全 文 ：园艺学报，2015，42 (4)：679–688.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0958；http：//www. ahs. ac. cn 679
收稿日期：2014–12–15；修回日期：2015–03–19
基金项目：国家自然科学基金重点项目（31430075）；国家重点基础研究发展计划（‘973’）项目（2012CB113904）；国家‘863’项目
（2012AA100202）；农业部行业专项（201403032）；国家自然基金青年基金项目（31301781）；江苏省青年基金项目（BK20130674）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：liji1981@njau.edu.cn；jfchen@njau.edu.cn）
黄瓜扩张素蛋白基因 CsEXPb1的克隆及表达分
析
孟永娇，李 季*，徐 建，张开京，娄群峰，陈劲枫*
（作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京农业大学园艺学院，南京 210095）
摘 要：基于黄瓜果实转录组学研究，筛选并克隆了一个扩张素蛋白（β-expansin）基因 CsEXPb1。
蛋白序列同源比对发现 CsEXPb1 蛋白是一类钙调素类似蛋白（Calmodulin-like Protein，CML），与甜瓜、
草莓及番茄扩张素蛋白基因具有较高的相似性；ExPasy 分析发现 CsEXPb1 为亲水性蛋白，亚细胞定位分
析证明该蛋白广泛分布在细胞质以及细胞核结构中；qRT-PCR 分析发现 CsEXPb1 无论是在授粉坐果还是
单性结实坐果过程中皆上调表达，而在不授粉败育的果实中下调表达；qRT-PCR 也表明 CsEXPb1 的表达
受到生长素、细胞分裂素和赤霉素等单性结实诱导激素的正向调控，推测 CsEXPb1 与黄瓜坐果有关，可
能参与了激素诱导的单性结实过程。
关键词：黄瓜；扩张素蛋白；CsEXPb1 基因；表达分析；坐果；单性结实
中图分类号：S 642.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）04-0679-10

Cloning and Expression Analysis of the Expansin Gene CsEXPb1 in
Cucumber
MENG Yong-jiao，LI Ji*，XU Jian，ZHANG Kai-jing，LOU Qun-feng，and CHEN Jin-feng*
（State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，College of Horticulture，Nanjing Agricultural
University，Nanjing 210095，China）
Abstract：Based on transcriptome study of cucumber fruit set，a β-expansin gene：CsEXPb1 was
cloned and investigated in present study. Homolog BLAST showed that CsEXPb1 is belonged to
Calmodulin-like Protein family，and has high similarities with the expansin genes of Cucumis melo，
Fragaria vesca subsp. vesca and Solanum lycopersicum. The ExPasy analysis showed that CsEXPb1 is a
hydrophilic protein；The subcellular localization analysis indicated that CsEXPb1 localized in plasma
membrane，cytoplasm and nucleus；qRT-PCR analysis found that CsEXPb1 was up-regulate expressed
during pollination and parthenocarpy fruit set in cucumber，while down-regulated during fruit abortion；
qRT-PCR also showed that the transcription of CsEXPb1 could be cis-regulated by fruit-set inducing
hormones i.e. auxin，cytokinin and gibberellin. Therefore，it was speculated that CsEXPb1 may be close
related to hormone induced parthenocarpic fruit set of cucumber.
Key words：cucumber；expansin；CsEXPb1 gene；expression analysis；fruit set；parthenocarpy

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Cloning and expression analysis of the expansin gene CsEXPb1 in cucumber.
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植物细胞的生长与细胞壁结构密切相关，细胞壁必须能承受住细胞内部膨胀的压力，同时保持
延伸的能力，从而保证细胞能自由生长。Cosgrove（1989）发现了膨胀素，这是一种可以调节细胞
壁扩展的蛋白分子。1992 年，McQueen-Mason 等（1992）从黄瓜中分离纯化出一种膨大素蛋白，并
发现该蛋白可以调节幼苗下胚轴的伸长，第一次将其命名为 Expansin 扩张蛋白。
Expansin 是一种细胞壁蛋白，通过弱化细胞壁多糖（如纤维素、纤维素微纤丝等）之间的非共
价键导致多糖复合物滑动，从而引起膨压驱动下的细胞壁的伸展（McQueen Marson & Cosgrove，
1994；McQueen-Marson，1995；Li & Cosgrove，2001）。植物中的 EXP 基因可归为 4 个子家族：
α-expansin（EXPA）、β-expansin（EXPB）、expansin-like A（EXLA）以及 expansin-like B（EXLB）
（Lee et al.，2001；Kende et al.，2004）。目前对 α-expansin 及 β-expansin 研究的比较透彻，两种扩
张蛋白主要分别存在双子叶和单子叶禾本科中（McQueen-Mason & Rochange，1999）。扩张蛋白在
果实成熟、形态建成、根毛发生、花粉管生长和渗透调节中起着重要的作用（陈苏 等，2003）。Expansin
促进果实的成熟与软化：梨 PcExp1 在果实发育膨胀开始到软化时期的表达量一直增加（Wu et al.，
2001）；过表达番茄 LeExp1 的果实在青果成熟阶段前即开始软化，并比对照果实更软（Brummell et
al.，1999）。Expansin 能够影响植物根系发育：大豆中根特异性 β-expansin 基因 GmEXPB2 能促进根
系细胞分裂和生长（Guo et al.，2011）。Expansin 促进伸长区生长：拟南芥中 AtEXP10 基因的表达
影响叶片生长和花梗脱落（Cho & Cosgrove，2000）。Muller 等（2007）发现玉米 33 种 expansin 基
因中 19 个是优先表达于叶伸长区，并负责细胞分裂、叶片最大化伸展和细胞壁的分化。Expansin 对
花粉管的作用：有研究证明 β-expansin 家族中包括一些花粉过敏原蛋白，表明 β-expansin 有助于花
粉管侵入柱头和花柱（Cosgrove et al.，1997）。玉米花粉中 β-expansin 基因 Zeam1 也有促进花粉管
进入花柱的作用（Li et al.，2003）。Valdivia 等（2007）发现在花粉管发育过程中，β-7-expansin 可
能参与松弛柱头与花柱的细胞壁，促进花粉管的延伸。
Li 等（2014）借助 RNA-Seq 技术挖掘与黄瓜单性结实相关基因，其中属于 β-expansin 基因的
Csa5M561760.1 在单性结实品种‘EC1’及授粉后的非单性结实品种‘8419’果实发育过程中差异
表达。基于黄瓜单性结实转录组学研究结果，本研究中克隆了 Csa5M561760.1，NCBI 数据库中注
释为 PREDICTED：probable calcium-binding protein CML25-like（Cucumis sativus），并将之命名为
CsEXPb1；通过对 CsEXPb1 蛋白的理化性质及其基因在黄瓜坐果过程各器官中的表达分析，推测
CsEXPb1 基因对黄瓜果实发育的调控机理，为全面揭示黄瓜果实发育的分子调控机理提供参考。
1 材料与方法
1.1 植物材料及培养条件
黄瓜（Cucumis sativus L.）单性结实自交系‘EC1’和非单性结实自交系‘8419’由南京农业大
学葫芦科作物遗传与种质创新实验室提供。2014 年 3 月中旬催芽，材料苗期在光照培养箱中培养，
光周期为 14 h/10 h，昼夜温度为 28 /20 ℃ ℃，18 d 后将成苗种植于南京农业大学江浦园艺学院实验
基地。
利用‘EC1’雌花、雄花及叶片进行目的基因克隆，利用‘8419’研究不同激素处理下 CsEXPb1
的应答。‘8419’幼苗长到三叶一心期，分别用 GA（10 μmol · L-1）、6-BA（10 μmol · L-1）、NAA（5、
10 和 50 μmol · L-1）喷洒处理整株叶片，处理后 3 h 取样。
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1.2 CsEXPb1基因的克隆
用总 RNA 提取试剂盒（DP419，天根生化科技有限公司）提取黄瓜果实样品总 RNA，然后用
DNaseⅠ，RNase-free（EN0521，fermentas）消除 DNA 的污染，利用 PrimeScript 1st Strand cDNA
Synthesis Kit（D6110A，TaKaRa）合成 cDNA 第一链，具体操作依照产品说明书。
以黄瓜基因组数据库（http：//cucumber. genomics. org. cn/ page/ cucumber/ index. jsp）中
Csa5M561760.1 基因编码区序列为模板，利用 Primer Premier 5.0 软件设计引物，委托英潍捷基（上
海）贸易有限公司合成（表 1）。

表 1 CsEXPb1基因的克隆、亚细胞定位和定量引物及对应产物大小
Table 1 Sequence and the product sizes of primers for gene cloning，subcellular localization
analysis and RT-qPCR of CsEXPb1
引物名称
Name of primer
引物序列
Primer sequence
产物大小/bp
Product size
表达引物 Expression primer 5′-CCGAGGAAGAGCTTCAGAAC-3′；5′-GGAATCAACGCCCTTAGTGT-3′ 104
克隆引物 Clone primer 5′-CTCTCCTCATTATGGGTTTCAA-3′；5′-TCCTAATTAGACGATAAACAAGAAAC-3′ 650
亚细胞定位引物
Subcellular localization primer
5′-CTCTCCTCATTATGGGTTTCAA-3′；5′-GCCATTAAACCCTTGCGATCG-3′ 561
内参基因引物 Actin primer 5′-ACTGTGCTGTCCTCATTATTG-3′；5′-AGGGTGAAAGCAAGAA GAGC-3′ 190

分别以‘EC1’雌花、雄花 cDNA 及叶片总 DNA 为模板进行 CsEXPb1 基因的扩增，PCR 反应
体系总体积为 20 μL：10× PCR Buffer 2.0 μL，dNTP 2.0 μL，MgCl2 1.2 μL，模板 1.0 μL，10
mmol · L-1 正反向引物各 1.0 μL，Taq 聚合酶 0.25 μL，ddH2O 11.55 μL。用 Biometra 梯度 PCR 仪进
行 PCR 扩增，反应条件为：94 5 min℃ ，94 30 s℃ ，60 30 s℃ ，72 60 s℃ ，35 个循环；72 7 min℃ 。
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。
利用 DNA 纯化/回收试剂盒（NEP013-2，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）回收目的条带，
与 pMD18-T 载体（D102A，TaKaRa）16 ℃连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌 DH5α 感受态细胞
中，经 Kan 抗性筛选和菌落 PCR 筛选，取阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.3 荧光定量 PCR
取‘EC1’根、茎、叶、开花当天雌花和雄花样品，取‘EC1’夹花处理 0、2、4 和 6 d 的果实
样品，取‘8419’夹花、授粉处理后 0、2、4 和 6 d 的果实样品，立即放液氮速冻，然后贮存于
–70 ℃超低温冰箱待用。每个取样点设 3 个生物学重复。
用总 RNA 提取试剂盒（DP419，天根生化科技有限公司）提取样品总 RNA，经 DNaseⅠ消化
后反转录为 cDNA，取适量作为模板。按照 SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）操作指导，在 Bio-Rad
公司的 My-IQ2 荧光定量 PCR 仪上检测基因的表达量。
选取黄瓜看家基因 EF1a 作为内参基因，引物序列如表 1 所示。总反应体系为 20 μL：10 μL SYBR
Premix Ex TaqTM（2×）混合液，1 μL cDNA，1 μL 上游引物（10 μmol · L-1），1 μL 下游引物（10
μmol · L-1），7 μL ddH2O。两步法扩增，具体程序为：95 ℃预变性 2 min，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火
30 s，40 个循环，然后进行熔解曲线分析。将正常条件下 CsEXPb1 的表达量设为 1，按照 2-ΔΔCT 法
计算出基因的相对表达量，采用 Excel 软件绘图。
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图 1 CsEXPb1基因 PCR扩增产物电泳图
1：‘EC1’雌花 cDNA；2：‘EC1’雄花 cDNA；
3：叶片总 DNA；M：2 000 bp marker。
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplication
product of CsEXPb1 gene
1：Female flowers cDNA；2：Male flowers cDNA；
3：Leaves DNA；M：2 000 bp marker.
1.4 亚细胞定位载体构建与定位
利用 SmaⅠ酶切带有绿色荧光蛋白的质粒载体 PGREEN0029-GFP，酶切后使用 AP 酶处理、纯化；
利用高保真酶扩增目标基因片段，引物如表 1 所示。回收目的片段并用 PNK 酶处理、纯化；两步得
到的片段利用 T4 连接酶连接，构建融合表达载体 PGREEN0029-CsExpb1：：GFP。并用空载体 PGREEN0029-
GFP 为对照。利用基因枪轰击洋葱下表皮将构建好的表达载体和空载体导入细胞，使用共聚焦显微
镜观察细胞内绿色荧光蛋白基因的表达情况。
同时，通过在线分析软件 WoLFPSORT（http：//wolfpsort. org/）和 BacelLo（http：//gpcr. biocomp.
unibo. it/bacello/pred. htm）对 CsEXPb1 蛋白亚细胞定位进行预测，以及用 ExPasy 分析该蛋白的疏
水性。
2 结果与分析
2.1 CsEXPb1基因的克隆
分别以黄瓜‘EC1’雌花、雄花 cDNA 和叶片总 DNA 为模板，用基因克隆引物进行 PCR 扩增
（图 1），回收目的条带测序结果为 650 bp。其中开放阅读框（ORF）长度为 549 bp，共编码 182 个
氨基酸，与黄瓜基因组数据库 Csa5M561760.1
基因编码区序列完全一致，起始密码子为 ATG，
终止密码子为 TAA，表明已经成功获得目的基
因。
如图 1 所示，‘EC1’黄瓜雌花 cDNA 和雄花
cDNA、叶片总 DNA PCR 产物大小相同，因此确
定黄瓜 CSEXPb1 基因没有内含子。
2.2 CsEXPb1同源分析
将CsEXPb1 基因序列在 NCBI数据库中进行
BLAST 同源检索，并用 CLUSTALX 进行同源序
列比对，发现该基因序列与豆科、茄科、十字花
科 等 多 种 作 物 的 钙 调 素 类 似 蛋 白 CML
（Calmodulin-like Protein）基因序列同源性较高，
分别为大豆 69.47%、苜蓿 65.15%、拟南芥
58.12%、马铃薯 62.89%、番茄 64.58%、草莓
71.74%、甜瓜 97.25%；而与禾本科作物同源性较差，分别为玉米 16.39%、小麦 14.76%。
分析得到目的蛋白含有两个 EF 手形（EF-hand）结构的保守域（domain），为钙结合基序形成
Ca2+ · CaM 复合物，此复合物可以通过与靶酶作用方式来调控代谢过程（图 2）。
利用 MEGA5.1 对 CsEXPb1 及 BLAST 检索得到的与 CsEXPb1 蛋白相似性较高的其它作物蛋
白的氨基酸序列全长构建系统进化树。如图 3 所示，该蛋白与来自甜瓜的 CML25 蛋白亲缘关系最
近。


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图 2 CsEXPb1与其它植物 CMLs同源比对
Fig. 2 Alignment of CsEXPb1 with other plant CMLs

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图 3 CsEXPb1系统进化树分析
Fig. 3 The phylogentic tree of CsEXPb1

2.3 CsEXPb1蛋白的亚细胞定位
运用 PredictProtein（https：//www. predictprotein.org/）在线分析得到，CsEXPb1 蛋白主要由丝
氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、赖氨酸（Lys）、异
亮氨酸（Ile）及苯丙氨酸（Phe）组成，含量分别为 11.54%、10.99%、10.44%、8.79%、8.24%、7.14%、
6.04%和 4.95%，并且预测其主要存在于细胞质中。WoLFPSORT 预测结果为 CsEXPb1 蛋白主要存
在于叶绿体、线粒体及细胞核中。BacelLo 预测结果为 CsEXPb1 蛋白存在于细胞核中（位置转变为
细胞内→细胞核或细胞质→细胞核）。综合预测结果可以得出：CsEXPb1 蛋白分布于细胞质和细胞
核中。ExPasy 分析该蛋白的疏水性结构发现蛋白大部分区域表现为亲水性（分值大于 1.5 的是疏水
部分，< 0 的是亲水部分），说明此蛋白为亲水性蛋白（图 4）。

图 4 CsEXPb1蛋白的亲水性分析
分值大于 1.5 为疏水部分，小于 0 为亲水部分。
Fig. 4 Hydropathy analysis of CsEXPb1 protein
Score greater than 1.5 means hydrophobic，score less than 0 means hydrophilic.

共聚焦显微镜观察结果（图 5）显示，在导入含目的基因的表达载体及空载体的两种细胞的整
个细胞内都能检测到荧光信号，表明该基因编码的蛋白存在于细胞质及细胞核中。这与利用生物信
息分析预测到的结果一致。
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图 5 洋葱表皮细胞中的 CsEXPb1亚细胞定位
Fig. 5 Subcellular localization analysis of CsEXPb1 in the onion epidermal cells
2.4 CsEXPb1在黄瓜中的表达
2.4.1 CsEXPb1表达的组织特异性
为了研究 CsEXPb1 在黄瓜生长发育中的作用，选用黄瓜材料‘EC1’，分别于三叶一心期取根、
茎、幼叶，随后取成熟叶及雌花和雄花，研究 CsEXPb1 在不同组织中的表达情况。如图 6 所示，
CsEXPb1 在黄瓜各组织中都有表达，但表达差异较大，在根、茎、成熟叶片及雄花中表达量很少，
但在幼叶和雌花这些细胞增殖速度较快的组织器官中表达量较高。

图 6 单性结实黄瓜 CsEXPb1的组织表达模式
Fig. 6 Expression analyses of CsEXPb1 in different cucumber organs

2.4.2 CsEXPb1在果实发育中的表达分析
为了研究 CsEXPb1 在黄瓜坐果期的表达变化规律，选用单性结实材料‘EC1’和非单性结实材
料‘8419’研究其子房发育不用时期的表达水平。由图 7 可知，开花前 3 d 无论是‘8419’还是‘EC1’
的子房中 CsEXPb1 表达水平较低且变化较小；而开花后 0 ~ 6 d，‘EC1’子房中和‘8419’授粉子
房中表达量持续升高，虽然在开花后 4 d‘8419’授粉子房中 CsEXPb1 表达量低于同期的‘EC1’
子房中，但在 6 d 时其表达量急剧升高，远远超出同期‘EC1’子房中；在‘8419’未授粉子房中
CsEXPb1 在 4 d 时开始下调表达，且远远低于同期的‘EC1’和‘8419’授粉子房。
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图 7 CsEXPb1在黄瓜果实发育早期的表达分析
Fig. 7 Expression level of CsEXPb1 during early cucumber fruit development stages

2.4.3 CsEXPb1对外源激素的应答
为了分析外源激素对 CsEXPb1 基因表达的影响，选取 GA（10 μmol · L-1）、6-BA（10 μmol · L-1）、
NAA（5、10 和 50 μmol · L-1）处理三叶一心期‘8419’幼苗叶片。由图 8 可知，外源激素能上调
CsEXPb1 的表达，其中 5 μmol · L-1 和 50 μmol · L-1 NAA 诱导效果最好。


图 8 CsEXPb1在外源激素诱导下的表达分析
Fig. 8 Expression level analysis of CsEXPb1 in response to different hormones
3 讨论
果实的发育包括坐果、果实膨大及果实成熟等多个阶段。坐果期细胞分裂旺盛，不少研究者从
果实中克隆得到与细胞分裂和细胞膨大相关基因，如扩张蛋白（expansin）基因 CsExp3、CsExp5、
CsExp6、CsExp7、CsExp8、CsExp9 和 CsExp10 等（孙涌栋 等，2006）。植物的生长是细胞增殖和
增大的过程，细胞增大与细胞壁有着紧密联系，细胞壁压力的释放使细胞内水势产生继而引起细胞
的伸展。而 expansin 能弱化细胞壁多糖之间的非共价键引起细胞壁松弛继而促进细胞的增长
（McQueen-Mason & Cosgrove，1994；McQueen-Mason，1995；Li & Cosgrove，2001）。植物顶端
分生组织，如根端与茎端分生组织通过细胞的增殖与分化形成植物的各种器官及发育成特定形态，
而 expansin 有促进细胞组织生长的作用：Choi 等（2003）通过转基因的方法使 OsEXP4 基因在水稻
中得到正义和反义表达，与对照植株比较正义植株长的高、叶片数量多，且胚芽鞘及中胚轴长度增
加，同时反义植株表现出相反性状，证明扩张蛋白可以通过促进细胞壁的压力参与植株的生长发育
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过程。黄瓜中 CsExp1 和 CsExp4 在分裂旺盛的果实发育前期表达较高（孙涌栋 等，2008）。所以，
expansin 基因对植物生长发育有很大的调控作用。
有研究发现扩张蛋白基因的表达具有时空特异性，在不同组织部位或同一组织的不同发育时期
表达活性各不相同（Keller & Cosgrove，1995）。本研究中 CsEXPb1 的表达同样具有组织特异性，其
在根、茎、老叶以及雄花中的表达量较少而在嫩叶及雌花中的表达量较高。嫩叶处于细胞快速增殖
和生长期，目的基因在嫩叶中的大量表达能促进其细胞分裂与生长，这也证实了 expansin 基因有促
进细胞生长的功能；雌花与果实发育相关，CsEXPb1 在雌花中大量表达进一步证实了 expansin 基因
的功能及目的基因 CsEXPb1 与黄瓜坐果相关。黄瓜果实细胞分裂旺盛期为开花后一周内，细胞快速
膨大期开始于开花后 4 d（傅丰庆，2008）。本试验中授粉后‘8419’及‘EC1’中 CsEXPb1 表达量
在 6 d 内一直升高，说明 CsEXPb1 与细胞分裂及膨大有关，同时无论是授粉坐果还是单性结实的黄
瓜果实发育过程中 CsEXPb1 呈上调表达，而在败育的果实中下调表达，而且 CsEXPb1 受外源激素
（赤霉素、细胞分裂素及生长素）的正向调控。因此推测 CsEXPb1 与黄瓜坐果密切相关，且可能参
与调控了激素诱导的单性结实过程。很多研究表明黄瓜果实的形成和发育过程中内源生长素、细胞
分裂素及赤霉素逐渐升高（刘春香 等，2011）。而本研究中发现在外源生长素、细胞分裂素和赤霉
素诱导下 CsEXPb1 呈上调表达，因此推测在果实形成过程中，在逐渐提高的激素的诱导下，CsEXPb1
大量表达，从而影响细胞的分裂及生长，最终促进果实的膨大。在未来的研究工作中，拟通过转基
因方法对 CsEXPb1 进行功能分析，从而验证上述推论。

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