全 文 ：园艺学报，2015，42 (2)：280–288.
Acta Horticulturae Sinica
280 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0807；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2014–10–17；修回日期：2014–12–29
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-10）；福建省财政专项——福建省农业科学院科技创新团队项目
（CXTD-1-1301）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：tanghao918@sohu.com；25273531@qq.com）
马铃薯 5 种病毒多重 PCR 检测技术的建立及应
用
罗文彬，李华伟，汤 浩*，邱思鑫*，纪荣昌，许泳清，刘中华，邱永祥
（福建省农业科学院作物研究所，农业部闽台农作物种质资源利用重点开放实验室，福州 350003）
摘 要：采用多重 RT-PCR 方法，建立可同时检测马铃薯 X 病毒（PVX）、马铃薯 M 病毒（PVM）、
马铃薯 Y 病毒（PVY）、马铃薯 A 病毒（PVA）和马铃薯 S 病毒（PVS）的方法。根据 GenBank 中 PVX、
PVM、PVY、PVA 及 PVS（CP）基因序列设计特异引物，对多重 RT-PCR 退火温度、循环次数、延伸温
度、引物组合浓度进行优化，建立了能同时检测 5 种马铃薯病毒的多重 RT-PCR 方法。该方法能同时扩增
出 PVX、PVM、PVY、PVA 及 PVS 特异片段，其大小分别是 138、213、369、468 和 657 bp。测序结果
表明，5 种病毒的序列与相应参考序列相似性达到 97%以上。灵敏度分析结果表明，多重 RT-PCR 方法能
够检测植物组织量为 10-3 mg。应用建立的多重 RT-PCR 检测方法对田间样品和组培苗进行检测，结果显
示，该方法可以准确、快速、灵敏地同时检测单一或复合侵染的 5 种马铃薯病毒。
关键词：马铃薯；病毒；检测方法；多重 RT-PCR
中图分类号：S 532 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）02-0280-09

Establishment and Application of Multiplex PCR Rapid Detection of Potato
Viruses
LUO Wen-bin，LI Hua-wei，TANG Hao*，QIU Si-xin*，JI Rong-chang，XU Yong-qing，LIU Zhong-hua，
and QIU Yong-xiang
（Institute of Crop Science，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Crop Germplasm Utilization
Between Fujian and Taiwan，Fuzhou 350003，China）
Abstract：A multiplex reverse transcription polymerase chain reaction（multiplex RT-PCR）method
was developed for the simultaneous detection of five potato viruses，Potato virus X，Potato virus M，Potato
virus Y，Potato virus A and Potato virus S. Five compatible sets of primers specific for each virus were
designed based on conserved sequences of coat protein（CP）gene for multiplex RT-PCR assay. The crucial
factors of multiplex RT-PCR including annealing temperature，number of the PCR cycles，extension
temperature and primers concentration were optimized for the highest sensitivity and specificity. Five
specific fragments were simultaneously amplified in uniplex PCR reaction. Their molecular weights were
determined to be 138，213，369，468 and 657 bp. The sequence analysis indicated that the five viruses

罗文彬，李华伟，汤 浩，邱思鑫，纪荣昌，许泳清，刘中华，邱永祥.
马铃薯 5 种病毒多重 PCR 检测技术的建立及应用.
园艺学报，2015，42 (2)：280–288. 281

shared at least 97% homology with other related viruses. The sensitivity was shown to be capable of
positively identifying the five viruses with ≥ 10-3 mg of freesia tissue sample. This multiplex RT-PCR
protocol can simultaneously detect five potato viruses from field samples and plantlets with accurately，
rapidity，sensitivity.
Key words：potato；virus；detection method；multiplex RT-PCR

马铃薯（Solanum tuberosum）为无性繁殖作物，容易受到病毒的侵染。马铃薯受到病毒侵染后
产量和品质严重降低，一般减产 30% ~ 50%，严重时减产 90%以上（张仲凯 等，2003；孙慧生和
杨元军，2004）。据报道，能侵染马铃薯的有 40 余种病毒和两个类病毒，其中 9 种病毒和 1 个类病
毒对马铃薯影响最为严重（Barker & Dale，2006；Palukaitis，2012；Chung et al.，2013）。中国马铃
薯各个产区均有马铃薯病毒病的发生，常见的主要有马铃薯 X 病毒（Potato virus X，PVX），马铃
薯 M 病毒（Potato virus M，PVM）、马铃薯 Y 病毒（Potato virus Y，PVY）、马铃薯 A 病毒（Potato
virus A，PVA）、马铃薯 S 病毒（Potato virus S，PVS）、马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）
和马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid，PSTVd）等（胡新喜 等，2009；Xu et al.，
2010；陈士华 等，2011；谢联辉和林奇英，2011；高芳銮 等，2013；吴兴泉 等，2013）。目前尚
无有效的化学方法防治马铃薯病毒病，利用茎尖分生组织培育健康无毒的马铃薯已成为预防马铃薯
病毒病最为有效的方法之一。种薯生产过程中病毒检测是不可或缺的重要环节，因此，建立快速、
准确和稳定的马铃薯病毒检测技术有利于加速育种进程，对保障马铃薯种薯质量和田间马铃薯病毒
检测具有重要意义。
基于核酸分子检测的聚合酶链式反应具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，目前广泛用
于马铃薯病毒检测。近年来，研究者将多重 RT-PCR 技术运用到马铃薯病毒检测（孙琦和张春庆，
2005；Peiman & Xie，2006；Agindotan et al.，2007；马恢 等，2007；刘梅 等，2009；阎文昭 等，
2010；Crosslin & Hamlin，2011；董代幸 等，2011；Qiao et al.，2011；张华鹏 等，2011；陈阳婷 等，
2012；Mallik et al.，2012）。与普通 PCR 检测方法相比，多重 PCR 检测技术能够在一个 RT-PCR 反
应中同时检测多种病毒，操作更为简单，缩短了检测的时间，降低了实验成本。但能够检测包含 PVX、
PVM、PVY、PVA 和 PVS 的多重 RT-PCR 反应体系少有报道。本研究中利用多重 RT-PCR 技术，
探讨了同时检测 5 种病毒的多重 RT-PCR 技术，为马铃薯病毒田间检测和脱毒苗诊断奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料及其 cDNA 合成
试验于 2013 年 11 月至 2014 年 6 月在农业部闽台农作物种质资源利用重点开放实验室完成。从
福建省马铃薯主产区龙海、南安、长乐、福安、霞浦、福州、周宁等地采集带有典型病毒病症状的
样品（表 1）。样品经液氮速冻后置于–80 ℃冰箱保存，以无病毒组培苗和 ddH2O 作为检测的阴性
对照。
植物总 RNA 抽提试剂盒、DNA 纯化回收试剂盒和克隆载体 pMD18-T vector 均购自 TaKaRa 公
司。反转录试剂盒（Thermo Scientific Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit）购自生工生物工程
（上海）股份有限公司。反转录参照试剂盒操作方法进行，1 μL Primer Oligo(dT)、9 μL DEPC 处理
水、2 μL RNA 样品至反应管中，轻轻混匀再进行离心。将反应管置于 PCR 仪中 65 ℃反应 5 min 后，
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立即将反应管置于冰上 5 min，之后于上述反应液再加入 4 μL 5× 反转录酶缓冲液、1.0 μL（40
U · μL-1）的 RNase 抑制剂、1.0 μL（200 U · μL-1）反转录酶至反应管中，加入 2.0 μL dNTP 混合液
（10 mmol · L-1），总体积 20 μL 轻轻混匀，再稍微离心，然后将反应管置于 PCR 仪中 42 ℃反应 60
min，70 ℃反应 5 min。反应结束后冰上冷却备用。

表 1 采样地点及症状
Table 1 Sampling locations and symptoms
采集地点
Location
样品症状
Sample symptom
品种
Cultivar
福州 Fuzhou 坏死、花叶 Necrosis，mosaic 农家种 Potato landrace
闽侯 Minhou 轻花叶、重花叶、坏死、卷叶、皱缩
Light mosaic，heavy mosaic，necrosis，rolling，shrinkage
紫花 851、福克 212、脱毒 175
Zihua 851，Fuke 212，Tuodu 175
长乐 Changle 轻花叶 Light mosaic 紫花 851 Zihua 851
福安 Fuan 重花叶 Heavy mosaic 农家种 Potato landrace
南安 Nanan 轻花叶 Light mosaic 紫花 851 Zihua 851
霞浦 Xiapu 轻花叶 Light mosaic 中薯 17 号 Zhongshu 17
龙海 Longhai 轻花叶、坏死 Light mosaic，necrosis 紫花 851 Zihua 851
周宁 Zhouning 重花叶、坏死、皱缩 Heavy mosaic，necrosis，shrinkage 农家种 Potato landrace

1.2 引物设计
根据 GenBank 公布的马铃薯 X 病毒（PVX）、马铃薯 M 病毒（PVM）、马铃薯 Y 病毒（PVY）、
马铃薯 A 病毒（PVA）及马铃薯 S 病毒（PVS）5 种病毒的外壳蛋白（CP）序列保守区域，应用 clustalX
软件进行序列比对，并应用 Primer Premier 5.0 引物设计软件分别设计特异性引物（表 2），引物由生
工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表 2 马铃薯 5 种病毒检测用引物
Table 2 Primer sequences developed for the detection of PVX，PVM，PVY，PVA and PVS
GenBank 登录号
Accession number
引物
Primer
序列（5′–3′）
Sequence
产物大小/bp
Product size
AF111193，AB056718，JF430080 PVX-S CTGGCAAGCACAAGGTTT 138
PVX-A TGGGCAGCATTCATTTCA
KJ194171，JN835299，KC479343 PVM-S GCCGACTGAGCACGTGCAGCAGGT 213
PVM-A GTCAGCATATGATTCCATGTCACCGG
AY745491，HQ912866，EF026076 PVY-S AGAGCAAGGCAGCATCCAGT 369
PVY-A TGTTCATCCCCATCCATCAT
NC_004039，HM036192，GU256063 PVA-S ATTTAGGTACTGCTGGGACT 468
PVA-A TCAGGTTGCGTTGAAGAC
JX419379，HG518653，KC430335 PVS-S CTTGTGGGCATTGTGAGC 657
PVS-A GGCTCAAGCGAGACATTC

1.3 单一 RT-PCR 检测
以反转录产物为模板，分别利用 PVX、PVM、PVY、PVA、PVS 病毒的特异性引物对样品进行
PCR 扩增。单一 RT-PCR 反应体系为 25 μL：2.0 μL cDNA，5 种病毒的上游引物（10 μmol · L-1）各
1.0 μL，1.0 μL 5 种病毒的下游引物（10 μmol · L-1），0.15 μL Ex Taq（5U · μL-1），2.0 μL dNTP（2.5
mmol · L-1），2.5 μL 10× PCR buffer，ddH2O 补足 25 μL。反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变
性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，循环 30 次；最后 72 ℃延伸 l0 min，4 ℃保存。
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1.4 多重 RT-PCR 检测体系优化和建立
在单一 RT-PCR 的基础上对多重 RT-PCR 反应体系进行优化，设定某一影响因素时，其它因素
不变。在同一 PCR 反应体系中同时加入 5 对引物进行 5 重 PCR 反应，对多重 RT-PCR 体系中引物
浓度（表 3）、退火温度（52、54、56、58 和 60 ℃）、延伸温度（68、70 和 72 ℃）、循环次数（20、
25、30、35 次）等因素进行试验。

表 3 多重 RT-PCR 引物浓度组合
Table 3 Combinations of primer sets for multiplex RT-PCR μmol · L-1
引物浓度 Primer concentration 处理组合
Treatment combination PVX S/A PVM S/A PVY S/A PVA S/A PVS S/A
1 0.12 0.12 0.08 0.04 0.10
2 0.20 0.08 0.20 0.04 0.10
3 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20
4 0.24 0.06 0.20 0.10 0.10
5 0.24 0.04 0.24 0.12 0.16
6 0.24 0.06 0.08 0.08 0.16

1.5 PCR 产物电泳分析
PCR反应结束后，用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。上样量为 5 μL，120 V稳压电泳 30 min，
凝胶成像仪观察拍照。
1.6 灵敏度检测
提取感染的马铃薯病毒植株总 RNA，取 5 μL 总 RNA 稀释 l0 倍，用 DU800 型核酸蛋白分析仪
测定 OD260 和 OD280，并计算总 RNA 浓度。然后对总 RNA 进行 10 倍梯度稀释，100、10-1、10-2、
10-3、10-4、10-5、10-6，经过多重 RT-PCR 扩增，观察电泳结果，分析多重 RT-PCR 检测的灵敏性，
对单一和多重 RT-PCR 进行灵敏度试验。
1.7 PCR 产物的克隆与序列分析
多重 RT-PCR 扩增产物用大连宝生物公司 DNA 纯化试剂盒回收纯化，纯化后的 PCR 产物与
pMD18-T vector 连接，连接产物转化大肠杆菌，经蓝白斑筛选和 PCR 鉴定后获得阳性克隆。
获得的阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。NCBI 上 BLAST 对所测序列
进行比对分析。
2 结果与分析
2.1 引物筛选及单一 RT-PCR 检测结果
5 种病毒（PVX、PVM、PVY、PVA 和 PVS）各设计 3 对引物，利用软件 DNAMAN 检测引物
间的互补性及引物退火温度，选择退火温度接近，且扩增的目的片段大小有明显差异，易于区分的
引物对。
用筛选的 PVX、PVM、PVY、PVA 和 PVS 引物（表 2）分别对相应病毒的 RNA 模板进行单一
RT-PCR 扩增，分别能够扩增出 138、213、369、468 和 657 bp 特异性条带，符合相应病毒的理论预
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期值。
将 5 对引物混合在同一个反应体系中，以
5 种病毒的 RNA 作模板，如图 1 所示，均能够
同时扩增出对应的特异条带，无杂带出现，说
明这 5 对引物特异性好，无交叉和相互干扰现
象，适合多重检测。
2.2 多重 RT-PCR 反应体系优化
在单一 RT-PCR 的基础上，对 5 种病毒引
物浓度、PCR 退火温度、PCR 延伸温度、PCR
循环次数进行了优化试验。5 种病毒引物浓度
优化试验结果见图 2，按 0.2 μmol · L-1 的终浓度加入 5 对引物，结果显示 PVX、PVY 片段较弱（图
2，A，泳道 3），将 PVX 和 PVY 引物浓度提高到 0.28 μmol · L-1，其他引物浓度减低，PVX 和 PVY
随着引物浓度的提高条带逐渐变亮，当处理 5（PVX、PVY、PVM、PVA 和 PVS）引物浓度分别为
0.24、0.04、0.24、0.12 和 0.16 μmol · L-1 时，5 种病毒扩增条带均较亮（图 2，A，泳道 5），最终确
定上述 5 种马铃薯病毒 PVX、PVY、PVM、PVA 和 PVS 引物浓度比为 0.24︰0.04︰0.24︰0.12︰0.16。
当退火温度为 52 ℃时，4 种病毒的目的条带均较暗；退火温度为 54、56、58 和 60 ℃时，扩增出的
目的条带亮度较高（图 2，B），综合考虑退火温度选择 58 ℃作为多重 RT-PCR 的退火温度。PCR 循
环次数为 20 和 25 次时，PVX、PVY、PVM、PVA 和 PVS 目的条带不清晰，提高 PCR 循环次数到
30 和 35 次时，5 种病毒均可获得清晰的目的条带（图 2，C）。延伸温度试验表明，3 个延伸温度均
能扩增出 5 种病毒清晰的目的条带，综合考虑选择 72 ℃延伸温度（图 2，D）。



图 2 多重 RT-PCR 反应体系优化
M：DNA 标准分子量；A：泳道 1~ 6 见表 3。
Fig. 2 Effects of the reaction components in multiplex RT-PCR
M：Marker DL2000；A：Lane 1–6 are shown in Table 3.
图 1 单一 PCR 检测 5 种马铃薯病毒
M：DNA 标准分子量；N：阴性对照。
Fig. 1 Detection of five potato viruses by uniplex PCR
M：Marker DL2000；N：Negative control.
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图 3 5 种马铃薯病毒单一 RT-PCR 和多重 RT-PCR 扩增结果
M：DNA 标准分子量；泳道 1：PVX、PVM、PVY、PVA
和 PVS 混合；N：阴性对照。
Fig. 3 Detection of potato viruses by uniplex and multiplex
RT-PCR
M：DL2000 DNA marker；Lane 1：Multiplex of PVX，PVM，PVY，
PVA and PVS；N：Negative control.
2.3 多重 RT-PCR 反应体系确立
根据上述试验结果，确定 5 种马铃薯病毒
的多重 RT-PCR 反应体系和反应程序。多重
RT-PCR 反应体系（25 μL）为：2.0 μL cDNA，
0.6 μL PVX 引物，0.10 μL PVM 引物，0.6 μL
PVY 引物，0.3 μL PVA 引物，0.4 μL PVS 引物，
0.15 μL Ex Taq（5 U · μL-1），2.0 μL dNTP（2.5
mmol · L-1），2.5 μL 10× PCR buffer，ddH2O 补
足 25 μL。反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94
℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，
循环 30 次。利用建立的反应体系对 PVX、
PVM、PVY、PVA、PVS进行单一和多重RT-PCR
扩增，5 种病毒的目的条带均清晰分明（图 3）。
2.4 灵敏度检测
将提取的马铃薯总 RNA 按照 10 倍梯度稀释法依次稀释，在相同反应体系及反应条件下分别对
单一和多重 RT-PCR 灵敏度进行分析。由图 4 可知，单一 RT-PCR 灵敏度检测为 PVX、PVM、PVY、
PVA 和 PVS 在模板稀释 10-4 后仍能检测到扩增条带清晰，检测灵敏度相当于 10-4 mg 组织量，样品
组织量为 10-5 mg 时检测条带微弱。多重 RT-PCR 检测模板浓度为 10-3，10-4 时检测条带微弱，综上
多重 RT-PCR 检测灵敏度为 10-3 mg 新鲜组织量，单一 RT-PCR 检测灵敏度为多重 RT-PCR 的 10 倍。


图 4 单一和多重 RT-PCR 的灵敏度检测
Fig. 4 Sensitivities analysis of the uniplex and multiplex RT-PCR

2.5 田间样品症状及样品检测
田间采集病样时发现侵染病毒的马铃薯植株出现植株矮化、畸形，叶片表现为轻花叶、皱缩、
重花叶、叶脉坏死等症状，收获考种时发现受侵染的马铃薯薯块出现薯块变小、裂纹、畸形等症状。
经调查发现，病毒病的发生与当地种植种薯脱毒与否有关，其中春种区和秋种区均为农民自留种种
植，马铃薯病毒症状类型复杂，发病率高达 80%以上，且多为几种病毒的复合侵染，而种植脱毒种
薯冬种区马铃薯病毒病症状类型单一，发病较轻，多为 1 种或两种病毒侵染。
利用建立的多重 RT-PCR 检测田间和茎尖脱毒苗样品（图 5）。田间样品多为几种病毒复合侵染，
样品 1 和样品 6 为 PVX、PVM、PVY 和 PVA 复合侵染，样品 3、4 和 7 为 PVM、PVY、PVA 和 PVS
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复合侵染，样品 2 为 PVY、PVA 和 PVS 复合侵染，样品 5 为 PVM、PVA 和 PVS 复合侵染；8 株茎
尖脱毒苗中有 4 份样品脱毒彻底，4 份样品脱毒不彻底，其中样品 10、11 和 12 中 PVM 病毒未脱除，
样品 11 和 12 PVM 和 PVA 未脱除，样品 13PVS 未脱除。经田间样品检测表明，本研究中建立的多
重 RT-PCR 检测体系可以高效快速地检测出马铃薯受侵染的 5 种病毒。在进行多重 RT-PCR 检测的
同时，运用单一 RT-PCR 进行验证，单一和多重 RT-PCR 检测结果一致。

图 5 马铃薯田间样品和组培苗检测结果
M：DNA 标准分子量；泳道 1 ~ 7：田间样品；泳道 8 ~ 15：经茎尖脱毒的组培苗；N：阴性对照。
Fig. 5 Detection results of field samples and plantlets by multiplex RT-PCR
M：DL2000 DNA marker；Lane 1–7：Detection results of samples from field；Lane 8–15：Detection results of
samples from plantlets；N：Negative control.
3 讨论
ELISA 检测法是目前植物病毒检测最常用的方法，由于其检测成本低廉、快速和特异性高、适
合处理大批样品检测等优点，在马铃薯病毒检测中得到广泛应用（高艳玲 等，2001；宋吉轩 等，
2006；钟婷婷 等，2008；Hamm et al.，2010；范国权 等，2013；Yang et al.，2014）。然而，该方
法具有一定的局限性，一种抗血清只能检测一种病毒，检测程序繁琐，而且还存在一定程度的假阳
性，检测灵敏性相对较低。为了提高病毒检测效率，RT-PCR 检测技术得到了迅速的推广和应用，
特别是一次反应能同时检测多种病毒的多重 RT-PCR（M-RT-PCR）检测技术在马铃薯病毒检测上得
到了较好应用（Nie & Singh，2001；Ipsita et al.，2012；Singh et al.，2013）。Agindotan 等（2007）
利用实时荧光定量 RT-PCR 检测 4 种马铃薯病毒，检测灵敏度相当于 200 ~ 400 倍病毒 RNA 拷贝，
检测灵敏度较高，适合病毒的定量研究。但荧光定量 PCR 检测成本较高。多重 RT-PCR 检测技术具
有在一个 RT-PCR 反应中可同时检测多种病毒，具有较高的检测灵敏度，操作更为简单，缩短了检
测的时间与降低了试验成本等优点。
本研究中在单一 RT-PCR 基础上，对多重 RT-PCR 引物浓度进行调整，获得一个合适浓度，同
时优化了 PCR 反应条件和参数，最终建立多重 RT-PCR 检测方法，实现 5 种病毒的同时快速检测，
并且具有良好的特异性，为马铃薯病毒检测提供了快速、灵敏、准确的方法。

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