全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（2）：215–226 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–09–24；修回日期：2013–12–17
基金项目：国家自然科学基金项目（31101532）
* E-mail：zhangxiaohui01@caas.cn
苹果全基因组 SBP-box 基因家族分析及代表成
员的分子克隆
张晓辉 1,*，魏小春 1，李锡香 1，孙玉燕 1，王 冠 1，常兆晶 1，刘冠群 1，
邱 杨 1，宋江萍 1，王海平 1，沈 镝 1，王大江 2，韩月澎 3
（1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 100081；2中国农业科学
院果树研究所，辽宁兴城 125100；3 中国科学院武汉植物园，武汉 430074）
摘 要：从金冠苹果基因组中鉴定出 33 个 SBP-box 家族基因，其中 20 个为 miR156 的靶基因。通过
进化分析，对该家族成员进行了系统分类和功能预测。大部分预测的基因在富士苹果基因组中存在并表
达，并且发现可变剪切在该家族基因中高频出现。在富士苹果中克隆了 4 个代表性成员基因，即 MdSPL2、
MdSPL11、MdSPL13 和 MdSPL33；与金冠相比，MdSPL33 是一个缺失第 2 和 3 外显子的剪切本，并具有
2 个单碱基变异；MdSPL11 和 MdSPL13 分别存在 4 个和 2 个单碱基变异，造成 3 个和 1 个氨基酸改变。
关键词：苹果；SBP-box 家族；分子进化；基因克隆
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）02-0215-12

Genome-wide Analysis of SBP-box Gene Family and Molecular Cloning of
Its Typical Members in Malus × domestica
ZHANG Xiao-hui1,*，WEI Xiao-chun1，LI Xi-xiang1，SUN Yu-yan1，WANG Guan1，CHANG Zhao-jing1，
LIU Guan-qun1，QIU Yang1，SONG Jiang-ping1，WANG Hai-ping1，SHEN Di1，WANG Da-jiang2，
and HAN Yue-peng3
（1Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences；Key Laboratory of Biology and Genetic
Improvement of Horticultural Crops，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China；2Research Institute of Pomology，
Chinese Academy of Agricultural Sciences，Xingcheng，Liaoning 125100，China；3Wuhan Botanical Garden，Chinese
Academy of Sciences，Wuhan 430074，China）
Abstract：The present study isolated 33 SBP-box family genes including 20 miR156 targets in Golden
Delicious apple genome. The phylogenic analyses were performed and the biological functions were
predicted based on the phylogenic tree. The existence and expression pattern of SBP-box family genes
were investigated by PCR and RT-PCR analysis. Alternative splicing events were commonly found in this
gene family. Four typical members，MdSPL2，MdSPL11，MdSPL13 and MdSPL33 were cloned from Fuji
apple tree. Compared to Golden Delicious cultivar，MdSPL33 from Fuji produced an alternative splicing
version which lost the 2nd and 3rd exons and harboring two single base mutations. MdSPL11 and
MdSPL13 have four and two single base mutations causing three and one amino acid changes，respectively.

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Key words：Malus × domestica；SBP-box family；phylogenetic；gene cloning

SBP-box（SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN box）基因也称 SPL（SQUAMOSA
PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE）基因，编码一类植物特有的转录因子，这类转录因子具有结
合 MADS-box 基因家族 SQUAMOSA 基因启动子的结构域（Chen et al.，2010）。很多 SBP-box 基因是
植物 miR156 的靶基因，在拟南芥 16 个 SBP-box 基因中有 10 个、水稻 19 个 SBP-box 基因中有 11
个是 miR156 的靶基因（Xie et al.，2006；Gandikota et al.，2007）。在 SBP-box 靶基因中已发现 AtSPL9
和 AtSPL15 在拟南芥中控制生叶速度、器官大小以及植株的发育成熟（Schwarz et al.，2008）；其中
AtSPL15 还调控细胞大小和数量（Usami et al.，2009）。AtSPL3、AtSPL4 和 AtSPL5 调控植株营养生
长向生殖生长的转换以及开花期（Wu & Poethig，2006；Gandikota et al.，2007）。在水稻中，OsSPL14
超表达的突变体表现出产量提高、株形结构更理想等优良性状（Jiao et al.，2010；Miura et al.，2010），
而在番茄中，一个 SBP-box 基因（Cnr）启动子区的甲基化导致果实无法正常成熟（Manning et al.，
2006）。可见 SBP-box 基因和 miR156 这一套调控系统控制多个发育程序，在植物的发育过程中起非
常重要的作用。
随着苹果基因组测序的完成，其功能基因组的研究也快速进展（张世忠 等，2012）。苹果中的
WRKY、SUPERMAN、MdGLRs、LBD 等基因家族都获得了系统的生物信息学分析（罗华 等，2012；
许瑞瑞 等，2012；赵旭勉 等，2012；Wang et al.，2013）。最近的研究表明，苹果中 miR156 家族
基因多达 31 个，远高于已知其它物种中该家族成员的数量（Xia et al.，2012）。基因数量的增多可
能进化出新的功能，因此 miR156/SBP-box 调控系统在苹果中可能起到特别重要的作用。对苹果全基
因组水平的SBP-box家族进行分析，进而解析苹果miR156/SBP-box的具体生物学功能具有重要意义。
本研究中依据苹果基因组测序数据，根据 SBP-box 保守结构域序列特征，鉴定出苹果全基因组
的SBP-box家族基因；分析该家族基因的染色体分布和miR156靶点位置；通过与模式植物的SBP-box
家族蛋白序列比对和进化分析，对苹果 SBP-box家族转录因子进行了系统聚类和功能预测；通过 PCR
和 RT-PCR 检测具有 miR156 靶位点的 SBP-box 基因在红富士苹果中的存在和表达特征；并从红富
士苹果中克隆了 4 个代表性的 SBP-box 基因，发现这些基因与测序品种金冠中的等位基因存在一些
差异。本研究中为解析这些 SBP-box 靶基因成员各自的生物学功能作了初步探讨，并为苹果以及其
它园艺植物分子育种和分子发育研究提供一些有益信息。
1 材料与方法
1.1 试验材料
富士苹果 3 年生嫁接植株（砧木为西府海棠，2008 年 4 月播种，2009 年 8 月嫁接）栽培在中国
农业科学院蔬菜花卉研究所日光温室。2012 年 5 月取幼嫩叶片液氮冷冻备用。
RNA 提取试剂盒 EasyPure Plant RNA Kit，反转录试剂盒 TransScript First-Strand cDNA Synthesis
SuperMix、克隆载体 pEASY-T1、大肠杆菌感受态细胞 Trans-T1 购于北京全式金生物技术有限公司，
高保真 PCR 酶 KOD-Plus-Neo 购于东洋纺（上海）生物科技有限公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购于
北京天根生化科技有限公司，引物序列由北京生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 苹果 DNA 提取与 PCR 检测
苹果叶片 DNA 用 CTAB 法提取，方法同孙超（2010）的文献。PCR 反应体系为：10 × PCR buffer
2 期 张晓辉等：苹果全基因组 SBP-box 基因家族分析及代表成员的分子克隆 217

5 μL，25 μmol · L-1 MgSO4 3 μL，2 mmol · L-1 dNTP 5 μL，10 μmol · L-1 引物 5 μL，50 ng  mL-1 基因
组 DNA 1 μL，KOD-Plus-Neo 酶 1 μL，用去离子水补齐至 50 μL。PCR 反应程序为：94 3 min℃ ；
94 30℃ s，58 30 s℃ ，72 2 min℃ ，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳
检测。PCR 引物序列见表 1。

表 1 用于扩增苹果 SBP-box基因的 PCR 引物
Table 1 PCR primers used for analysis of apple SBP-box genes
引物名称
Primer name
序列（5–3）
Sequence
引物名称
Primer name
序列（5–3）
Sequence
MdSPL1-F CCTAAACAATGGAGGGCAAG MdSPL17-F ATGGAGTGGAATGAAAAACCTCCT
MdSPL1-R ATTGGCCTTATCTGATCTGG MdSPL17-R TCAGGTTTTCCAGTTCCCACAA
MdSPL2-F ATGGAATCAGGCAGAGGTCA MdSPL23-F AATGGGCTCGAGTTCTAT
MdSPL2-R CGCCTCCATGTCCATGTTAT MdSPL23-R TTAAAGTGACCAGTTCATCT
MdSPL5-F ATGGACTGGAACTTGAAAGCA MdSPL27-F ATGGAGTCCTGGAGTTTTGGT
MdSPL5-R CTACTCCTTCAAGTAATATGGA MdSPL27-R CTAAAGTTTCTCCCAGCCTC
MdSPL8-F ATGGAAATAGGTGGGAACAT MdSPL28-F ATGGGAACTTTTGTGCAGAACT
MdSPL8-R TTAGACCACACTAGTTCCCT MdSPL28-R TCAACTGAATTGGTTTGGATTATA
MdSPL11-F ATGGAGTACTGGGACTTCGA MdSPL29-F ATGGAAGATGGATCAAAGGGC
MdSPL11-R TCAGTTGTCCCAAAAGCAAT MdSPL29-R TCAGGAATAATCTGAATTCTGA
MdSPL12-F CGTTGATGGAGGGAATGAGT MdSPL31-F ATGGAGTGGGACTTCAAGGA
MdSPL12-R AAATCTTATCTGATATGGAAATGC MdSPL31-R TCAGTTGTTCGAAAAGCCATCA
MdSPL13-F ATGGATTCAGGCAGAGCTCA MdSPL32-F ATTGATGGAGGGGATGAGTA
MdSPL13-R GGAAACAGGCATCCACGTGA MdSPL32-R TCTTATTTGATTTGGAAGTGCT
MdSPL14-F CCTTAACAATGGAGGGCAAA MdSPL33-F ATGGAAATGGGCTCGAGTTCTAA
MdSPL14-R CATGGCCTTATCTGATCTGA MdSPL33-R TGCAAAGCAGATTCCATGGT
MdSPL16-F ATGGAGTCTTGGAGTTTTGGT
MdSPL16-R TCACATTGTTGCTTGCACGC
1.3 总 RNA 提取与 RT-PCR
取苹果幼嫩叶片迅速用液氮冷冻研磨成粉末，用全式金 EasyPure Plant RNA Kit 试剂盒提取
RNA，提取方法参照试剂盒说明书。取 3 μL RNA 用全式金 TransScript First-Strand cDNA Synthesis
SuperMix 试剂盒反转录成 cDNA，按说明书操作。反转录产物 5 倍稀释后用作 RT-PCR 反应模板。
RT-PCR 反应体系为：10 × PCR buffer 5 μL，25 μmol · L-1 MgSO4 3 μL，2 mmol · L-1 dNTP 5 μL，10
μmol · L-1 引物 5 μL，cDNA 1 μL，KOD-Plus-Neo 酶 1 μL，用去离子水补齐至 50 μL。PCR 反应程
序为：94 3 min℃ ；94 30 s℃ ，58 30 s℃ ，72 1 min℃ ，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR 产物
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 引物序列见表 1。
1.4 基因克隆与序列分析
以苹果叶片 cDNA 为模板，用包含目标基因起始密码子和终止密码子的引物对（表 1）进行 PCR
反应，扩增基因全长编码区（ORF）。PCR 反应体系同上。PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，切
胶回收目标条带。胶回收用北京天根琼脂糖凝胶回收试剂盒，按操作说明进行。回收产物装载到
pEASY-T1 克隆载体，热激转化大肠杆菌感受态细胞 Trans-T1，皆按说明书操作。挑选阳性克隆于
5 mL 含有 50 mg  L-1 卡那霉素的 LB 培养基中摇菌，碱裂法抽提质粒，用 M13-F/R 引物双向测序。
去除载体序列，拼接并获得克隆片段全长序列。
1.5 全基因组 SBP-box 基因家族分析与进化树构建
利用一个 SBP-box 蛋白的 SBP-box 结构域（Domain）74 个氨基酸残基（CQVESCTADMSKAKQ
YHKRHKVCQFHAKAPHVRISGLHQRFCQQCSRFHALSEFDEAKRSCRRRLAGHNERRRK）在苹果
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基因组（http：//www. rosaceae. org/）中进行序列比对（Blastp），筛查出具有 SBP-box 模体特征的序
列。人工去除低相似度或重复序列，获得苹果全基因组 SBP-box 家族基因序列。拟南芥、水稻、番
茄 SBP-box 基因序列从文献中获得（Xie et al.，2006；Zhang et al.，2011）。从苹果、拟南芥、水稻、
番茄 SBP-box 蛋白中提取 SBP-box 结构域氨基酸序列，用 Clustal X 进行序列比对（alignment），再
用 MEGA 5.0 构建分子进化树。
2 结果与分析
2.1 苹果全基因组 SBP-box家族基因的搜查和特征分析
利用 SBP-box 结构域在苹果基因组蛋白数据库中比对，共获得具有 SBP-box 结构域的序列 66 个，
通过人工去除特征匹配度低的序列和重复序列，获得 33 个 SBP-box 基因（表 2）。数量显著多于拟南
芥中的 16 个，番茄中的 15 个，葡萄中的 18 个和水稻中的 19 个成员（Xie et al.，2006；Gandikota et al.，
2007；Salinas et al.，2012；Hou et al.，2013）。这 33 个 SBP-box 基因中 20 个具有 miR156 靶位点，其
中 6 个的靶位点位于基因 3′非翻译区（3′UTR），14 个基因的靶位点位于编码区（Coding region）内部，
大多数编码区的靶位点位于第 3 外显子上。这些 SBP-box 基因的结构和序列长度存在巨大差异，含有
少则 1 个，多至 9 个内含子。编码的蛋白质最短的只有 149 个氨基酸，最多有 1 724 个氨基酸（表 2）。
表 2 苹果全基因组 SBP-box家族基因统计表
Table 2 Summaries of SBP-box family genes in apple genome
名称
Name
蛋白 ID
Protein ID
染色体位置
Chromosome local
内含子数
Intron
number
蛋白长度/
aa
Protein size
拟南芥同源基因
Homologue gene in
Arabidopsis
MiR156 靶位点
MiR156 target local
MdSPL1 MDP0000156994 chr3:27512184..27513639 1 191 AtSPL5 3′非翻译区 3′UTR
MdSPL2 MDP0000255201 chr5:4579170..4580737 1 149 AtSPL3 3′非翻译区 3′UTR
MdSPL3 MDP0000149339 chr6:365059..369647 8 1012 AtSPL14 无 None
MdSPL4 MDP0000153244 chr6:15301022..15305436 4 1186 AtSPL10 无 None
MdSPL5 MDP0000263766 chr6:17180409..17189746 7 722 AtSPL13 第 3 外显子 3rd exon
MdSPL6 MDP0000778465 chr6:22075533..22077896 2 490 AtSPL6 第 3 外显子 3rd exon
MdSPL7 MDP0000803116 chr7:9568725..9570646 3 373 AtSPL8 无 None
MdSPL8 MDP0000262141 chr7:9638919..9642567 2 425 AtSPL9 第 3 外显子 3rd exon
MdSPL9 MDP0000132774 chr8:24892521..24893818 4 177 AtSPL16 无 None
MdSPL10 MDP0000121221 chr8:24951616..24955171 6 279 AtSPL16 无 None
MdSPL11 MDP0000170630 chr9:702640..704818 2 313 AtSPL13 第 3 外显子 3rd exon
MdSPL12 MDP0000865739 chr9:32944918..32946204 1 188 AtSPL5 3′非翻译区 3′UTR
MdSPL13 MDP0000323003 chr10:28222136..28223627 1 168 AtSPL3 3′非翻译区 3′UTR
MdSPL14 MDP0000158607 chr11:28811736..28813263 1 189 AtSPL5 3′非翻译区 3′UTR
MdSPL15 MDP0000223738 chr12:422798..425191 3 707 AtSPL10 无 None
MdSPL16 MDP0000171877 chr13:3766403..3769521 2 508 AtSPL6 第 3 外显子 3rd exon
MdSPL17 MDP0000155354 chr13:8433237..8436223 4 514 AtSPL2 第 4 外显子 4th exon
MdSPL18 MDP0000919693 chr13:11717266..11722520 8 967 AtSPL14 无 None
MdSPL19 MDP0000919694 chr13:11724590..11729872 9 983 AtSPL14 无 None
MdSPL20 MDP0000180408 chr13:13332926..13338711 8 930 AtSPL14 无 None
MdSPL21 MDP0000180409 chr13:13341002..13346816 9 999 AtSPL14 无 None
MdSPL22 MDP0000271587 chr13:16866413..16869529 6 407 AtSPL7 无 None
MdSPL23 MDP0000297978 chr14:7327092..7330390 2 381 AtSPL9 第 3 外显子 3rd exon
MdSPL24 MDP0000210138 chr14:21647303..21649346 2 440 AtSPL13 第 3 外显子 3rd exon
MdSPL25 MDP0000589558 chr14:26755594..26757904 2 453 AtSPL6 第 3 外显子 3rd exon
MdSPL26 MDP0000263972 chr15:23373641..23380328 5 1724 AtSPL10 无 None
MdSPL27 MDP0000193702 chr16:2350076..2353514 4 511 AtSPL6 第 4 外显子 4th exon
MdSPL28 MDP0000249364 chr16:6382642..6391711 12 998 AtSPL2 第 13 外显子 13th exon
MdSPL29 MDP0000176265 chr16:6527058..6528203 2 309 AtSPL13 第 3 外显子 3rd exon
MdSPL30 MDP0000195461 chr16:13414895..13416880 3 344 AtSPL7 无 None
MdSPL31 MDP0000142582 chr17:605039..606905 2 335 AtSPL13 第 3 外显子 3rd exon
MdSPL32 MDP0000255162 chr17:19390826..19391860 1 163 AtSPL5 3′非翻译区 3′UTR
MdSPL33 MDP0000322647 unan:14354146..14356471 4 452 AtSPL9 第 5 外显子 5th exon
2 期 张晓辉等：苹果全基因组 SBP-box 基因家族分析及代表成员的分子克隆 219

2.2 苹果 SBP-box家族基因的进化分析和功能预测
将苹果、拟南芥、水稻、番茄的 SBP-box 蛋白进行序列比对和进化分析，该家族蛋白序列存在
一个保守的 SBP-box 结构域，其余序列差异巨大，因此分析中只利用该结构域氨基酸序列（图 1）。

图 1 SBP-box 结构域氨基酸序列比对
MD：苹果；At：拟南芥；Os：水稻；SGN：番茄。底部柱形图显示氨基酸残基的保守性。
Fig. 1 The amino acid sequences alignment of SBP-box domains
MD：Malus  domestica；At：Arabidopsis thaliana；Os：Oryza sativa；SGN：Solanum lycopersicum.
The bars at bottom show the conservativeness of the amino acid residues.
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进化树显示，SBP-box 蛋白分成 6 个亚组，苹果 SBP-box 蛋白在 6 个亚组中皆有分布（图 2）。
其中，苹果在亚组Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ中数量显著增多，分别达到 9、8、7 个成员，显著高于拟南芥（2、4、
4 个）、水稻（3、2、3 个）和番茄（3、5、2 个）成员数。特别是亚组Ⅰ中苹果基因成员数扩增尤
其明显，分别是拟南芥、水稻和番茄的 4.5 倍、3 倍和 3 倍。MiR156 的靶基因主要集中在亚组Ⅰ、
Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中，亚组Ⅴ和Ⅵ的全部和亚组Ⅱ中的 2 个及亚组Ⅳ中的 3 个成员不含 miR156 靶位点。
亚组Ⅲ中的 AtSPL9 和 OsSPL14 是拟南芥和水稻中控制株形和产量的重要基因（Schwarz et al.，2008；
Jiao et al.，2010；Miura et al.，2010）；苹果在该亚组中存在 3 个成员，这 3 个成员中尤其是 MdSPL23
和 MdSPL33 与 AtSPL9 和 OsSPL14 相似性最高，很可能是调控苹果树的株形结构和产量的关键基因，
值得关注。

图 2 SBP-box 蛋白进化树
Md：苹果；At：拟南芥；Os：水稻；SGN：番茄。
Fig. 2 Phylogenic tree of SBP-box proteins
Md：Malus  domestica；At：Arabidopsis thaliana；Os：Oryza sativa；SGN：Solanum lycopersicum.
2 期 张晓辉等：苹果全基因组 SBP-box 基因家族分析及代表成员的分子克隆 221

SBP-box 家族基因在苹果基因组中的位置如图 3 所示，除 MdSPL33 未锚定外，其余 32 个成员
均成功定位在苹果染色体上。在苹果 17 条染色体中，除了第 1、2、4 条染色体外，其他 14 条染色
体上皆有 SBP-box 基因的分布，其中第 13 条染色体上存在 7 个成员，占该家族基因总数的 21.2%，
是富集 SBP-box 基因最多的染色体。对旁系同源基因（paralog genes）的染色体分布进行关联，发
现 3 和 11、5 和 10、6 和 14、9 和 17、13 和 16 上镜像分布着 SBP-box 旁系同源基因，表明这些染
色体源自一次近期的二倍化事件，这一结果与苹果基因组测序（Velasco et al.，2010）所获得的结果
是一致的。根据这一规律，由于 MdSPL23 和 MdSPL33 也是一对旁系同源基因，并且 MdSPL23 位于
第 14 染色体上，可以推测 MdSPL33 是位于第 6 染色体上。
第 8 染色体上的 MdSPL9 和 MdSPL10 以及第 13 染色体上的 MdSPL18、MdSPL19、MdSPL20
和MdSPL21作为旁系同源基因成簇出现，表明MdSPL9和MdSPL10源自一次串联复制，而MdSPL18、
MdSPL19、MdSPL20 和 MdSPL21 是源自一个祖先基因经历了两次串联复制。有意思的是，这 6 个
基因都属于亚组Ⅵ，该亚组基因的活跃复制预示着它们在苹果中发挥重要的生物学功能。


























图 3 苹果 SBP-box基因在染色体上的分布
灰线连接的是同源基因。
Fig. 3 The chromosome distribution of SBP-box genes in apple
The gray lines indicate the paralog genes.
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2.3 具 miR156 靶位点的 SBP-box基因在富士苹果中的存在和表达
由于植物的株形、花期、产量等重要农艺性状受 miR156 调控，需特别关注 SBP-box 家族基因
中带有 miR156 靶位点的成员。利用 17 对基因特异性引物（表 1）从富士苹果基因组 DNA 中 PCR
扩增 17 个 miR156 靶基因。如图 4 所示，共有 14 对引物扩增出预期目标大小的单一条带，表明这
14 个基因在富士苹果中真实存在；另外 3 个未扩增出条带的基因不能排除其存在性，有可能是引物
不合适或者富士苹果在引物区有序列差异。随后用相同引物 RT-PCR 扩增富士苹果叶片中 SBP-box
基因转录本。如图 5 所示，大部分基因在苹果叶片中存在一定程度的表达。很多基因如 MdSPL2、
MdSPL5、MdSPL11、MdSPL16、MdSPL17 和 MdSPL33 产生多条带，表明这些基因在富士苹果中存
在多个转录本，可能是由可变剪切造成的。


图 4 PCR 扩增苹果基因组中带 miR156 靶位点的 SBP-box基因
Fig. 4 PCR analyses of miR156 targeted SBP-box genes in apple genome



图 5 RT-PCR 从红富士苹果叶片 cDNA 扩增 SBP-box 基因转录本
Fig. 5 RT-PCR enrichment of SBP-box transcripts from Fuji apple leaf tissue

2.4 富士苹果中 SBP-box家族代表性 miR156 靶基因的克隆和变异分析
从富士苹果中克隆了 SBP-box 家族中代表性的 miR156 靶基因，包括亚组Ⅰ中的 MdSPL11，亚
组Ⅱ中的 MdSPL2 和 MdSPL13，以及亚组Ⅲ中的 MdSPL33。与基因组测序品种金冠相比，MdSPL2
序列没有差异（图 6），另外 3 个基因在两个品种间都存在 2 ~ 4 个单碱基变异（表 3）；其中 MdSPL11
和 MdSPL13 分别具有 4 个和 2 个单碱基变异，造成 3 个和 1 个氨基酸残基的差异（图 7，图 8）。这
些氨基酸的改变是否影响基因的功能还需进一步研究。MdSPL33 除存在 2 个碱基差异外，还发现存
在于金冠苹果中的第 2 和第 3 外显子在红富士苹果中是缺失的；该克隆共缺失 219 个碱基，编码 73
个氨基酸。这一结果进一步证实前述 RT-PCR 结果中关于苹果 SBP-box 基因具有丰富的可变剪接的
推断（表 3，图 9）。
2 期 张晓辉等：苹果全基因组 SBP-box 基因家族分析及代表成员的分子克隆 223

表 3 富士与金冠苹果中 4 个具代表性的 SBP-box 家族靶基因序列比较
Table 3 The sequence comparison of four typical SBP-box target genes from Fuji and Golden Delicious apples
编码区长度/Nt CDS length 变异 Mutation 基因
Gene 金冠 Golden Delicious 富士 Fuji
相似度/%
Similarity 碱基 Nucleotide 氨基酸 Amino acid
可变剪接
Alternative splicing
MdSPL2 450 450 100.0000 0 0 0
MdSPL11 942 942 99.5754 4 3 0
MdSPL13 504 504 99.6032 2 1 0
MdSPL33 1359 1140 99.8246 2 N 1



图 6 MdSPL2基因在金冠和富士苹果中的 DNA 和蛋白质序列
F：富士，KF673852；GD：金冠，MDP0000255201。方框内为SBP-box结构域。
Fig. 6 The DNA and protein sequences of MdSPL2 from Fuji and Golden Delicious apples
F：Fuji，KF673852；GD：Golden Delicious，MDP0000255201. The line box indicates the SBP-box domain.




图 7 MdSPL11基因在金冠和富士苹果中的序列比较
GD：金冠，MDP0000170630；F：富士，KF673853。差异位点用阴影显示，方框内为 SBP-box 结构域，下划线显示 miR156 靶位点。
Fig. 7 The DNA and protein sequences of MdSPL11 from Fuji and Golden Delicious apples
GD：Golden Delicious，MDP0000170630；F：Fuji，KF673853. The shaded alphabets indicate the mutates，
the line box indicates the SBP-box domain，the underline shows miR156 target.

224 园 艺 学 报 41 卷
图 8 MdSPL13基因在金冠和富士苹果中的序列比较
GD：金冠，MDP0000323003；F：富士，KF673854。差异位点用阴影显示，方框内为 SBP-box 结构域。
Fig. 8 The DNA and protein sequences of MdSPL13 from Fuji and Golden Delicious apples
GD：Golden Delicious，MDP0000323003；F：Fuji，KF673854. The shaded alphabets indicate the mutates，
the line box indicates the SBP-box domain.


图 9 MdSPL33基因在金冠和富士苹果中的序列比较
GD：金冠，MDP0000322647；F：富士，KF673855。阴影显示差异位点，虚线表示缺失序列，
方框内 SBP-box 结构域，下划线显示 miR156 靶位点。
Fig. 9 The DNA and protein sequences of MdSPL33 from Fuji and Golden Delicious apples
GD：Golden Delicious，MDP0000322647；F：Fuji，KF673855. The shaded alphabets indicate the mutates，the dotted line indicates
the absent sequence，the line box indicates the SBP-box domain，the underline shows the miR156 target.
2 期 张晓辉等：苹果全基因组 SBP-box 基因家族分析及代表成员的分子克隆 225

3 讨论
果树生产和育种中的重要任务是缩短童期，调控株形结构和果实大小、坐果量、成熟期等。在
番茄中的研究表明，超表达 miR156 导致植株侧枝增多，株形矮化，童期延长，坐果量降低，果实
变小，成熟延迟，果色变浅（Zhang et al.，2011）。目前所知，SBP-box 家族是 miR156 唯一的靶基
因家族，由此推测，降低 miR156 的表达或提高相应的 SBP-box 靶基因的表达可能缩短植物童期，
减少无效侧枝，提高坐果量，增大单果质量，增强果实着色，提前成熟上市。
为达到上述目的，系统分析了苹果全基因组水平的 SBP-box 家族基因。苹果中该家族基因显著
高于已知其他物种中该家族基因的数量，主要得益于苹果基因组的一次较近期的染色体加倍，同时
基因的串联复制也发挥了重要作用。苹果中 SBP-box 家族基因数量的膨胀和变异的积累提供了丰富
的基因资源库。这些基因功能的进一步阐释将为苹果甚至其他园艺作物的分子改良提供有用资源。
在拟南芥中的研究表明，AtSPL3/4/5（MdSPL2/13 的同源基因）控制营养生长到生殖生长转换以及
开花期（Wu & Poethig，2006；Gandikota et al.，2007）。水稻中的 OsSPL14（MdSPL33 的同源基因）
控制株形和产量（Jiao et al.，2010；Miura et al.，2010）。番茄中一个 SBP-box 基因（Cnr）控制果
实成熟（Manning et al.，2006）。通过基因家族的进化分析以及模式植物的研究，推测亚组Ⅱ中的
MdSPL2 和 MdSPL13 可能调控苹果的性成熟和开花期，亚组Ⅲ中的 MdSPL23 和 MdSPL33 可能调控
苹果的株形结构和产量。这几个基因都是 miR156 的靶基因，值得重点关注和进一步研究。亚组Ⅰ
中的基因在苹果中显著的扩增，可能参与苹果特异性的发育调控。亚组Ⅵ中的基因虽然不是 miR156
的靶基因，但是在苹果中经历了多轮的串联复制，这些基因也可能行使重要功能。
本研究中首次发现 SBP-box 家族基因存在丰富的可变剪接现象，基因的可变剪接丰富了调控层
次，增加了植物发育的弹性和环境适应性。本研究得到的序列是苹果 SBP-box 家族基因众多剪切本
之一。对金冠苹果而言，尚未发现有多个转录本的报道，但是不排除存在多个转录本的可能。对
MdSPL33 而言，富士苹果中的该剪接本的 SBP-box 结构域是完整的，而金冠中克隆的剪接本在
SBP-box 结构域多出一段序列，表明富士中克隆的版本可能是剪接终产物，而金冠中的版本可能是
不完全剪接造成的。同时，不排除富士苹果中也存在金冠对应剪切本的可能。本研究中目前只克隆
了一个可变剪接本，随着研究的深入，更多的可变剪接本将会被克隆出来，届时可以更清晰地揭示
该家族基因在植物发育过程中的调控网络。
金冠和富士苹果在果实成熟、着色、软化等诸多性状上具有显著差异。本研究中发现 MdSPL11
和 MdSPL13 在两个品种间存在数个碱基和氨基酸差异。由于苹果基因组是高度杂合的，金冠苹果本
身在这些基因上具有 SNP 多态性，因此这些碱基和氨基酸的变异是否造成两者间性状的差异还需要
进一步研究。可以通过扩大测序群体进行关联分析来解析基因多态性和表型差异间的关系。

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