全 文 ：园艺学报，2016，43 (6)：1033–1043.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0719；http：//www. ahs. ac. cn 1033
收稿日期：2016–03–24；修回日期：2016–06–03
基金项目：国家自然科学基金项目（31171946）；农业部‘948’重点项目子课题（2011-G21）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：youchunxiang@126.com；Tel：15069897490）
苹果 MdDRB1 的表达与功能分析
任怡然，赵 强，赵先炎，郝玉金，由春香*
（山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，国家苹果工程技术研究中心，山东泰安 271018）
摘 要：以‘嘎拉’苹果（Malus × domestica‘Royal Gala’）为试材，扩增 MdDRB1 基因，分析其
序列结构，同时原核诱导 MdDRB1 蛋白并观察其亚细胞定位。利用 qRT-PCR 检测 MdDRB1 在非生物胁
迫下的表达量，通过遗传转化苹果苗鉴定 MdDRB1 在非生物胁迫中的功能。基因结构分析显示，MdDRB1
具有 2 个内含子和 3 个外显子。亚细胞定位显示，MdDRB1 主要定位于细胞核，少数定位在细胞质。原
核诱导结果显示，MdDRB1 融合蛋白以包涵体的形式存在。同时发现 MdDRB1 反义转基因愈伤中与抗性
相关的 miRNA 的表达水平上调。在 PEG、ABA、盐和低温处理的材料中 MdDRB1 的表达水平明显上调。
另外，MdDRB1 过量表达明显提高了转基因苹果组培苗的抗性。推测 MdDRB1 在抗逆胁迫响应中有重要
作用。
关键词：苹果；MdDRB1；原核表达；亚细胞定位；逆境响应
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）06-1033-11

Expression and Function Analysis of Apple MdDRB1 Gene
REN Yi-ran，ZHAO Qiang，ZHAO Xian-yan，HAO Yu-jin，and YOU Chun-xiang*
（College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，State Key Laboratory of Crop
Biology，National Research Center for Apple Engineering and Technology，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract：A gene named MdDRB1 cloned from Malus × domestica‘Royal Gala’was analyzed. To
understand sequence characteristics of the gene，prokaryotic expression and subcellular localization were
carried out. In addition，real-time quantitative PCR were performed to determine the expression levels of
MdDRB1 in response to various abiotic stresses. Finally，MdDRB1 was genetically transformed into apple
seedlings to identify its function. The analysis of gene structure revealed that there were two introns and
three exons in genomic sequence of MdDRB1. Subcellular localization showed that MdDRB1 were mainly
distributed in the nucleus，a small number distributed in the cytoplasm. Then，the induced protein showed
that MdDRB1 fusion protein existed in the form of inclusion body. Furthermore，the miRNA related to
resistance expression level raised in antisense transgenic apple callus. In addition，real-time quantitative
PCR found that the MdDRB1 gene expression level significantly raised after treated with PEG，NaCl，ABA
and 4 .℃ Overexpression of MdDRB1 remarkably increased the tolerance of transgenic apple seedlings to
abiotic stresses. These results indicated that MdDRB1 might be involved in the response of apple to abiotic
stresses.
Key words：apple；MdDRB1；prokaryotic expression；subcellular localization；stress esponse

Ren Yi-ran，Zhao Qiang，Zhao Xian-yan，Hao Yu-jin，You Chun-xiang.
Expression and function analysis of apple MdDRB1 gene.
1034 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (6)：1033–1043.
MicroRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度为 20 ~ 25 个核苷酸的非编码单链 RNA 分
子，在动植物中参与转录后基因表达调控。成熟的 miRNA 是由较长的可折叠形成发夹结构的前体
转录物经过 Dicer-Like 酶剪切加工而来。通过碱基配对与靶 mRNA 序列的 3′非翻译区或编码区结合
以调控基因的表达，对维护基因组稳定性，调控生物的生长发育以及对生物和非生物逆境胁迫起着
至关重要的作用（Bartel，2004；Mallory & Vaucheret，2006；Chuck et al.，2009）。miRNA 的合成
及其介导的基因沉默都需要多个蛋白组成的蛋白复合体起作用，其中 DCL1（Dicer-Like 1）与双链
RNA 结合蛋白 HYPONASTIC LEAVES 1（HYL1）、HEN1 等形成 RISC 复合体，参与成熟 miRNA
的合成，对植物生长发育起重要的作用（Han et al.，2004；Vazquez et al.，2004；Yang et al.，2006；
Fujioka et al.，2007；Dong et al.，2008）。并且遗传证据表明双链 RNA 的结合区域对于 miRNA 在生
物体内行使功能是必需的（Jacobsen et al.，1999；Schauer et al.，2002）。
双链 RNA 结合蛋白广泛存在于真核生物体中，在 RNA 加工和翻译、核定位、信号识别、发育
调节、转录激活等诸多方面起重要作用，还与对病毒的抗性等有关（Bandziulius et al.，1989；Dang
& Lee，1989；Römisch et al.，1990；Curtis et al.，1995；Saunders & Barber，2003；Curtin et al.，2008；
Eamens et al.，2009）。
拟南芥基因组编码 4 个双链 RNA 结合蛋白，即 DRB1、DRB2、DRB3 和 DRB4，其中 DRB1
（dsRNA-binding protein1）又被称为 HYL1，是拟南芥中发现最早、研究最透彻的双链 RNA 结合蛋
白，它与核酸内切酶 DCL1 和 C2H2 锌指蛋白 SERRATE（SE）共定位于细胞核并形成小体结构，
三者相互作用，精确高效地调控 pri-miRNA 到 pre-miRNA，和 pre-miRNA 到 miRNA 的加工，以及
成熟 miRNA 的积累（Park et al.，2002；Reinhart et al.，2002；Bartel & Bartel，2003）。HYL1 蛋白
的 N 端包含两个双链 RNA 结合结构域，与之最相似的蛋白是线虫中的 RDE-4，该蛋白是介导 RNAi
的蛋白复合体的重要组分，表明 HYL1 可能参与小分子 RNA 介导的基因沉默（Tabara et al.，2002）。
Lu 和 Fedoroff（2000）采用遗传学方法筛选到的 hyl1 突变体，植株矮小，晚花，叶片向上卷曲，部
分不育，根系生长慢、向地性差，并且对生长素和细胞分裂素不敏感，而对 ABA 超敏感。基因芯
片数据研究发现该突变体 hyl1干扰了许多miRNA的生物合成，其中与逆境响应相关的基因miR398、
miR393 和 miR408 的积累发生了明显的变化（Sunkar & Zhu，2004；Fujii et al.，2005；Liu et al.，
2008；Jia et al.，2009）。此外，hyl1 突变体中很多 miRNA 的靶基因不能被正常调控，从而导致突
变体的各种发育缺陷表型，表明 HYL1 蛋白是 miRNA 合成途径的重要组分（Hiraguri et al.，2005；
Kurihara et al.，2006；Yang et al.，2006；Song et al.，2007；Dong et al.，2008）。与 DRB1 相比，
其他双链 RNA 结合蛋白 DRB2、DRB3 和 DRB4 的研究较少。已有研究表明，DRB2 在 miRNA 生
物合成中起调节作用，并且DRB2和DRB4在调节 p4-siRNAs在体内的积累情况起重要作用（Pélissier
et al.，2011；Eamens et al.，2012）。与 DRB2 一样，DRB3 也在 miRNA 合成途径中起作用（Eamens
et al.，2012）。DRB4 可以与 DCL4 互作并形成蛋白复合体，参与调控 ta-siRNA（trans-acting siRNA）
的合成（Jakubiec et al.，2012）。
除拟南芥外，双链 RNA 结合蛋白对其他植物的正常发育也非常重要。在水稻中，与 AtDRB1
同源的基因 OsRBP 包含典型的双链 RNA 结合区域，并且该基因表达分析表明，其可能与种子和胚
的早期发育有关（唐向荣 等，2002）。与拟南芥中 FIERY2/CPL1 基因相似的 OsLMS 编码一个包含
CTD（carboxyl- terminal domain）和两个双链 RNA 结合基序，参与许多植物的生长过程，比如应激
反应（Undan et al.，2012）。在白菜等十字花科植物中克隆了双链 RNA 结合蛋白 BcpLH，该蛋白与
HYL1 序列相似，能够互补 hyl1 突变体的发育和 miRNA 合成缺陷，并且该基因与白菜的叶片发育
任怡然，赵 强，赵先炎，郝玉金，由春香.
苹果 MdDRB1 的表达与功能分析.
园艺学报，2016，43 (6)：1033–1043. 1035

和包叶性状高度相关，转基因研究也表明该基因对于白菜结球具有重要作用（Yu et al.，2000；余琳，
2005）。在番茄中异位表达苹果 MdDRB1 基因，转基因番茄株系对生长素更敏感，向光性增强，与
生长素相关的 miR393、miR164、miR160 表达量降低，miR167 表达量升高（赵先炎 等，2015）。
本实验室前期利用 RACE-PCR 技术克隆到了苹果的双链 RNA 结合蛋白 MdDRB1。功能鉴定表
明 MdDRB1 通过调控 miRNA 的积累和 miRNA 靶基因的转录水平参与苹果不定根的形成、叶片的
卷曲以及柱形苹果结构等（You et al.，2014）。前期研究发现 MdDRB1 过表达山荆子植株的根系和
生长势明显优于对照，推测可能调控植物抗逆性。为了进一步探究 miRNA 合成相关的双链 RNA 结
合蛋白 MdDRB1 的功能，本研究中分析了其亚细胞定位及其对不同逆境的响应情况。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2013 年 3 月开始，苹果材料为本实验室提供的‘嘎拉’苹果（Malus × domestica‘Royal
Gala’）组培苗。组培苗于 25 ℃长日照条件下（16 h 光照/8 h 黑暗）培养，无菌组培（MS 基本培养
基外加 0.8 mg · L-1 6-BA、0.2 mg · L-1 NAA、0.1 mg · L-1 GA），每 25 d 继代 1 次。
1.2 MdDRB1 的克隆
根据 MdDRB1 的 cDNA 序列设计特异引物 MdDRB1-F 和 MdDRB1-R，以‘嘎拉’叶片中的总
DNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 45 s，53 ℃退火 45 s，
72 ℃延伸 2 min，共进行 32 个循环；最后 72 ℃充分延伸 10 min。PCR 产物用 1.25%的琼脂糖凝胶
进行电泳并回收目的条带，连接至克隆载体 pMD18-T，转化大肠杆菌 DH5α 后进行分子克隆并测序。
1.3 MdDRB1 蛋白的原核诱导表达
分析 MdDRB1 编码区全长序列，设计上下游引物 MdDRB1（PGEX）-F 和 MdDRB1（PGEX）-R
进行 PCR 扩增，得到 MdDRB1 编码区原核表达全长 pMD18-T-MdDRB1。将含有 MdDRB1 编码区全
长的质粒和原核表达载体 pGEX-4T-1 用 BamHⅠ/SalⅠ双酶切，酶切产物用 T4 DNA 连接酶连接，
构建原核重组表达载体 pGEX-MdDRB1，转化大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞。挑取单菌落，在
37 ℃条件下，加入 0.2 mmol · L-1 IPTG（异丙基–β–D–硫代半乳糖苷）后在 0、1 和 3 h 时分别取
样，最后离心收集菌体，利用超声波破碎分离可溶性蛋白和包涵体，用 SDS-PAGE 电泳分离检测。
1.4 MdDRB1 蛋白的亚细胞定位
依据 MdDRB1 编码区全长 DNA 序列，设计一对特异引物 MdDRB1（PRI121-GFP）-F 和 MdDRB1
（PRI121-GFP）-R（表 1）进行 PCR 扩增。使用 XbaⅠ和 KpnⅠ两个限制性内切酶分别对含有 MdDRB1
编码区全长的质粒和表达载体 PBI121-GFP 进行双酶切，利用 T4 连接酶将两片段连接，构建融合表
达载体 35S：：MdDRB1-GFP，并转入根癌农杆菌 LBA4404 中，经 PCR 扩增鉴定阳性克隆，并用空
载体 35S：：GFP 为对照。利用农杆菌侵染法将构建好的表达载体和空载体导入洋葱表皮细胞，使用
激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，Zeiss 510 META，德国）观察细胞内绿色荧
光蛋白的表达情况。
Ren Yi-ran，Zhao Qiang，Zhao Xian-yan，Hao Yu-jin，You Chun-xiang.
Expression and function analysis of apple MdDRB1 gene.
1036 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (6)：1033–1043.
1.5 茎环 RT-PCR
茎环反转录 PCR（Stem-loop RT-PCR），具体方法参照文献（Chen et al.，2005）。茎环 PCR
反转录引物和检测成熟 miRNA 引物见表 1。
1.6 农杆菌介导的苹果愈伤组织遗传转化与鉴定
根据 MdDRB1 编码区全长 DNA 序列的特异功能区设计引物 MdDRB1（PBI121-anti）-F 和
MdDRB1（PBI121-anti）-R（表 1），进行 PCR 扩增。将扩增片段连接到克隆载体 pMD18-T 上，筛
选反向连接的阳性克隆、测序确定。将构建好的质粒和 pBI121 同时进行 XbaⅠ/SalⅠ双酶切，并连
接、转化，筛选得到序列正确的重组子 pBI121-anti-MdDRB。
利用农杆菌介导法，将反义抑制载体 pBI121-anti-MdDRB 转入‘王林’（Orin）苹果愈伤组织中，
经过 30 mg · L-1 Kan 抗性筛选 3 ~ 5 次后获得稳定生长的抗性愈伤组织。提取其 RNA 并反转录成
cDNA，检测 MdDRB1 mRNA 积累水平，鉴定 MdDRB1 反义转基因愈伤组织。

表 1 本研究中所用的引物序列
Table 1 Primers and sequences used in the study
引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence
MdDRB1-F 5′-ATGTCCACAAACGAAGGC-3′
MdDRB1-R 5′-CAAGTCCTCTCCTAGCATATAT-3′
MdDRB1（RT）-F 5′-AAGGTGACAGCCAAACTCTT-3′
MdDRB1（RT）-R 5′-CAGGGCGTCGTATTTCCAAA-3′
MdDRB1（PGEX）-F 5′-GCGGATCCATGTCCACAAACGAAGGC-3′
MdDRB1（PGEX）-R 5′-GCGTCGACCAAGTCCTCTCCTAGCATATAT-3′
MdDRB1（PRI121-GFP）-F 5′-TCTAGAATGTCCACAAACGAAGGC-3′
MdDRB1（PRI121-GFP）-R 5′-GGTACCGCACATATGTTGCACCTGCT-3′
MdDRB1（PRI121-anti）-F 5′-ATATCATGATGTGGCAGCTG-3′
MdDRB1（PRI121-anti）-R 5′-ATATATGCTAGGAGAGGACTTG-3′
miRNA393 stem-loop RT primer 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGATCA-3′
miR393-specific-F 5′-GTGTCCAAAGGGATCGCAT-3′
miR393-specific-R 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′
miRNA408 stem-loop RT primer 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCCGGCAATTCAGTTGAGCCGGGCA-3′
miR408-specific-F 5′-ACACTCCAGCTGGGTGCCAAAGGAG-3′
miR408-specific-R 5′-AACTGGTGTCGTGGAG-3′

1.7 MdDRB1 在不同胁迫下的表达分析
分别用 200 mmol · L-1 NaCl、100 μmol · L-1 ABA、15%PEG 模拟干旱和 4 ℃低温处理‘嘎拉’
组培苗，在 0、2、4、12 和 24 h 时分别取样，提取总 RNA。根据大连宝生物公司 PrimeScriptTM RT
reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒说明书合成 cDNA。根据 MdDRB1 序列设
计 RT-PCR 引物，选取 MdActin（GenBank accession number CN938024）为内参基因。PCR 反应体
系为：200 ng cDNA 1 μL，2.5 μL 10× Taq 缓冲液，2 μL dNTPs（2.5 mmol · L-1），上、下游引物各
1.0 μL（10 μmol · L-1）和 0.5 μL（5 U · μL-1）Taq DNA 聚合酶（全式金，中国），加去离子水至 25
μL。PCR 反应程序为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，28 ~ 32
个循环；PCR 产物 1%琼脂糖凝胶电泳。荧光定量 PCR 使用的仪器为 BIO-RAD IQ5（USA），所有
PCR 反应都设 3 次生物学重复。PCR 反应体系为：SYBR GreenⅠ Master 10 μL，上、下游引物浓度
为 0.5 μmol · L-1，模板 1 μL，加去离子水至 20 μL。PCR 反应程序为：94 ℃预变性 10 min，94 ℃ 10
s，60 ℃ 60 s，40 个循环；每次循环第 2 步进行荧光采集，最后退火至 65 ℃。
试验结果用 2-ΔΔCT 法对数据进行定量分析。
任怡然，赵 强，赵先炎，郝玉金，由春香.
苹果 MdDRB1 的表达与功能分析.
园艺学报，2016，43 (6)：1033–1043. 1037












图 1 MdDRB1 基因组序列 PCR 扩增
Fig. 1 PCR production of MdDRB1 genome
1.8 农杆菌介导的苹果的遗传转化
克隆苹果 MdDRB1 基因全长，连接 pBI121 的载体，测序成功后转入农杆菌（LBA 4404），侵染
苹果叶片。转基因苹果的获得按照 Wang 等（2012）的方法进行。提取待测转基因苹果总 RNA，反
转录得 cDNA 进行 PCR 检测。
2 结果与分析
2.1 MdDRB1 基因组序列的扩增
根据 MdDRB1（序列号：MDP0000304933）
的 cDNA 序列设计了特异引物 MdDRB1-F 和
MdDRB1-R，以‘嘎拉’叶片总 DNA 为模板
进行 PCR 扩增，得到一条远超过 2 000 bp 的特
异条带（图 1）。
测序结果发现该DNA条带的长度为 3 742
bp，与 cDNA 全长序列进行比对，发现 MdDRB1
的 ORF 区域包含两个内含子，Intron 1 和 Intron
2，Intron 1 在起始密码子下游第 27 个核苷酸后
插入，长度为 919 bp，Intron 2 在起始密码子下
游第 288 个核苷酸后插入，长度为 970 bp。5′-
和 3′-UTR 部分没有内含子，两个内含子将 MdDRB1 全长 cDNA 分割成 3 个外显子，Exon 1、Exon 2
和 Exon 3，长度分别为 164、261 和 1 428 bp（图 2）。








图 2 MdDRB1 基因组结构
Fig. 2 Genomic structure of MdDRB1 genome
2.2 MdDRB1 蛋白的亚细胞定位
激光共聚焦显微镜观察结果显示，对照 GFP 产生的绿色荧光分布于整个细胞中，而在
MdDRB1-GFP 融合蛋白的细胞中，GFP 绿色荧光主要分布在细胞核上，少数分布在细胞质中（图 3），
表明 MdDRB1 主要定位于细胞核，少数定位在细胞质上。
2.3 MdDRB1 蛋白的原核表达
如图 4 所示，空载体和未经 IPTG 诱导处理的蛋白提取物没有诱导蛋白产生，而 IPTG 诱导 1 h
和 3 h 的蛋白提取物都有 1 条约 80 kD 的条带，由于 pGEX-4T-1 载体中的 GST 标签大小为 26.7 kD，
所以该诱导蛋白的实际大小约为 53 kD，与 MdDRB1 预测蛋白的大小（52.2 kD）一致。表明本试验
Ren Yi-ran，Zhao Qiang，Zhao Xian-yan，Hao Yu-jin，You Chun-xiang.
Expression and function analysis of apple MdDRB1 gene.
1038 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (6)：1033–1043.
克隆的 MdDRB1 是 1 个完整的全长序列。另外，诱导产生的 MdDRB1 融合蛋白在大肠杆菌的上清
液中不存在，而是以包涵体的形式存在。



















图 3 洋葱表皮细胞中的 MdDRB1 亚细胞定位
Fig. 3 Subcellular localization analysis of MdDRB1 in onion epidermal cells
















图 4 MdDRB1 蛋白的 SDS-PAGE 分析
Fig. 4 SDS-PAGE analysis of MdDRB1 recombinant protein

2.4 转 MdDRB1 愈伤组织中抗性相关 miRNA 表达
由图 5 可以看出，在反义转基因愈伤组织中 MdDRB1 表达量明显低于野生型‘王林’（WT），
表明获得了 MdDRB1 反义转基因愈伤组织。本课题组前期利用 miRNA 芯片技术分析了 MdDRB1 反
义转基因愈伤组织中的 miRNA 积累，发现有许多与抗性相关的 miRNA 表达上调或者下调（You et
al.，2014）。因此，利用茎环 RT-PCR（Stem-loop RT-PCR）检测了两个与抗性相关的 miRNA 表达。
结果发现：与野生型相比，miR393 和 miR408 在反义转基因愈伤组织中表达上调（图 6）。暗示 MdDRB1
可能参与苹果抗逆性调节。
任怡然，赵 强，赵先炎，郝玉金，由春香.
苹果 MdDRB1 的表达与功能分析.
园艺学报，2016，43 (6)：1033–1043. 1039

图 5 半定量 RT-PCR 分析野生型、MdDRB1
反义表达愈伤组织
Fig. 5 Semi-quantitative RT-PCR analysis of MdDRB1
expression in wild type（WT）and antisense
transgenic line（MdDRB1-anti）
图 6 野生型、MdDRB1 反义表达愈伤中 miR393 和
miR408 茎环 RT-PCR 检测
Fig. 6 Stem-loop RT-PCR analysis of mature miR393 and
miR408 in wild type（WT）and antisense
transgenic line（MdDRB1-anti）







2.5 MdDRB1 在非生物胁迫下的表达分析
如图 7 所示，15%PEG、200 mmol · L-1 NaCl、100 μmol · L-1ABA 和 4 ℃低温均能明显诱导
MdDRB1 表达。在 ABA 和 NaCl 处理条件下，该基因在处理 2 h 时表达量急剧升高，之后下降至未
处理时的水平。而在 PEG 模拟干旱和低温诱导条件下，MdDRB1 随处理时间增加表达量逐渐升高，
在处理 12 h 时达到最高值，之后降低。

















图 7 MdDRB1 基因在非生物胁迫下的表达水平
Fig. 7 Expression pattern of MdDRB1 gene under abiotic stress

2.6 MdDRB1 过量表达对苹果组培苗抗性的影响
用定量 PCR 的方法检测转基因株系中 MdDRB1 的表达量，证明 MdDRB1 确实转入苹果组培
Ren Yi-ran，Zhao Qiang，Zhao Xian-yan，Hao Yu-jin，You Chun-xiang.
Expression and function analysis of apple MdDRB1 gene.
1040 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (6)：1033–1043.










图 8 MdDRB1 转基因株系（L1 ~ L3）的鉴定
Fig. 8 Identification of MdDRB1 transgenic lines（L1–L3）





















图 9 野生型 WT 和转基因苹果组培苗（L1 ~ L3）的抗性情况
Fig. 9 Phenotypes of resistance in WT and
transgenic lines（L1–L3）
苗中（图 8）。同时，将转基因组培苗（L1 ~ L3）与野生型组培苗 WT 在 200 mmol · L-1 NaCl、
50 μmol · L-1ABA 和 4 ℃低温条件下培养，从
图 9 可以明显看出，MdDRB1 过量表达的转基
因组培苗长势明显比野生型好。野生型植株叶
片萎蔫，叶色较黄。由此可知，MdDRB1 在植
物体内的过量表达提高了转基因苹果组培苗的
抗逆性。
3 讨论
双链 RNA 结合蛋白广泛存在于人类、果蝇、酵母和病毒等生物体中，在多种生命活动中具有
重要功能（Saunders & Barber，2003；Curtin et al.，2008；Eamens et al.，2009）。所有双链 RNA 结
合蛋白都包含有 1 个或者多个 dsRNA 结合区域（dsRNA-Binding domain，DRBD）或结合基序
（dsRNA-Binding Motif，DRBM），真核生物双链 RNA 结合蛋白的大多数具有 1 ~ 2 个 dsRNA 结合
区，但有的可以多达 5 个（Saunders & Barber，2003）。在拟南芥中，研究者利用遗传学方法鉴定了
6 个具有双链 RNA 结合域的蛋白（DCL1、DCL2、DCL3、HYL1、HEN1 和 CPL1）的功能，
AtHYL1/AtDRB1 与 AtDCL1 蛋白是研究最为清楚和深入的 dsRNA 结合蛋白，在 N 端和 C 端分别
包含有两个 dsRNA 结合区域，能够非特异性地结合双链 RNA，但不能结合单链 RNA、双链 DNA
和单链 DNA，这对 pri-和 pre-miRNA 的加工是至关重要的（Krovat & Jantsch，1996；Hiraguri et al.，
2005；Yang et al.，2010）。在白菜中与 HYL1 同源的蛋白 BcpLH 的 N 端也包含两个 dsRNA 结合
域（余琳，2005）。本实验室前期研究发现 MdDRB1 蛋白与 HYL1 的亲缘关系较近，在进化树分析
中被聚在同一个进化簇中，其 N 端氨基酸序列与 HYL1 相似，也具有两个 dsRNA 结合区域，并且
能够非特异结合双链 RNA（You et al.，2014）。本研究中以‘嘎拉’叶片总 DNA 为模板，扩增了
MdDRB1 基因组序列，结果显示其含有 3 个外显子和 2 个内含子。AtHYL1 蛋白主要定位在拟南芥
细胞核中，在细胞质中也有少量定位（Han et al.，2004；Fujioka et al.，2007；Lesicka-Górecka et al.，
2008）。与之相似，MdDRB1 也主要定位在细胞核，少数点位在细胞质。原核诱导结果表明 MdDRB1
能够编码完整的蛋白行使功能。以上结果暗示 MdDRB1 可能与 HYL1、BcpLH 等具有相似的功能。
任怡然，赵 强，赵先炎，郝玉金，由春香.
苹果 MdDRB1 的表达与功能分析.
园艺学报，2016，43 (6)：1033–1043. 1041

miRNA 本身不编码蛋白质，而是通过和靶基因 mRNA 的碱基配对引导沉默复合体（RISC）降
解 mRNA 或阻碍其翻译调节靶基因的表达水平，实现对植物生长发育的调控（Bartel，2004）。在
拟南芥中的研究发现，双链 RNA 结合蛋白 HYL1 在调节 miRNA 的积累过程中具有重要的作用（Han
et al.，2004）。HYL1 蛋白在维持叶片的极性发育中主要是通过影响 miR165 等的积累，进而导致其
靶基因 REV 等表达失调，最终影响叶片的极性发育（Yu et al.，2005）。在苹果中过量表达 MdDRB1
会引起部分与生长素有关的 miRNAs 表达降低，也使得它们的靶基因表达升高，对生长素更敏感，
促进不定根的形成，而且 MdDRB1 正反义基因转化苹果愈伤组织后使其生长速度变慢（Wang et al.，
2005；You et al.，2014）。本实验室前期利用 miRNA 芯片技术发现 MdDRB 反义转基因愈伤中的
miRNA 形成受到干扰，相对于对照，MdDRB 反义转基因愈伤组织中显著下调的 miRNA 有 95 个，
如 miR153、miR156、miR157、miR160、miR165、miR399 等；显著上调的 miRNA 有 74 个，如
miR159、miR168、miR172、miR393、miR398、miR408 等，表明 MdDRB1 介导了苹果中 miRNA
的合成与积累（You et al.，2014）。
越来越多的研究表明，miRNAs 在真核生物发育过程和应激反应的基因表达调控中起着重要的
作用。植物受非生物胁迫时，miRNA 通常以两种方式参与基因表达调控。一是通过胁迫诱导 miRNA
水平的上调，降低其靶基因的水平。二是通过下调 miRNA 水平，造成其靶基因的积累，从而正调
控植物的胁迫抗性。在拟南芥中 miR393 受胁迫调控表达，在寒冷、干旱、高盐及 ABA 处理后强烈
表达（Kruszka et al.，2012）。试验证明 miR393 的靶基因是生长素受体 TIRI、AFB1、AFB2 和 AFB3，
影响生长素反应过程中的多个方面，通过降解靶基因的方式负调控基因的表达（Windels & Vazquez，
2011）。miR408 是植物中高度保守的 32 个 miRNAs 之一（Sun，2012）。研究表明 miR408 也直接
参与胁迫应答反应（Sunkar et al.，2005），而且拟南芥 miR408 基因的上游含有诸多胁迫相关元件，
比如 ABA 响应元件 ABREs，低温响应元件 LTRs 等（Liu et al.，2008）。干旱胁迫时，miR408 的
表达量上调，特异性地剪切其靶基因 planacyanin 的 mRNA，进而抑制其生物合成，减少铜离子的
消耗（Trindade et al.，2010）。同时通过微阵列技术分析表明，拟南芥中 miR408 的表达量也是上调
的（Liu et al.，2008）。因此，本研究中根据芯片数据，对两个与抗性相关的 miRNA 进行茎环 RT-PCR
分析，发现在反义转基因愈伤中 miR393 和 miR408 表达升高，与芯片测定结果一致。MdDRB1 蛋白
是苹果 miRNA 生物合成途径的重要组分，因此 MdDRB1 可能通过正调控其靶基因的表达提高植株
的抗逆性。而且在不同逆境胁迫处理下，MdDRB1 基因的表达也受胁迫诱导。同时在高盐、ABA、
低温胁迫下，MdDRB1 过量表达的苹果组培苗长势明显比野生型好。由此可知，MdDRB1 基因在植
物体内的过量表达提高了转基因苹果组培苗的抗逆性。
综上，苹果 MdDRB1 能够参与多种非生物胁迫过程，为深入研究该基因的功能及利用基因工程
手段培育抗逆新种质提供了理论基础。

References
Bandziulius R J，Swanson M S，Dreyfuss G. 1989. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev，3 (4)：431–437.
Bartel B，Bartel D P. 2003. MicroRNAs：at the root of plant development? Plant Physiology，132 (2)：709–717.
Bartel D P. 2004. MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function. Cell，116 (2)：281–297.
Chen C，Ridzon D A，Broomer A J，Zhou Z，Lee D H，Nguyen J T，Barbisin M，Xu N L，Mahuvakar V R，Andersen M R，Lao K Q，Livak
K J，Guegler K J. 2005. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop-RT-PCR. Nucleic Acids Res，33 (20)：e179.
Chuck G，Candela H，Hake S. 2009. Big impacts by small RNAs in plant development. Current Opinion in Plant Biology，12 (1)：81–86.
Curtin S J，Watson J M，Smith N A，Eamens A L，Blanchard C L，Waterhouse P M. 2008. The roles of plant dsRNA-binding proteins in RNAi-like
Ren Yi-ran，Zhao Qiang，Zhao Xian-yan，Hao Yu-jin，You Chun-xiang.
Expression and function analysis of apple MdDRB1 gene.
1042 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (6)：1033–1043.
pathways. FEBS Letters，582 (18)：2753–2760.
Curtis D，Lehmann R，Zamore P D. 1995. Translational regulation in development. Cell，81 (2)：171–178.
Dang C V，Lee W M. 1989. Nuclear and nucleolar targeting sequences of c-erb-A，c-yb，N-myc，p53，HSP70，and HIV tat proteins. Journal of
Biological Chemistry，264 (30)：18019–18023.
Dong Z，Han M H，Fedoroff N. 2008. The RNA-binding proteins HYL1 and SE promote accurate in vitro processing of pri-miRNA by DCL1.
Proceedings of the National Academy of Sciences，105 (29)：9970–9975.
Eamens A L，Kim K W，Curtin S J，Waterhouse P M. 2012. DRB2 is required for microRNA biogenesis in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE，7940：
e35933.
Eamens A L，Smith N A，Curtin S J，Wang M B，Waterhouse P M. 2009. The Arabidopsis thaliana double-stranded RNA binding protein DRB1
directs guide strand selection from microRNA duplexes. RNA，15 (12)：2219–2235.
Fujii H，Chiou T J，Lin S I，Aung K，Zhu J K. 2005. A mirna involved in phosphate-starvation response in Arabidopsis. Current Biology，15 (22)：
2038–2043.
Fujioka Y，Utsumi M，Ohba Y，Watanabe Y. 2007. Location of a possible miRNA processing site in SmD3/SmB nuclear bodies in Arabidopsis. Plant
Cell Physiology，48 (9)：1243–1253.
Han M H，Goud S，Song L，Fedoroff N. 2004. The Arabidopsis double-stranded RNA-binding protein HYL1 plays a role in microRNA-mediated
gene regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences，101 (4)：1093–1098.
Hiraguri A，Itoh R，Kondo N Y，Aizawa D，Murai Y，Koiwa H，Seki M，Shinozaki K，Fukuhara T. 2005. Specific interactions between Dicer-like
proteins and HYL1/DRB-family dsRNA-binding proteins in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology，57 (2)：173–188.
Krovat B C，Jantsch M F. 1996. Comparative mutational analysis of the double-stranded RNA binding domains of Xenopus laevis RNA-binding
protein A. Journal of Biological Chemistry，271 (45)：28112–28119.
Kruszka K，Pieczynski M，Windels D，Bielewicz D，Jarmolowski A，Szweykowska-Kulinska Z，Vazquez F. 2012. Role of microRNAs and other
sRNAs of plants in their changing environments. Journal of Plant Physiology，169 (16)：1664–1672.
Kurihara Y，Takashi Y，Watanabe Y. 2006. The interaction between DCL1 and HYL1 is important for efficient and precise processing of pri-miRNA
in plant microRNA biogenesis. RNA，12 (2)：206–212.
Jacobsen S E，Running M P，Meyerowitz E M. 1999. Disruption of an RNA helicase/RNaseIII gene in Arabidopsis causes unregulated cell division in
floral meristems. Development，126 (23)：5231–5243.
Jakubiec A，Yang S W，Chua N H. 2012. Arabidopsis DRB4 protein in antiviral defense against Turnip yellow mosaic virus infection. Plant Journal，
69 (1)：14–25.
Jia X Y，Wang W X，Ren L G，Chen Q J，Mendu V，Willcut B，Dinkins R，Tang X Q，Tang G L. 2009. Differential and dynamic regulation of
miR398 in response to ABA and salt stress in Populus tremula and Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology，71 (1)：51–59.
Lesicka-Górecka J，Szarzyńska B，Sawczak M，Bagdiul I.，Górski P，Jarmołowski A，Szweykowska-Kulińska Z. 2008. Abscisic acid does not
influence the subcellular distribution of the HYL1 protein from Arabidopsis thaliana. Acta Biochimica Polonica，55 (3)：517–524.
Liu H H，Tian X，Li Y J，Wu C A，Zheng C C. 2008. Microar- ray-based analysis of stress-regulated microRNAs in Arabidopsis thaliana. RNA，
14 (5)：836–843.
Lu C，Fedoroff N. 2000. A mutation in the Arabidopsis HYL1 gene encoding a dsRNA binding protein affects responses to abscisic acid，auxin，and
cytokinin. The Plant Cell，12 (12)：2351–2365.
Mallory A C，Vaucheret H. 2006. Erratum：Functions of microRNAs and related small RNAs in plants. Nature Genetics，38：S31–S38.
Park W，Li J，Song R，Messing J，Chen X. 2002. CARPEL FACTORY，a dicer homolog，and HEN1，a novel protein，act in microRNA metabolism
in Arabidopsis thaliana. Current Biology，12 (17)：1484–1495.
Pélissier T，Clavel M，Chaparro C，Pouch-Pélissier M N，Vaucheret H，Deragon J M. 2011. Double-stranded RNA binding proteins DRB2 and DRB4
have an antagonistic impact on polymerase IV-dependent siRNA levels in Arabidopsis. RNA，17 (8)：1502–1510.
Reinhart B J，Weinstein E G，Rhoades M W，Bartel B，Bartel D P. 2002. MicroRNAs in plants. Genes Dev，16 (13)：1616–1626.
Römisch K，Webb J，Lingelbach K，Gausepohl H，Dobberstein B. 1990. The 54-kD protein of signal recognition particle contains a methionine-rich
RNA binding domain. Cell Biology，111：1793–1802.
任怡然，赵 强，赵先炎，郝玉金，由春香.
苹果 MdDRB1 的表达与功能分析.
园艺学报，2016，43 (6)：1033–1043. 1043

Saunders L R，Barber G N. 2003. The dsRNA binding protein family：critical roles，diverse cellular functions. The FASEB Journal，17 (9)：
961–983.
Schauer S E，Jacobsen S E，Meinke D W，Ray A. 2002. DICER-LIKE1：blind men and elephants in Arabidopsis development. Trends Plant Sci，
7 (11)：487–491.
Song L，Han M H，Lesicka J，Fedoroff N. 2007. Arabidopsis primary microRNA processing proteins HYL1 and DCL1 define a nuclear body distinct
from the Cajal body. Proceedings of the National Academy of Sciences，104 (13)：5437–5442.
Sun G. 2012. MicroRNAs and their diverse functions in plants. Plant Molecular Biology，80 (1)：17–36.
Sunkar R，Girke T，Jain P K，Zhu J K. 2005. Cloning and characterization of microRNAs from rice. The Plant Cell，17 (5)：1397–1411.
Sunkar R，Zhu J K. 2004. Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAs from Arabidopsis. The Plant Cell，16 (8)：2001–2019.
Tabara H，Yigit E，Siomi H，Mello C C. 2002. The dsRNA binding protein RDE-4 interacts with RDE-1，DCR-1，and a DExH-box helicase to direct
RNAi in C. elegans. Cell，109 (7)：861–871.
Tang Xiang-rong，Wu Hao，Jia Ming，Yu Xu-hong，He Yu-ke. 2002. Isolation and expressional analysis of cDNA encoding a dsRNA binding protein
homologue OsRBP of rice. Plant Physiol Mol Biol，28 (1)：41–45. (in Chinese)
唐向荣，吴 昊，贾 明，余旭红，何玉科. 2002. 水稻双链 RNA 结合蛋白同源基因 OsRBP 的克隆及其表达的分析. 植物生理与分子
生物学学报，28 (1)：41–45.
Trindade I，Capitão C，Dalmay T，Fevereiro M P，Dos Santos D M. 2010. miR398 and miR408 are up-regulated in response to water deficit in
Medicago truncatula. Planta，231 (3)：705–716.
Undan J R，Tamiru M，Abe A，Yoshida K，Kosugi S，Takagi H，Yoshida K，Kanzaki H，Saitoh H，Fekih R，Sharma S，Undan1 J，Yano M，
Terauchi R. 2012. Mutation in OsLMS，a gene encoding a protein with two double-stranded RNA binding motifs，causes lesion mimic phenotype
and early senescence in rice（Oryza sativa L.）. Genes & Genetic Systems，87 (3)：169–179.
Wang J W，Wang L J，Mao Y B，Cai W J，Xue H W，Chen X Y. 2005. Control of root cap formation by microRNA-targeted auxin response factors
in Arabidopsis. The Plant Cell Online，17 (8)：2204–2216.
Wang R K，Li L L，Cao Z H，Zhao Q，Li M，Zhang L Y，Hao Y J. 2012. Molecular cloning and functional characterization of a novel apple MdCIPK6L
gene reveals its involvement in multiple abiotic stress tolerance in transgenic plants. Plant Molecular Biology，79 (1–2)：123–135.
Windels D，Vazquez F. 2011. miR393：Integrator of environmental cues in auxin signaling? Plant Signal Behav，6 (11)：1673–1675.
Vazquez F，Gasciolli V，Crété P，Vaucheret H. 2004. The nuclear dsRNA binding protein HYL1 is required for microRNA accumulation and plant
development，but not posttranscriptional transgene silencing. Current Biology，14 (4)：346–351.
Yang L，Liu Z，Lu F，Dong A，Huang H. 2006. SERRATE is a novel nuclear regulator in primary microRNA processing in Arabidopsis. The Plant
Journal，47 (6)：841–850.
Yang J S，Maurin T，Robine N，Rasmussen K D，Jeffrey K L，Chandwani R，Papapetrou E P，Sadelain M，O’Carroll D，Lai E C. 2010. Conserved
vertebrate mir-451 provides a platform for Dicer-independent，Ago2-mediated microRNA biogenesis. Proceedings of the National Academy of
Sciences，107 (34)：15163–15168.
You C X，Zhao Q，Wang X F，Xie X B，Feng X M，Zhao L L，Shu H R，Hao Y J. 2014. A dsRNA-binding protein MdDRB1 associated with miRNA
biogenesis modifies adventitious rooting and tree architecture in apple. Plant Biotechnology Journal，12 (2)：183–192.
Yu Lin. 2005. Molecular mechanism involved in gene regulation of leaf curvature [Ph. D. Dissertation]. Graduate School of Chinese Academy of
Sciences（Shanghai Institutes for Biological Sciences）. (in Chinese)
余 琳. 2005. 叶卷曲基因调控机制的研究[博士论文]. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）.
Yu L，Yu X，Shen R，He Y. 2005. HYL1 gene maintains venation and polarity of leaves. Planta，221 (2)：231–242.
Yu X，Peng J，Feng X，Yang S，Zheng Z，Tang X，Shen R，Liu P，He Y. 2000. Cloning and structural and expressional characterization of BcpLH
gene preferentially expressed in folding leaf of Chinese cabbage. Science in China Series C：Life Sciences，43 (3)：321–329.
Zhao Xian-yan，Zhao Qiang，Liu Xin，Hao Yu-jin，You Chun-xiang. 2015. Ectopic expression and functional research of apple MdDRB1 gene in
tomato. Journal of Fruit Science，32 (2)：177–185. (in Chinese)
赵先炎，赵 强，刘 鑫，郝玉金，由春香. 2015. 苹果 MdDRB1 基因在番茄中异位表达与功能研究. 果树学报，32 (2)：177–185.