全 文 ：园艺学报，2016，43 (6)：1107–1116.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0144；http：//www. ahs. ac. cn 1107
收稿日期：2016–04–25；修回日期：2016–06–13
基金项目：农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室开放基金课题（KFJJ20150103）；新疆农业大学产学研联合培养研究
生基金项目（xjaucxy-yjs-20131024）
* 并列第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：luomingxjau@sina.com）
新疆哈密瓜病毒的 DAS-ELISA 检测和分子鉴定
潘亚南 1,2,*，韩 剑 1,2,*，吴海波 3，吉艳玲 4，王纯利 5，刘 芳 5，罗 明 1,2,**，
张祥林 6
（1 新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052；2新疆自治区高校农林有害生物监测与安全防控重点实验室，乌鲁木齐
830052；3 新疆农业科学院哈密瓜研究中心，乌鲁木齐 830091；4 吐鲁番市农业技术推广中心，新疆吐鲁番 838000；
5鄯善县农业技术推广中心，新疆吐鲁番 838200；6 新疆出入境检验检疫局，乌鲁木齐 830063）
摘 要：为了明确当前新疆哈密瓜病毒病的主要毒原种类及其遗传分化，为哈密瓜病毒病害的防治
提供科学依据，对吐鲁番、鄯善、昌吉等哈密瓜主产区的病毒病调查、采样，采用双抗体夹心酶联免疫
吸附法（DAS–ELISA）和 RT-PCR 技术对侵染哈密瓜的 7 种主要病毒及瓜类重要检疫性病毒——黄瓜绿
斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）进行检测和分子鉴定。结果表明：在所检
测的 121 个样品中，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的检出率最高，为 70.2%；西瓜花叶
病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）和小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）
次之，分别为 62.0%和 37.2%，甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus，MNSV）的检出率仅为 2.5%，
CGMMV、南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus，SqMV）、番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus W，
PRSV-W）和烟草坏死病毒（Tobacco necrosis virus，TNV）未检测到。CMV、WMV、ZYMV 在田间分布
广泛，2 种及 3 种病毒的复合侵染发生普遍（60.19%）。对各病毒分离物进行 CP 基因扩增、序列测定和
系统发育分析，确定了 CMV 新疆哈密瓜分离物归属于 CMV 亚组ⅠB。ZYMV、WMV 和 MNSV 与已报
道的病毒株系 CP 基因核苷酸序列具有较高的同源性，但存在一定的变异，ZYMV 和 WMV 具有明显的
地域分化现象。
关键词：哈密瓜；病毒；反转录 PCR；复合侵染；遗传变异
中图分类号：S 652.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）06-1107-10

Detection of Viruses Infecting Hami Melon and Their Molecular
Identification in Xinjiang
PAN Ya-nan1,2,*，HAN Jian1,2,*，WU Hai-bo3，JI Yan-ling4，WANG Chun-li5，LIU Fang5，LUO Ming1,2,**，
and ZHANG Xiang-lin6
（1Agronomy College，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2Key Laboratory of Harmful Biological
Monitoring and Safety Prevention of Xinjiang Autonomous Region Forestry Universities，Urumqi 830052，China；3Hami
Melon Research Center，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China；4Turpan Agricultural
Technology Extension Center，Turpan，Xinjiang 838000，China；5Shanshan Agricultural Technology Extension Center，
Turpan，Xinjiang 838200，China；6Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Urumqi 830063，China）

Pan Ya-nan，Han Jian，Wu Hai-bo，Ji Yan-ling，Wang Chun-li，Liu Fang，Luo Ming，Zhang Xiang-lin.
Detection of viruses infecting Hami melon and their molecular identification in Xinjiang.
1108 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (6)：1107–1116.
Abstract：This research aims at identifying the currently prevailing viruses infecting Hami melon in
Xinjiang and their genetic variations for providing scientific basis to prevent these virus diseases. Field
survey was conducted in Turpan，Shanshan and Changji and samples with viral symptoms were collected
for the lab tests. Both DAS-ELISA and RT-PCR were applied for the detection and molecular identification
of 7 common viruses as well as Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）the important quarantine
virus infecting Hami melon. The results showed that the detection rates of Cucumber mosaic virus
（CMV），Watermelon mosaic virus（WMV），Zucchini yellow mosaic virus（ZYMV），and Melon necrotic
spot virus（MNSV）amongst the 121 detected samples were 70.2%，62.0%，37.2%，and 2.5% respectively，
whereas Squash mosaic virus （SqMV），Papaya ring spot virus（PRSV），CGMMV and Tobacco necrosis
virus（TNV）had not detected as positive. CMV，WMV and ZYMV are widely distributed in the field.
Mixed infection with two or three different viruses on the same individual host was common with an
occurrence of 60.19%. Based on the CP gene amplification，sequencing and phylogenetic analysis，CMV
isolates from Hami melon in Xinjiang were categorized into subgroupⅠB. Although WMV，ZYMV and
MNSV had high homology with other reported strains in CP gene nucleotide sequence，there were still
some variations. ZYMV and WMV had a significant geographical differentiation.
Key words：Hami melon；virus；RT-PCR；mixed infection；genetic variation

哈密瓜是新疆特色经济的优势产业。当前哈密瓜生产面临的主要障碍是病害问题，尤其是病毒
病流行，至少造成 20% ~ 50%的减产。病毒病导致哈密瓜含糖量降低，品质变差，对二茬瓜（秋瓜）
的危害更为严重，重病田几乎全田发生，造成大面积减产甚至绝收，极大地限制了哈密瓜产业的发展。
国内外已报道的侵染危害瓜类的病原病毒有 38 种以上。在新疆普遍发生且危害严重的主要有
黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、
小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus，
SqMV）、甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus，MNSV）和番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot
virus W，PRSV-W）等（郑光宇，2005；刘卫荣，2008）。CMV 是黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）
的典型成员，具有高度变异性和适应性强的特点。其核酸为三分体单链正义 RNA，基因组 RNA3 3′
端的 ORF 通过亚基因组 RNA4 编码外壳蛋白 CP。WMV 和 ZYMV 均属于马铃薯 Y 病毒属
（Potyvirus），基因组为单分子正义单链 RNA。MNSV 属于香石竹斑驳病毒属（Carmovirus），基因
组为单分子正义单链 RNA，寄主仅限于葫芦科的一些植物，中国在 2007 年首次于江苏省海门市的
温室甜瓜上发现该病毒（吴会杰和古勤生，2015）。不同种类的病毒在田间往往复合侵染，混合发生。
受害植株症状表现复杂，出现花叶、皱缩、叶脉黄化，生长点坏死，瓜蔓焦枯、瓜小、开裂、畸形
等多种症状，仅从症状上难以区分病原，不同地区主导流行病毒毒原种类和种群株系分化存在较大
差异，在血清型、寄主范围、致病性等方面都表现出一定的变化。黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber
green mottle mosaic virus，CGMMV）是侵染瓜类作物的毁灭性病毒（Ali et al.，2012），中国将其列
为新的外来入侵检疫性病害。近年来陆续在中国辽宁、河北、湖北、广东、山东、甘肃等地发现
CGMMV，局部地区已造成爆发性危害。目前新疆尚无 CGMMV 的报道。本研究中通过调查吐鲁番、
鄯善、昌吉等哈密瓜主产区病毒病的发生情况，采集典型病样，针对重要病毒采用双抗体夹心酶联
免疫吸附法（DAS-ELISA）和 RT-PCR 技术进行检测和鉴定，以明确当前哈密瓜生产中病毒病的种
类及其种群区系分布情况，为病害的诊断、抗病育种和综合防治提供科学依据。
潘亚南，韩 剑，吴海波，吉艳玲，王纯利，刘 芳，罗 明，张祥林.
新疆哈密瓜病毒的 DAS-ELISA 检测和分子鉴定.
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1 材料与方法
1.1 新疆哈密瓜主栽区病毒病发生情况调查及样品采集
2014 和 2015 年在新疆哈密瓜主产区吐鲁番市（吐鲁番市农业科学研究所试验地、皇家瓜园、
二堡乡、三堡乡、阿瓦提乡）、鄯善县（迪坎乡）和昌吉市（园艺场）等地调查病毒病发生情况，并
采集疑似病毒病样品共 121 份（表 1）。样品保存于 4 ℃冰箱和液氮中。

表 1 采集样品信息
Table 1 Information of the collected materials
样品编号
Sample No.
样品数
Number of
sample
症状
Symptom
采样地点
Sampling site
采样时间
Sampling time
T1 ~ T24 24 花叶（18），斑驳（9），皱缩（5）
Mosaic（18），mottled（9），wrinkled（5）
吐鲁番农业科学研究所
Turpan Academy of
Agricultural Sciences
2014–06–15
（头茬 First crop）
T25 ~ T41 17 花叶（13），畸形（2），皱缩（4）
Mosaic（13），deformity（2），wrinkled（4）
吐鲁番皇家瓜园
Turpan Royal Inundated
Watermelon patches
2014–06–15
（头茬 First crop）
SO2-1 ~ SO2-10 10 皱缩（3），花叶（6），畸形（1），斑驳（3）
Wrinkled（3），mosaic（6），deformity（1），
mottled（3）
鄯善县迪坎乡卡孜库里村
Kazikuli Village Dikan
Town Shanshan City
2014–07–24
（二茬 Second crop）
SO3-1 ~ SO3-8 8 皱缩（2），花叶（7），叶片表面有泡状突起（1）
Wrinkled（2），mosaic（7），bubble-like protrusions
on leaves（1）
鄯善县迪坎乡叶孜坎村
Yezikan Village Dikan Town
Shanshan City
2014–07–24
（二茬 Second crop）
T-1-1 ~ T-1-7、
T-2-1 ~ T-2-9
16 皱缩（4），花叶（15），叶片表面有泡状突起（3）
Wrinkled（4），mosaic（15），bubble-like protrusions
on leaves（3）
吐鲁番三堡乡
Sanpu Town Turpan City
2014–07–24
（二茬 Second crop）
J1 ~ J12 12 花叶（11），叶片黄化（1），皱缩（3），叶脉坏死（1）
Mosaic（11），leaf yellowing（1），wrinkled（3），
vein necrosis（1）
昌吉市园艺场
Changji Horticultural Field
2014–09–10
（头茬 First crop）
N1 ~ N15 15 叶片黄化（2），花叶（13），叶脉颜色深绿（2）
Leaf yellowing（2），mosaic（13），dark green veins（2）
吐鲁番农科所
Turpan Academy of
Agricultural Sciences
2015–06–10
（头茬 First crop）
S1 ~ S5 5 叶片黄化（2），轻花叶（4）
Leaf yellowing（2），light mosaic（4）
鄯善县周边
Surrounding Shanshan City
2015–06–10
（头茬 First crop）
A1 ~ A3 3 叶片黄化（1），皱缩（2）
Leaf yellowing（1），wrinkled（2）
吐鲁番阿瓦提乡
Awati Town Turpan City
2015–06–10
（头茬 First crop）
S2-1 ~ S2-11 11 叶片黄化（2），花叶（8），畸形（2）
Leaf yellowing（2），mosaic（8），deformity（2）
鄯善县周边
Surrounding Shanshan City
2015–07–28
（二茬 Second crop）

1.2 双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS–ELISA）检测 CGMMV
用于 DAS-ELISA 检测 CGMMV 的抗体及阳性对照样品为美国 Agdia 公司产品。取采集到的新
鲜待测样品按 0.1 g · mL-1 加入样品抽提缓冲液中充分研磨，将样品、阳性对照及阴性对照分别加入
到酶联板反应孔中，室温条件下于黑暗潮湿环境中孵育 2 h。具体检测步骤参照产品说明书。
1.3 RT-PCR 扩增
1.3.1 引物的设计与合成
根据文献已报道和GenBank数据库中已公布的7种瓜类主要病毒（CMV、WMV、ZYMV、MNSV、
SqMV、PRSV、TNV）及瓜类重要检疫性病毒黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的外壳蛋白基因（CP）
保守序列，分别设计病毒的特异性引物（表 2）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
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表 2 用于 RT-PCR 反应的哈密瓜病毒引物对
Table 2 List of primers pairs used for detection of Hami-melon viruses in RT-PCR
病毒
Virus
正向引物序列（5′–3′）
Forward primers sequence
反向引物序列（5′–3′）
Reverse primers sequence
目标片段大小/bp
Product size
退火温度/℃
Annealing temperature
CMV ATGGACAAATCTGAATCAACC TAAGCTGGATGGACAACCCGT 780 63
WMV GGTTGCTGCGAATCAGTGTC CGACCCGAAATGCTAACT 852 55
ZYMV GAGATGAGAAATGCAGAGGCACC TTCCGACAGGACTACGGCAC 449 68
MNSV GGAGGCAACATTTCGTACA AGAGACCAAGCGATCAAAC 651 54
SqMV CATGGTACAGCAGCTTGGAAC GAAGCCACAACAAAACCCAGA 597 60
PRSV GCGGCAGAAGCATATATTGCAAA CTCTCATTCTAAGAGGCTCGAATA 512 54
CGMMV CGTGGTAAGCGGCATTCTAAACCTC CCGCAAACCAATGAGCAAACCG 654 62
TNV AAGATACAACACATTACGATCG ACTAGACGTTCATTGAGGGATTGA 416 54

1.3.2 样品总 RNA的提取和 cDNA的合成
采用 Trizol 法提取样品的总 RNA。取大约 0.1 g 新鲜或冷冻的采集样品置于 1.5 mL 无 RNAase
的离心管中，加入液氮充分研磨，加入 1 mL 的 TRNzol 试剂，室温放置 5 min。加入 0.2 mL 氯仿，
剧烈振荡 15 s，静置 3 min 后 4 ℃，12 000 r · min-1 离心 10 min。取上层水相加入离心管中，并加入
相同体积的异丙醇，轻轻混匀后室温放置 20 ~ 30 min。4 ℃，12 000 r · min-1 离心 10 min；取上清
液，留沉淀，加入 1 mL 75%乙醇洗涤；4 ℃，5 000 r · min-1 离心 3 min，弃上清液，将沉淀室温放
置晾干。将抽提的总 RNA 稀释于 RNAase-free DEPC 水中，–70 ℃冰箱中保存备用。同时提取健
康叶片总 RNA 作为阴性对照。以提取样品的总 RNA 为模板，反转录合成 cDNA。反转录体系为（20
μL）：总 RNA 2 μL，Random Primer（10 μmol · L-1）1 μL，5× Reaction 缓冲液 4 μL，RiboLock RNase
Inhibitor（20 U · μL-1）1 μL，10 mmol · L-1 dNTP Mix 2 μL，M-MLV 反转录酶（200 U · μL-1）1 μL，
RNase-free ddH2O 9 μL。反应条件为：42 ℃保温 60 min，70 ℃ 5 min 终止，–20 ℃保存备用。
1.3.3 PCR扩增
以反转录 cDNA 产物为模板，采用各病毒 CP 基因引物进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为 50 μL，
10× PCR 缓冲液 5 μL，dNTPs（2.5 mmol · L-1）2 μL，正、反向引物（10 μmol · L-1）各 1 μL，反转
录模板 cDNA 2 μL，Taq DNA 聚合酶（2.5 U · μL-1）0.5 μL，补足 ddH2O 至 50 μL。反应条件为：94
℃预变性 4 min，94 ℃变性 45 s，54 ~ 68 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环，72 ℃延伸 10
min。取 5 μL PCR 产物加入 1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.3.4 序列测定与分析
将 PCR 扩增产物中的特异性条带切胶，用 DNA 回收试剂盒回收纯化后与克隆载体 pGM-T 连
接，转化感受态 E. coli TOP 10 细胞，经蓝白斑筛选，选出阳性克隆，提取重组质粒进行 PCR 或酶
切鉴定后测序。测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。将测序结果用 GenBank 中的 BLAST
检索程序进行核酸序列相似性检索，下载同源性较高序列，利用 DNAStar 进行序列相似性比较及分
析。
2 结果与分析
2.1 对 CGMMV 的 DAS–ELISA 检测结果
对采集的 121 份哈密瓜样品进行 CGMMV DAS–ELISA 检测，结果均呈阴性，表明在吐鲁番、
鄯善、昌吉等地的哈密瓜疑似病毒病样品中未检测到该病毒。
潘亚南，韩 剑，吴海波，吉艳玲，王纯利，刘 芳，罗 明，张祥林.
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2.2 RT-PCR 检测结果
提取疑似病样总 RNA，并以反转录合成的 cDNA 为模板，分别用各病毒的 CP 基因特异性引物
进行 RT-PCR 扩增，部分检测结果如图 1。从 75 个样品中扩增出 852 bp 左右的特异性条带，与 WMV
目标条带片段一致。从 85 个样品中扩增出 780 bp 左右的特异性条带，与 CMV 预期片段大小一致。
从 45 个样品中扩增出 449 bp 左右的特异性条带，与 ZYMV 目标片段大小一致。从 3 个样品扩增出
651 bp 左右的特异性条带，与 MNSV 预期目标片段大小一致，而健康的叶片组织和空白对照中均未
扩增出目标条带。



图 1 RT-PCR 扩增结果
Fig. 1 The amplification results by RT-PCR

在所检测的样品中，CMV 的样品检出率最高，占全部检测样的 70.2%，是普遍发生的优势毒原
种群；其次是 WMV，检出率为 62.0%，为次优势毒原种群；再次是 ZYMV，检出率为 37.2%；MNSV
的检出率仅为 2.5%（表 3）。SqMV、PRSV、CGMMV 和 TNV 均未检测到。
在病毒检测呈阳性的 103 份样品中，有 41 个由单一病毒侵染，其余样品均检测到 2 种及 3 种
病毒的复合侵染，复合侵染率高达 60.19%。其中 WMV + CMV、WMV + ZYMV 和 CMV + ZYMV
两种病毒的复合侵染率分别达到 44.66%、27.18%和 22.33%；此外还有 CMV + WMV + ZYMV 复合
侵染现象，侵染率为 20.39%。

表 3 哈密瓜病毒病主要毒源的 RT-PCR 检测结果
Table 3 The results of major viruses in hami melon by RT-PCR
CMV WMV ZYMV MNSV
采样地点
Sampling site
样品数
Number of
samples
检出数
Positive
number
检出率/%
Positive
rate
检出数
Positive
number
检出率/%
Positive
rate
检出数
Positive
number
检出率/%
Positive
rate
检出数
Positive
number
检出率/%
Positive
rate
吐鲁番农业科学研究所
Turpan Academy of Agricultural Sciences
39 24 61.5 14 35.9 6 15.3 3 7.7
吐鲁番皇家瓜园 Turpan Royal Inundated
Watermelon Patches
17 11 64.7 7 41.1 4 23.5 0 0
吐鲁番三堡乡 Sanpu Town Turpan City 16 14 87.5 14 87.5 8 50.0 0 0
鄯善县迪坎乡 Dikan Town Shanshan City 18 10 55.5 17 94.4 10 55.5 0 0
鄯善县周边 Surrounding Shanshan City 19 15 78.9 11 57.8 5 26.3 0 0
昌吉园艺场 Changji Horticultural Field 12 11 91.6 12 100.0 12 100.0 0 0
整体 Overall 121 85 70.2 75 62.0 45 37.2 3 2.5

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2.3 检出病毒 CP基因序列测定与分析
2.3.1 CMV-CP基因序列测定与分析
选取 3 个 CMV 新疆哈密瓜分离物的 CP 基因 RT-PCR 扩增产物（编号为 J1C、T19 和 T-2-3）
经回收、纯化和克隆、测序，分别得到 763、756、747 bp 的序列片段，含 1 个非完整的开放性阅读
框（ORF）。将分离物的 CP 基因的序列片段提交至 GenBank，登录序列号分别为 KP406628、KP406634
和 KP406630。依据 CP 基因的核苷酸序列，将所获得新疆哈密瓜 CMV 分离物与已报道的 CMV 若
干代表株系构建系统发育树（图 2）。侵染新疆哈密瓜的 3 个 CMV 分离物之间的核苷酸同源率达
94.6% ~ 96.1%。3 个分离物均与 CMV 亚组ⅠB 聚在一起，同源性达到 90.89% ~ 97.7%，推导氨基
酸序列同源性达到 90.1% ~ 97.5%，其中与中国北京分离物（AB008777）核苷酸序列同源性最高，
达到 96.6% ~ 97.7%。而与亚组Ⅱ的 CMV 分离物的同源性仅为 72.1% ~ 76.3%，推导氨基酸序列同
源性为 67.7% ~ 71.3%。因此，根据序列及系统发育分析可知，CMV 新疆哈密瓜分离物属于 CMV
亚组ⅠB。


图 2 依据 CMV-CP基因核苷酸序列构建的系统发育树
Fig. 2 The phylogenetic tree of CMV-CP gene based on the nueleotide sequences

2.3.2 WMV-CP基因序列测定与分析
选取 3 个新疆哈密瓜 WMV 分离物的 CP 基因 RT-PCR 扩增产物（编号为 J1W、T38 和 T-2-2）
经回收、纯化和克隆、测序，得到 852 bp 左右大小的序列片段，将序列提交至 GenBank，登录序列
号分别为 KP330247、KP406639、KP406642。与 GenBank 中的 WMV 各分离物核苷酸序列同源性达
到 91.5% ~ 99.5%，推导氨基酸序列同源性达到 91.2% ~ 98.9%。依据 CP 基因的核苷酸序列，将所
获得新疆哈密瓜 WMV 分离物与已报道的 WMV 若干株系构建系统发育树（图 3），可以看出新疆昌
吉分离物（KP330247）与中国黑龙江分离物（AY464948）同源性最相近，达到 99%以上；而新疆
吐鲁番的 2 个 WMV 分离物（KP406639、KP406642）在系统发育树上形成一个独立的小支，具有
高度的同源性，而与昌吉分离物（KP330247）核苷酸序列同源性仅为 92.0% ~ 93.1%，亲缘关系相
对较远，具有一定的地域分化。
潘亚南，韩 剑，吴海波，吉艳玲，王纯利，刘 芳，罗 明，张祥林.
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图 3 依据 WMV-CP基因核苷酸序列构建的系统发育树
Fig. 3 The phylogenetic tree of WMV-CP gene based on the nueleotide sequences

2.3.3 ZYMV-CP基因序列测定与分析
选取 3 个新疆哈密瓜 ZYMV 分离物的 CP 基因 RT-PCR 扩增产物（编号为 J1Z、J2 和 T-1-4）经
回收、纯化和克隆、测序，得到 449 bp 左右大小的序列片段，将序列提交至 GenBank，登录序列号
分别为 KP406636、KP406637、KP406638。与 GenBank 中的 ZYMV 各分离物核苷酸序列同源性达
到 93.5% ~ 99.0%，推导氨基酸序列同源性达到 91.4% ~ 97.2%。依据 CP 基因的核苷酸序列，将所
获得 ZYMV 新疆哈密瓜分离物与已报道的 ZYMV 若干株系构建系统发育树（图 4），可以看出 ZYMV
分离物可以分成组Ⅰ和组Ⅱ，其中昌吉的两个 ZYMV 分离物（KP406636、KP406637）处于组Ⅰ中，
与意大利分离物（AJ420020）核苷酸序列同源性最高，达到 96.0% ~ 98.5%；吐鲁番地区的 ZYMV
分离物（KP406638）处于组Ⅱ中，与中国山西分离物（AY611023）核苷酸序列同源性能达到 99.0%。
3 个分离物中，昌吉的 2 个分离物（KP406636、KP406637）CP 基因的同源率达到 96%以上，具有
高度同源性；而与吐鲁番分离物（KP406638）同源率为 93.4% ~ 93.9%，亲缘关系相对较远，存在
一定的地域分化。


图 4 依据 ZYMV-CP基因核苷酸序列构建的系统发育树
Fig. 4 The phylogenetic tree of ZYMV-CP gene based on the nueleotide sequences
Pan Ya-nan，Han Jian，Wu Hai-bo，Ji Yan-ling，Wang Chun-li，Liu Fang，Luo Ming，Zhang Xiang-lin.
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2.3.4 MNSV-CP基因序列测定与分析
对 1 个新疆哈密瓜 MNSV 分离物的 CP 基因 RT-PCR 扩增产物（编号为 T10）经回收、纯化和
克隆、测序，得到 651 bp 左右大小的序列片段，将序列提交至 GenBank，登录序列号 KP406627。
与 GenBank 中的 MNSV 各分离物核苷酸序列同源性为 91.4% ~ 96.1%，推导氨基酸序列同源性达到
90.5% ~ 95.2%。依据 CP 基因的核苷酸序列，将所获得 MNSV 新疆哈密瓜分离物与已报道的 MNSV
若干株系构建系统发育树（图 5）。根据系统发育树可以看出新疆分离物（KP406627）与中国河南
分离物（GU480022）亲缘关系较近，核苷酸序列同源性达到 96.1%；而与西班牙分离物（KF060715）
的亲缘关系相对较远，核苷酸序列同源性为 91.4%。

图 5 依据 MNSV-CP基因核苷酸序列构建的系统发育树
Fig. 5 The phylogenetic tree of MNSV-CP gene based on the nueleotide sequences
3 讨论
3.1 侵染新疆哈密瓜的病毒种类及优势毒原种群
新疆在瓜类病毒方面的研究主要集中在 20 世纪 80、90 年代年代。魏宁生等（1991）、裴美云
等（1982）、尹玉琦等（1982）从新疆厚皮甜瓜病毒病样品中鉴定出 WMV、CMV、SqMV、MNSV
和烟草坏死病毒（TNV），其中 WMV 发生最严重。刘卫荣（2008）从石河子、昌吉地区哈密瓜上
分离鉴定出 ZYMV、PRSV 和 WMV。本研究中采用 DAS-ELISA 和 RT-PCR 技术对新疆吐鲁番、善
鄯、昌吉地区哈密瓜病毒病的毒原进行检测和分子鉴定，确定了 CMV、WMV、ZYMV 和 MNSV
4 种病原病毒，其中 CMV、WMV 和 ZYMV 在各个样点都有发生，CMV 的检出率最高，是侵染最
普遍的优势毒原种群，已报道的 SqMV 和 TNV 等未检测到。本研究中所检测到的病毒种类和优势
毒原与前人的研究结果有所不同。CGMMV 是危害瓜类作物的典型的种传病毒，2007 年被中国列为
新外来入侵危险性有害生物，近年来在中国局部地区已造成爆发性危害，本研究中虽未发现，但仍
需引起高度重视，加强监测工作。
李国玄等（1986）对新疆吐鲁番、鄯善、喀什、阿克苏等地调查，发现不同地区、不同年份哈
密瓜病毒的消长及优势毒源有较大变化。李继洋等（2015）采用多重 RT-PCR 技术检测新疆哈密瓜
主栽区 CMV、WMV 和 ZYMV 的发生及其分布，结果显示 WMV 发生最为普遍，在各种植区均被
检出，CMV 和 ZYMV 在一些地区未被检出，不同地区的发生率有较大差异。本研究的结果也显示
潘亚南，韩 剑，吴海波，吉艳玲，王纯利，刘 芳，罗 明，张祥林.
新疆哈密瓜病毒的 DAS-ELISA 检测和分子鉴定.
园艺学报，2016，43 (6)：1107–1116. 1115

在不同地区病毒种群组成及侵染率存在明显差异，同一地区头茬（春瓜）和二茬（秋瓜）哈密瓜病
毒病的毒原消长也有较大区别，二茬瓜样品中病毒的侵染率明显高于头茬瓜。侵染新疆甜瓜的病毒
种群组成及侵染率的差异可能与环境条件、气候因素以及品种、传毒介体、播期、栽培模式等多种
因素有关。CMV、WMV 和 ZYMV 均主要以蚜虫传播，蚜虫迁飞与哈密瓜病毒病发生流行有明显
的相关性。吐鲁番、鄯善地区二茬瓜种植期正值麦田蚜虫迁飞的高峰期，进入瓜地的蚜虫是导致病
毒病高发重要原因。同时，烟粉虱现已成为该区棉田和设施农业的首要害虫，是番茄黄化曲叶病毒
主要的传毒介体。当地瓜棉套种的主要栽培模式导致瓜田烟粉虱发生严重，烟粉虱是否传播哈密瓜
病毒还有待证实。本研究中还观察到，昌吉市园艺场的一茬瓜，当年播种期延后至 7 月初，出苗时
正值蚜虫迁飞高峰，幼苗极易感病，造成病毒病同样发生严重。因此，进一步探明传毒介体的消长
动态及毒原寄主、侵染源及造成哈密瓜病毒流行的关键因素，对于制定病毒病害的防治措施具有重
要意义，也是本研究后续将要开展的工作。
3.2 CMV 株系及其他病毒的遗传分化分析
本研究的结果显示，CMV 在新疆哈密瓜生产中发生普遍而严重，已上升为当前优势毒原。根
据寄主范围、血清学关系，病毒外壳蛋白肽链图谱、核酸杂交、RT-PCR 产物酶切分析及核苷酸序
列分析等，可将 CMV 株系分成 2 个性质不同的亚组（Palukaitis et al.，1992；徐平东和谢联辉，1998）。
利用 CMV RNA3 的 5′端非编码区序列和 CP 基因序列的比较可以将亚组Ⅰ进一步划分为ⅠA 和ⅠB
（Roossinck et al，1999）。本研究中对 3 个 CMV 新疆哈密瓜分离物的 CP 基因序列及其编码的氨基
酸序列进行分析，确定归属 CMV 亚组ⅠB，与中国已报道的大部分 CMV 分离物的株系亚组划分一
致。近年来关于亚组Ⅱ在中国的报道也在不断增加（徐平东 等，1999；李凡 等，2000；王海河 等，
2001），但相对亚组Ⅰ的报道频率还是很低（Garcoa，1998；Hord et al.，2001）。CMV 新疆哈密瓜
分离物是否存在亚组ⅠA 和亚组Ⅱ的株系，今后还需通过大量的样品检测和分析确定。
对 WMV CP 基因核苷酸序列的系统发育分析显示，新疆吐鲁番哈密瓜的 2 个 WMV 分离物同
源率很高（99.1%），两者分别来自不同的哈密瓜品种（优蜜 17 号、春潇 2 号），但采集地点很接近；
而与昌吉的 1 个分离物（KP330247）的仅为 92.0% ~ 93.1%，此结果揭示出 WMV 种群存在一定的
遗传分化，其亲缘关系主要与地理环境相关，而与寄主品种关系不大。ZYMV 的遗传分化也体现出
同样的特点。已报道的 MNSV 分离物毒基因序列有很高的一致性，但其致病力强弱却有很大区别。
MNSV 在新疆发生较少，本研究中获得的 MNSV 新疆分离物的致病力如何尚待研究。
近年来随着新疆哈密瓜特色产业不断发展，生产规模逐步增加，生产模式也发生了明显变化，
出现了育苗移栽、地膜滴灌，大规模、基地化种植及瓜棉套作、一年二茬等新的种植方式，对新的
生产环境下病毒的研究还鲜见报道。本试验受到采集样品数量及地域的限制，仅针对 8 个重要病毒
进行了检测，因而并未涵盖引起新疆哈密瓜病毒病的所有毒原。一些病毒病症状表现明显的样品，
并未检测出结果，这些症状是由哪些毒原引起，还有待进一步的研究。

References
Ali Emran，Yutaka Tabei，Kappei Kobayashi，Naoto Yamaoka，Masamichi Nishiguchi. 2012. Molecular analysis of transgenic melon plants showing
virus resistance conferred by direct repeat of movement gene of Cucumber green mottle mosaic virus. Plant Cell Reports，31 (8)：1371–1377.
Garcoa A J. 1998. Detection variabilidad cucumovirus mosaico pepinoen Cucumis melo. Department of Chemistry，Universidad de Costa Rica，San
Jose.
Hord M J，Garcoa A，Villalobos H. 2001. Field survey of Cucumber mosaic virus subgroups Ⅰ and Ⅱ in crop plants in Costa Rica. Plant Disease，
Pan Ya-nan，Han Jian，Wu Hai-bo，Ji Yan-ling，Wang Chun-li，Liu Fang，Luo Ming，Zhang Xiang-lin.
Detection of viruses infecting Hami melon and their molecular identification in Xinjiang.
1116 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (6)：1107–1116.
85 (9)：952–954.
Li Fan，Zhou Xue-ping，Qi Yi-jun，Chen Hai-ru，Li De-bao. 2000. Detection of Cucumber mosaic virus subgroup Ⅱ isolate from tobacco plants
in Yunnan Province. Acta Microbiologica Sinica，40 (4)：346–351. (in Chinese)
李 凡，周雪平，戚益军，陈海如，李德葆. 2000. 从云南烟草上检测到黄瓜花叶病毒亚组Ⅱ分离物. 微生物学报，40 (4)：346–351.
Li Guo-xuan，Zhao Chang-sheng，Xie Hao，Tian Bo. 1986. Types and distribution of Xinjiang Hami melon viruses. Acta Phytopathologica Sinica，
16 (3)：9–12. (in Chinese)
李国玄，赵长生，谢 浩，田 波. 1986. 新疆哈密瓜病毒类型及分布. 植物病理学报，16 (3)：9–12.
Li Ji-yang，Yang Du，Han Sheng，He Dan，Yushanjiang · Maimaiti. 2015. Detection and distribution of three viral diseases in Xinjiang melon region
based on multiplex RT-PCR technique. Acta Agricultural Boreali-occidentalis Sinica，24 (8)：123–130. (in Chinese)
李继洋，杨 渡，韩 盛，何 丹，玉山江 · 麦麦提. 2015. 基于多重 RT-PCR 技术检测新疆甜瓜主栽区 3 种病毒病及其分布. 西北农
业学报，24 (8)：123–130.
Liu Wei-rong. 2008. Molecular identification of the Potyviruses and study on their inherited differentiation in cucurbit crops in North Xinjiang[M. D.
Dissertation]. Shihezi：Shihezi University. (in Chinese)
刘卫荣. 2008. 北疆葫芦科作物 Potyvirus 属病毒种类的分子鉴定与遗传分化研究[硕士论文]. 石河子：石河子大学.
Pei Mei-yun，Qiu Bing-sheng，Xie Hao，Zhao Chang-sheng，Li Guo-xuan. 1982. On Hami-melon mosaic virus diseasesⅠ. Etiology. Acta
Phytopathologica Sinica，12 (4)：29–34. (in Chinese)
裴美云，邱并生，谢 浩，赵长生，李国玄. 1982. 哈密瓜花叶病毒病的研究–Ⅰ. 病原学. 植物病理学报，12 (4)：29–34.
Palukaitis P，Roossinck M J，Dietzgen R G. 1992. Cucumber mosaic virus. Adv Virus Res，41：281–348.
Roossinck M J，Zhang L，Hellwald K H. 1999. Rearrangements in the 5′nontranslated region and phylogenetic analyses of Cucumber mosaic virus
RNA3 indicate radial evolution of three subgroups. Journal of Virology，73 (8)：6752–6758.
Wang Hai-he，Xie Lian-hui，Lin Qi-ying. 2001. Construction of cDNA clone and nucleotde sequence of RNA3 of Cucumber mosaic virus isolate Xb
from banana. Virologica Sinica，16 (3)：252–256. (in Chinese)
王海河，谢联辉，林奇英. 2001. 黄瓜花叶病毒香蕉株系（CMV-Xb）RNA3 cDNA 的克隆和序列分析. 中国病毒学，16 (3)：252–256.
Wei Ning-sheng，Zhang Man-liang，WuYun-feng. 1991. Identification and control of muskmelon virus diseases in Xinjiang and Gansu Province of
China. Journal of Plant Protection，18 (1)：81–85. (in Chinese)
魏宁生，张满良，吴云峰. 1991. 新疆、甘肃甜瓜病毒病的鉴定及防治. 植物保护学报，18 (1)：81–85.
Wu Hui-jie，Gu Qin-sheng. 2015. Research advances of Melon necrotic spot virus. China Cucurbits and Vegetables，28 (6)：1–4，15. (in Chinese)
吴会杰，古勤生. 2015. 甜瓜坏死斑点病毒研究进展. 中国瓜菜，28 (6)：1–4，15.
Xu Ping-dong，Xie Lian-hui. 1998. Advances in subgroup research of cucumber mosaic Cucumovirus. Journal of Fujian Agricultural University，27
(1)：82–91. (in Chinese)
徐平东，谢联辉. 1998. 黄瓜花叶病毒亚组研究进展. 福建农业大学学报，27 (1)：82–91.
Xu Ping-dong，Zhou Zhong-ju，Lin Qi-ying，Xie Lian-hui. 1999. Coat protein gene sequence analysis and comparison of Cucumber mosaic virus
subgroupⅠand Ⅱ isolates in China. Chinese Journal of Virology，15 (2)：72–79. (in Chinese)
徐平东，周仲驹，林奇英，谢联辉. 1999. 黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ和Ⅱ分离物外壳蛋白基因的序列分析与比较. 病毒学报，15 (2)：72–79.
Yin Yu-qi，Cui Xing-ming，Quan Jun-ren，Liu Yi，Liang Xun-sheng. 1982. Isolation and identification of viruses infecting saccharine melon in
Xinjiang. Journal of Plant Protection，9 (3)：157–162，218. (in Chinese)
尹玉琦，崔星明，全俊仁，刘 仪，梁训生. 1982. 新疆哈密瓜病毒病毒源的分离和鉴定. 植物保护学报，9 (3)：157–162，218.
Zheng Guang-yu. 2005. Biological characteristics of Cucumber mosaic virus infected Xinjiang muskelon. Journal of Kashgar Teachers College，26
(3)：49–52. (in Chinese)
郑光宇. 2005. 感染新疆甜瓜的黄瓜花叶病毒的生物学特征. 喀什师范学院学报，26 (3)：49–52.