL1 类似基因。
2.3 MdEIL1 系统进化分析
为了确认 MdEIL1 与 EIL 家族间同源关系，利用来自其他物种的 13 个 EILs 和 MdEIL1 蛋白构
建了系统进化树，探讨 MdEIL1 与它们之间的系统进化关系，结果表明：苹果 MdEIL1 与白梨
（XP_009341360.1）、枇杷（ACM89299.1）、碧桃（ABK35086.1）、梅（XP_008231880.1）、川桑
（XP_010106128.1）和葡萄（XP_002276380.1）的同源性较高，分别为 82.72%、77.98%、75.58%、
73.17%、66.07%和 66.78%，说明它们具有较近的亲缘关系（图 3）。
















图 3 苹果 MdEIL1 与其他物种 EIL 转录因子家族蛋白的系统进化分析
进化树中的数值代表分支长度。
Fig. 3 Phylogenetic relationship among EIL1 and EIL transcription factor family proteins
The value of the phylogenetic tree represents branch lengths.
2.4 MdEIL1 在‘嘎拉’苹果组织中的表达
采用 qRT-PCR 分析 MdEIL1 在不同组织与
器官中的表达情况。结果显示，MdEIL1 在叶
片和果肉中有很高的表达水平，在根和茎也有
较高的表达水平，但是在花和果皮中表达量相
对较低（图 4）。
2.5 MdEIL1 对各种激素的表达响应分析
用 MdEIL1-For1/Rev1 引物进行 qRT-PCR
分析，结果表明，在 ACC、CTK、IAA 处理时，
MdEIL1 的表达量随着时间的延长表达量明显
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升高。而在 MeJA 处理时，MdEIL1 的表达量基本没变化（图 5），这表明乙烯、细胞分裂素、生长
素上调 MdEIL1 的表达水平，而茉莉酸不影响 MdEIL1 的表达。而在拟南芥中茉莉酸信号影响
EIN3/EIL1 的蛋白稳定性（Zhu et al.，2011），暗示苹果中茉莉酸信号对 MdEIL1 的调控也可能是转
录后调控。

图 5 实时定量 PCR 检测 MdEIL1 对 ACC、IAA、CTK 和 MeJA 的响应
Fig. 5 Expression analysis of MdEIL1 gene in response to ACC，IAA，CTK and MeJA with qRT-PCR

2.6 MdEIL1 蛋白的原核诱导表达
构建 MdEIL1 的原核表达载体，进行原核诱导后，经 SDS-PAGE 凝胶电泳检测。考马斯亮蓝染
色后发现有大约 100 kD 的条带（图 6）。由于 His 标签大小为 25 kD 左右，所以诱导蛋白的实际大
小约为 75 kD，这与 MdEIL1 预测蛋白的大小（74.3 kD）接近。


图 6 MdEIL1 蛋白的原核表达
Fig. 6 Prokaryotic expression of the MdEIL1 protein
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图 7 转基因拟南芥株系（ox）的半定量 PCR 鉴定
Fig. 7 Identification of transgenic Arabidopsis（ox）by
semi-quantitative PCR
图 8 实时定量 PCR 检测 AtERF1 表达量
Fig. 8 Expression analysis of AtERF1 gene with
real-time qRT-PCR
2.7 MdEIL1 在拟南芥中异位表达的表型鉴定
构建 MdEIL1 的过表达载体，转入拟南芥中，半定量检测 MdEIL1 的表达量，确定 MdEIL1 转入
拟南芥中（图 7）。有研究表明，在黑暗条件下乙烯通过 AtEIN3/EIL1 调控 AtERF1 基因的表达，进
而调控下胚轴的长度（Zhong et al.，2012）。为了研究异位表达 MdEIL1 拟南芥下胚轴表型，将发芽
的野生型与转基因植株在暗处培养 3 d 后，检测 AtERF1 表达与下胚轴长度变化，结果表明 AtERF1
的表达量上调（图 8），MdEIL1 过表达拟南芥下胚轴长度变短（图 9）。











图 9 野生型（Col）和 MdEIL1 转基因拟南芥幼苗（ox）下胚轴的表型鉴定
Fig. 9 Functional identification of wild type（Col）and MdEIL1 transgenic
Arabidopsis（ox）seedling hypocotyl phenotype
3 讨论
前人的研究表明，在拟南芥 ein3 突变体中，表现乙烯信号的三重反应现象消失，并且乙烯依赖
的基因表达下降，这表明了 EIN3/EIL1 是乙烯信号转导途径中一个必需因子（Chao et al.，1997）。
高等植物的 EIN3/EILs 位于细胞核，且氨基酸序列 N 端具有高度保守性；C 端的保守性较低（Yokotani
et al.，2003）。本研究中，通过氨基酸序列比对，发现克隆得到的 MdEIL1 的 N 端序列的高度保守，
C 端的保守性很低，这与其他物种中 EILs 的序列存在相似性。最近的研究表明，白梨中的 EIL 也参
与到果实的采后品质变化（Kubo，2015）。进化树分析表明，苹果中 MdEIL1 与白梨、梅、碧桃、
水稻、葡萄等物种的 EIN3/EIL1 具有较高同源性，而且与白梨中的 EIL 进化关系最为接近，这表明
MdEIL1 可能与白梨中的 EIL 具有类似功能。
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早期研究表明，不同高等植物中，EILs 几乎在所检测的组织中都有表达，但是其表达水平和方
式存在差异。Waki 等（2001）利用 Northern 杂交技术检测到盛花期时香石竹 DC-EIL1 在茎、叶、
花瓣、花柱和子房等组织中都有表达，其中茎和子房中表达量较高；烟草 NtEILs 在根、茎、叶和花
中也都有表达，且在根、茎的表达量相对较高（Kosugi & Ohashi，2000；Rieu et al.，2003）。近期
的研究表明牡丹和黄瓜中 EIN3/EIL1 基因也表现为组成型表达模式（Bie et al.，2013；Wang et al.，
2013）。本研究中也检测到 MdEIL1 在根、茎、叶、花和果实中都有表达，而叶和果肉中相对表达量
较高。另外，发现乙烯合成前体处理时，随着处理时间的延长，MdEIL1 的表达量也呈上升趋势，
说明乙烯影响 MdEIL1 的转录水平。
乙烯可以与其他激素协同调节植物的生长和发育（Van de Poel et al.，2015）。例如拟南芥中与细
胞分裂素、生长素、共同调控根尖分生组织的增殖（Swarup et al.，2007；Street et al.，2015）；与赤
霉素协同调控顶端弯钩的形成（Mazzella et al.，2014）；水芹中与生长素、茉莉酸共同调控种子发芽
（Arc et al.，2013；Corbineau et al.，2013）。本研究中发现细胞分裂素、生长素能够诱导 MdEIL1
的表达，而茉莉酸对 MdEIL1 表达的诱导不明显。前人研究发现，JAZs 可以与 AtEIN3/EIL1 互作调
节下游信号进而影响乙烯信号的表达（Zhu et al.，2011）。通过对 Me-JA 处理后的组培苗分析，发
现 JAZ 对乙烯信号的影响可能是通过影响 EIN3-Like 蛋白的转录活性进而影响下游基因的表达，而
不是影响其基因表达水平。EIN3/EIL 作为一类植物中广泛存在的转录因子家族，它既可以绑定到下
游基因的启动子上调控下游基因的表达，也可以通过与其他蛋白互作，进而调控植物的生长发育或
抗逆性。最近有研究表明玫瑰中 RhEIN3-3 蛋白绑定到 RhGAI1 基因的启动子上可调节玫瑰花瓣细
胞扩张（Luo et al.，2013），EIN3/EIL1 与 MYC2 互作调控拟南芥顶端弯钩的形成（Song et al.，2014）。
原核诱导 MdEIL1，对下一步研究苹果中 MdEIL1 蛋白的下游靶基因及互作蛋白的确定奠定了基础。
MdEIL1 异位表达拟南芥，暗处理时发现转基因植株与野生型相比，有明显的下胚轴抑制状况，
这与过表达 AtEIN3/EIL1 的拟南芥表型是一致的。之前有研究表明，在黑暗情况下乙烯通过
AtEIN3/EIL1 调控 AtERF1 基因的表达进而调控下胚轴长度（Zhong et al.，2012）。本研究中也检测
了下游基因 AtERF1 的表达量，发现转基因植株中 AtERF1 的表达量相比之下也是上升的。证明苹果
中 MdEIL1 基因参与到乙烯信号响应过程。另外，以前的研究也发现，拟南芥中 EIN3/EIL1 调控叶
片衰老（Qiu et al.，2015）、耐盐性（Li et al.，2015）等，番茄中 EIL1 调控果实的成熟（Kevany et al.，
2007；Klee & Giovannoni，2011），这都为进一步研究苹果中乙烯信号转导的分子机制和 MdEIL1 功
能指明了方向。

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