全 文 ：园艺学报，2015，42 (8)：1437–1447.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0057；http：//www. ahs. ac. cn 1437
收稿日期：2015–05–14；修回日期：2015–07–02
基金项目：国家杰出青年科学基金项目（31325024）；山东省现代化农业产业技术体系创新团队项目（SDAIT-03-022-03）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：haoyujin@sdau.edu.cn；fap_296566@163.com）
苹果己糖激酶基因 MdHXK1 的克隆与表达分析
赵 锦，孙美红，胡大刚*，郝玉金*
（山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，农业部黄淮地区园艺作物生物学与种质创制重
点实验室，山东泰安 271018）
摘 要：从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因 MdHXK1（基因序列号：MDP0000309677）全长，
测序发现其包含长为 1 497 bp 完整的开放阅读框，编码 499 个氨基酸，预测其编码蛋白质分子量为 54.05
kD，等电点为 5.76。系统进化树分析表明，HXK1 在不同物种间具有高度的序列保守性；其中，苹果
MdHXK1 与中国白梨 PbHXK1 亲缘关系最近。功能域分析表明，MdHXK1 蛋白含有两个保守的激酶域。
Southern blotting 结果表明，MdHXK1 在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明，MdHXK1 主要
定位于细胞质。分析 MdHXK1 基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。
荧光定量 PCR 分析表明，MdHXK1 在苹果的茎和花中表达量较高；在苹果果实发育期间，MdHXK1 基因
的表达、MdHXK1 葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势，MdHXK1 基
因的表达明显受盐、低温和 ABA 的诱导。原核诱导并纯化了 MdHXK1 蛋白，为后续 MdHXK1 蛋白的功
能鉴定奠定基础。
关键词：苹果；己糖激酶；HXK1；基因克隆；表达分析；原核表达
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）08-1437-11

Molecular Cloning and Expression Analysis of a Hexokinase Gene
MdHXK1 in Apple
ZHAO Jin，SUN Mei-hong，HU Da-gang*，and HAO Yu-jin*
（State Key Laboratory of Crop Biology，MOA Key Laboratory of Horticultural Crop Biology（Huanghuai Region）and
Germplasm Innovation，College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an，
Shandong 271018，China）
Abstract：A hexokinase gene named MdHXK1（MDP0000309677）was cloned from‘Gala’apple
（Malus × domestica Borkh.）. Sequence analysis showed that the length of MdHXK1 gene was 1 497 bp，
which encoded 499 amino acids. It was predicted that the molecular mass of this protein was 54.05 kD，
and pI was 5.76. A phylogenetic tree indicated that the HXK1 had a higher sequence conservation among
different species，while apple MdHXK1 exhibited the highest sequence similarity to Pyrus bretschneideri
PbHXK1. Analysis of functional domain showed that the MdHXK1 protein included two conserved kinase
domains. The prediction of subcellular localization suggested that MdHXK1 protein was mainly localized
in cytoplasm. There was an indication that MdHXK1 existed as one copy in apple genome by Southern


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blotting. In silico analysis suggested that the promoter sequence contained several typical cis-acting
elements，including defense responsive elements，sugar signaling responsive elements and phytohormone
responsive elements. Quantitative real-time PCR analysis demonstrated that the MdHXK1 gene was mainly
expressed in stem and flower. During the development of apple fruits，the expression of MdHXK1 gene
increased at first and then decreased. The changes on Glc phosphorylation activity（relative）and glucose
concentration showed the same trend. Besides，the expression of this gene was induced by salt stress，low
temperature and ABA. Finally，we obtained and purified the fused MdHXK1 protein by recombinant
prokaryotic expression，which established the foundation for the further study on the functions of
MdHXK1 protein.
Key words：apple；hexokinase；MdHXK1；molecular clone；expression analysis；prokaryotic
expression

在植物呼吸代谢过程中，葡萄糖感应因子己糖激酶（hexokinase，HXK）具有催化己糖磷酸化
的作用。己糖经 HXK 磷酸化才能进入糖酵解途径，进而为植物的生理活动提供能量和中间代谢产
物，因此，己糖的磷酸化对维持植物合成淀粉的碳流和呼吸作用是必不可少的（Claeyssen & Rivoal，
2007）。植物 HXK 在植物糖感知过程中的调节作用最初是通过各种糖对黄瓜培养细胞和玉米原生质
体中光合和乙醛酸循环中的基因表达产生明显抑制作用而发现的，这种抑制作用可被 HXK 特异竞
争性抑制剂阻遏（Karve et al.，2008）。拟南芥基因组中含有 6 个 HXK 家族成员（AtHXK1、AtHXK2、
AtHXK3、AtHKL1、AtHKL2 和 AtHKL3），3 个成员能磷酸化葡萄糖（Jang & Sheen，1994），其中
AtHXK1 被证明是拟南芥葡萄糖的感应因子（Jang et al.，1997）。将 AtHXK1 基因的正义和反义载体
遗传转化拟南芥，野生型拟南芥幼苗在 6%浓度的葡萄糖 MS 培养基上生长出现子叶变绿不正常、
发育迟缓、下胚轴和根长变短的表型；HXK1 反义拟南芥植株对葡萄糖不敏感，HXK1 过量表达植株
对葡萄糖高度敏感（Jang et al.，1997）。Moore 等（2003）的研究中，通过定点突变的方法，得到失
去催化活性的AtHXK1，并将之转入拟南芥HXK1突变体 gin2（glucose insensitive 2）中，发现AtHXK1
催化功能缺失后，仍具有感受糖信号的功能，即 AtHXK1 糖信号功能和糖代谢功能是非偶联的。
除了在信号转导途径中的调控作用外，HXK 还被证明参与调控植株的生长发育和激素信号转导
（Moore et al.，2003；秦巧平 等，2003；Rolland et al.，2006；Kunz et al.，2014）。利用 gin2 突变
体可以研究葡萄糖感知和信号转导在正常植物生长过程中的重要性。在不同环境条件下，AtHXK1
能抑制植物的生长，如抑制种子的萌发和幼苗的生长，或者促进植物生长，如促进成年植株的生长
和发育，加速植株衰老，缩短植株寿命（Smeekens et al.，2010）。野生型拟南芥在强光条件下快速
生长并出现叶片早衰现象，但是 gin2 植株体量小，深绿色，细胞膨大程度小，说明在强光条件下
HXK1 促进细胞膨大和根、叶及花序的生长（Loreti et al.，2001）。在转基因番茄植株中，AtHXK1
过量表达抑制植株生长并促进衰老，说明 HXK1 介导的糖信号可促进或抑制生长取决于固有的葡萄
糖水平和植物对葡萄糖的灵敏度（Granot，2007）。HXK1 介导的糖信号能够通过氧化磷酸化抑制控
制水稻 OsCIPK15[Calcineurin B-like（CBL）interacting protein kinase 15]基因的表达，调控缺氧信号
途径（Yim et al.，2012）。
随着研究的深入，Li 等（2012）用 AtHXK1 蛋白序列在苹果基因组数据库中进行 Blastp 分析，
将 MDP0000309677 命名为 MdHXK1。Li 等（2012）的研究表明，MdHXK1 基因可能参与苹果果实
糖代谢和积累过程，然而苹果 MdHXK1 对非生物胁迫的响应还不是很清楚。Feng 等（2015）研究
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了拟南芥 HXK1 蛋白的生物化学特性并解析了它的结构，这为深入研究 HXK1 奠定了基础。然而目
前对苹果等木本果树中 HXKs 的研究仍然不足，研究 HXKs 在糖代谢方面的功能有助于品种改良，
改善苹果果实的品质。本研究中以‘嘎啦’苹果（Malus × domestica Borkh.）为研究材料，通过基
因克隆获得苹果己糖激酶基因 MdHXK1，对其进行了生物信息学、Southern blotting 分析，利用实时
定量 PCR 技术对其在不同组织、生长期和逆境条件下的表达，以及果实发育时期内 MdHXK1 葡萄
糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累进行了研究，并通过原核诱导获得了重组蛋白，旨在为进一步深
入研究苹果己糖激酶蛋白的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料与处理
10 年生‘嘎啦’苹果种植在山东果树科学研究所的果树试验田（山东泰安）。2014 年 4 月开始，
分别在果实发育的不同时期（花后 30、60、90、120 d）取样，用液氮速冻，–80 ℃保存备用。检
测 MdHXK1 表达所用的组织包括生长根、幼茎、新生叶、初花时的花和花后 30 d 的幼果，取样后
用液氮速冻保存备用。分别用 100 mmol · L-1 NaCl、低温（10 ℃）、100 μmol · L-1 ABA 处理‘嘎啦’
组培苗，分时间段取样，用液氮冷冻备用。
1.2 总 RNA 的提取和 qRT-PCR
采用 RNA plant plus Reagent 试剂盒（天根）提取样品的 RNA，利用反转录试剂盒 PrimeScript®
RT reagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa）获得 cDNA。使用实时定量 RT-PCR 的方法，用 cDNA
模板检测苹果中 MdHXK1 的表达水平。苹果 18S RNA（上游引物为 5′-ACACGGGGAGGTAGTGAC
AA-3′，下游引物为 5′-CCTCCAATGGATCCTCGTTA-3′）作为等量上样参照。PCR 分析的特定引物
序列为 5′-CTGAAAGTGGTCGGGAGCAAA-3′和 5′-TGCACGAGTGGCAACTATGTCG-3′。用 Ultra
SYBR Mixture（with ROX）试剂盒（康为世纪）进行实时荧光定量 PCR 分析。20 μL 反应体系为：
2× UltraSYBR Mixture 10.0 μL，上游引物（10 μmol · L-1）1.0 μL，下游引物（10 μmol · L-1）1.0 μL，
cDNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。每样本 3 次技术重复。荧光定量 PCR 反应条件：95 ℃预变性 10 min，
95 ℃变性 15 s，56 ℃退火 15 s，65 ℃延伸 10 s，40 次循环，每次循环第 3 步进行荧光采集。最后
采用 2-∆∆CT 法进行定量数据分析。
1.3 MdHXK1 的克隆和生物信息学分析
在苹果基因组数据库中检索序列，设计出一对引物，5′-ATGGGGAAAGTGGCGGTG-3′和 5′-TTA
KGACTCCTCTACCTCAAGGTACTGGGA-3′，以从‘嘎啦’组培苗获得的 cDNA 为模板进行 PCR
扩增。PCR 反应程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，32
个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR 产物用 1.25%的琼脂糖凝胶进行电泳并回收目的条带，连接 pMD18-T
克隆载体进行测序。
分别利用 http：//web.expasy.org/protparam/、http：//smart.embl-heidelberg.de/、http：//psort.hgc.jp/
form2.html 和 http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php 网站对氨基酸的理化性质、蛋白结构功能域、亚
细胞定位和基因组结构进行在线预测分析。

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1.4 Southern blotting 检测拷贝数
CTAB 法提取‘嘎啦’组培苗基因组 DNA，在 MdHXK1 基因 5′UTR 区域设计引物：5′-GTCCAT
ACAACACATCACCTTC-3′；5′-ACCGCCGCTCAAATTACCAAAT-3′。PCR 反应条件为 95 ℃预变性
5 min；94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 35 s，30 个循环。以 5′UTR 区域选取的特异片
段作为探针，按照地高辛标记检测试剂盒说明书进行探针合成及检测。取基因组 DNA 15 μg，经
HindⅢ和 BamHⅠ酶切过夜，40 V 电压，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离 8 h，碱变性后转膜（Yao et al.，
2007）。80 ℃烘膜 2 h 以固定 DNA。杂交操作严格按照地高辛标记检测试剂盒说明书的要求进行。
1.5 MdHXK1 酶提取及葡萄糖磷酸化相对酶活性检测
酶的提取操作在 0 ~ 4 ℃进行。取–80 ℃储藏的果实（花后 30、60、90、120 d）各 0.5 g，冰
上研磨成粉末，立即加入 2 mL 提取缓冲液（200 mmol · L-1 Hepes-KOH，pH 8.0，5 mmol · L-1 MgCl2，
2 mmol · L-1 EDTA，2.5 mmol · L-1 DTT，2 mmol · L-1 苯甲脒，0.1 mmol · L-1 亮抑酶肽，0.1%牛血清
白蛋白，2%甘油，1%曲拉通 X-100 和 4% PVPP），混匀，10 000 r  min-1 离心 20 min，取上清液，
–80 ℃储藏备用。
MdHXK1 酶活性检测体系：50 mmol · L-1 Tris-HCl，pH 8.0，4 mmol · L-1 MgCl2，2.5 mmol · L-1
ATP，0.33 mmol · L-1 NAD+，1 U 葡萄糖–6–磷酸脱氢酶，1 mmol · L-1 葡萄糖和 25 μL 粗酶提取
物。定容至 0.5 mL，置于 25 ℃水浴保温，加入 25 μL 粗酶提取物反应开始计时。用蒸馏水调 0，在
340 nm 处读取吸光度的变化，每 30 s 记录 1 次，连续记录 5 min，以吸光值为纵坐标，时间为横坐
标，直线斜率即为反应速度，反应酶活性。每份样品测定 3 次重复。
1.6 果实葡萄糖含量检测
取–80 ℃储藏的果实（花后 30、60、90 和 120 d）各 2 g，加入体积分数为 80%的乙醇 2 mL，
充分研磨，完全转移至 50 mL 离心管中，定容至 15 mL，75 ℃提取 30 min。4 000 r  min-1 离心 10 min，
转移上清液至另一干净的 50 mL 离心管中，65 ℃烘干。充分干燥后的沉淀加入 5 mL 水溶解，并用
0.45 μm 薄膜过滤器过滤。滤液通过毛细管电泳系统检测葡萄糖含量（Yao et al.，2011）。
1.7 原核表达
用引物 5′-GGATCCATGGGGAAAGTGGCGGTG-3′和 5′-GTCGACTTAGGACTCCTCTACCTC
AAGG-3′扩增 MdHXK1 的编码框序列，之后连接到 pMD18-T 载体。利用 BamHⅠ和 SalⅠ对克隆载
体和原核表达载体 pET32a 分别进行双酶切，构建原核重组表达载体 pET32a-MdHXK1，将连接产物
转化到大肠杆菌 BL21 中。加入 0.5 mmol · L-1 IPTG 后在 0、1、3、6 h 时分别取样，离心收集菌体，
利用超声波破碎分离可溶性蛋白和包涵体，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2.1 苹果 MdHXK1 基因的克隆
试验中获得了一条大约 1 500 bp 的条带（图 1），与预期大小一致。序列测定与分析表明，苹果
MdHXK1（基因序列号：MDP0000309677）基因含有一个大小为 1 497 bp 的开放阅读框，编码 499
个氨基酸，预测其蛋白质分子量为 54.05 kD，等电点为 5.76。
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2.2 基因组结构分析
利用 GDR 数据库（http：//www.rosaceae.org/）分析 MdHXK1 基因的染色体位置和基因组结构。
如图 2 所示，MdHXK1 定位于苹果基因组的第 15 号染色体上，由 9 个外显子和 8 个内含子构成。

2.3 苹果 MdHXK1 系统进化树分析、蛋白的功能域和亚细胞定位
氨基酸序列比对和系统进化树分析表明，苹果 MdHXK1 与中国白梨（XP_009352555.1）、梅
（XP_008242483.1）、甜瓜（ACJ04704.1）、葡萄（AEJ95926.1）、欧洲大叶杨（XP_002325031.1）、
荷花（XP_010249484.1）、野生大豆（KHN41674.1）、树棉（KHG22031.1）、醉蝶花（XP_010526433.1）、
和野茶树（AHD25654.1）的同源性较高，分别为 96%、94%、86%、85%、84%、83%、83%、81%、
81%和 80%，表明其亲缘关系较近，与枇杷（ADZ96378.1）、拟南芥（NP_194642.1）、芜菁（XP_
009102132.1）的同源性均低于 80%（图 3）。结构域分析表明，MdHXK1 蛋白含有 Hexokinase_1 和
Hexokinase_2，两个保守的结构域，另外，Hexokinase_1 和 Hexokinase_2 结构域前有一段信号肽和
一个跨膜区域，与其它 HXK1 蛋白在功能结构域上保守性非常高。














图 3 苹果 MdHXK1 蛋白和其它物种 HXK1 蛋白的系统进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic tree of apple MdHXK1 and HXK1 proteins of other species











图 1 苹果 MdHXK1 基因编码区全长的 RT-PCR 扩增
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products











图 2 苹果 MdHXK1 基因的染色体定位和基因组结构
Fig. 2 Chromosomal location and genomic structure
of the MdHXK1
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MdHXK1 蛋白在大部分亚细胞结构均中有分布，在细胞质基质、线粒体、细胞核和内质网的比
例分别为 39.1%、17.4%、17.4%和 13%。
SOPMA 网站预测结果表明，MdHXK1 蛋白的二级结构以 α–螺旋（Alpha helix）、无规则卷曲
（Random coil）、折叠延伸链（Extended strand）和 β–转角（Beta turn）组成。其中 α–螺旋、无规
则卷曲、折叠延伸链的比例分别为 49.4%、26.31%和 15.26%，总和超过 90%，而 β–转角为 9.04%。
2.4 Southern blotting 鉴定拷贝数
用CTAB法提取嘎啦苹果组培苗的基因组
DNA，采用 Hind Ⅲ和 BamHⅠ进行酶切，结
果显示，MdHXK1 在苹果‘嘎啦’基因组中有
1 个拷贝（图 4）。
2.5 启动子顺式作用元件分析
对 MdHXK1 启动子上顺式作用元件进行
分析，结果如表 1。MdHXK1 基因启动子序列
含有多个与抗逆性相关的调控元件：脱水胁迫
相关顺式作用元件 ACGTATERD1（Simpson et
al.，2003）和 MYBCORE（Luscher & Eiseman，
1990；Urao et al.，1993；Solano，1995）；防御
相关顺式作用元件 MYB1LEPR（Chakravarthy

表 1 MdHXK1 基因上游调控序列重要顺式作用元件分析
Table 1 Some important cis-acting regulatory elements in the upstream regulatory sequences of MdHXK1
顺式作用元件名称
cis-acting element name
序列
cis-acting element sequence
位点功能
Function of cis-acting element
起始位点
Start site
终止位点
Terminal site
ACGTATERD1 ACGT 与叶片衰老相关的脱水和黑暗应答元件
cis-acting element involved in dehydration stress and
dark-induced leaf senescence
–1 988
–955
–1 985
–952
MYBCORE CNGTTR 脱水响应元件
cis-acting element involved in dehydration stress
–1 802
–1 757
–1 427
–1 797
–1 752
–1 422
MYB1LEPR GTTAGTT 防御相关元件
cis-acting element involved in defence induction
–1 680 –1 674
MYB2CONSENSUSAT YAACKG 与脱水响应相关的 MYB 识别位点
MYB identified site involved in dehydration stress
–1 472
–1 296
–1 467
–1 291
MYCCONSENSUSAT CANNTG 低温相关元件
cis-acting element related to cold
–1 401
–1 226
–912
–781
–679
–500
–143
–71
–1 396
–1 221
–907
–776
–674
–495
–138
–66
SREATMSD TTATCC 与糖信号相关元件
cis-acting element involved in sugar signaling response
–1 418 –1 413
CPBCSPOR TATTAG 细胞分裂素诱导元件
cis-acting element involved in cytokinin induction
–1 655
–1 377
–1 650
–1 372
CATATGGMSAUR CATATG 参与生长素调节
cis-acting element involved in auxin-related regulation
–500 –495











图 4 Southern-blotting 结果
左侧标注的是 Marker 条带大小。
Fig. 4 Southern-blotting analysis
The size of molecular marker band is shown at the left.

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et al.，2003）；与脱水响应相关的 MYB 识别位点 MYB2CONSENSUSAT（Abe et al.，2003）；低温
响应元件 MYCCONSENSUSAT（Abe et al.，2003；Chinnusamy et al.，2003，2004；Hartmann et al.，
2005；Lee et al.，2005；Oh et al.，2005；Agarwal et al.，2006）；与糖信号相关元件 SREATMSD（Tatematsu
et al.，2005）。另外，在上游序列中还发现了不同激素响应作用元件：细胞分裂素诱导顺式作用元件
CPBCSPOR（Fusada et al.，2005）和生长素调节相关顺式作用元件 CATATGGMSAUR（Xu et al.，
1997）。表明 MdHXK1 可能参与 ABA 和 IAA 对植物生长发育的调控过程。
2.6 MdHXK1 的表达分析、葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖含量检测
MdHXK1 在根、茎、叶、花以及幼果中都有表达，其中在茎和花中表达水平较高，根、叶和幼
果内表达水平较低（图 5）。在苹果果实发育过程中，MdHXK1 基因表达呈先升高后降低的趋势，在
果实发育 60 d 左右达到顶峰（图 5）。











图 5 MdHXK1 基因在苹果不同组织和不同发育时期果实中的表达水平
Fig. 5 Expression of MdHXK1 gene in different tissues of apple and different stage fruits

另外，测定了葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累量。结果（图 6）表明，在苹果果实发育
过程中，两者都在果实发育 60 d 达到最高，之后降低，果实成熟后期又略有升高。









图 6 苹果花后不同发育时期果实中 MdHXK1 葡萄糖磷酸化相对酶活性检测及葡萄糖积累量
Fig. 6 Glc phosphorylation relative activity and the accumulation of glucose in apple fruits at the indicated days after bloom

‘嘎啦’组培苗分别经过 100 mmol · L-1 NaCl、低温（10 ℃）、100 μmol · L-1ABA 处理后，分
时段取样，提取 cDNA 为模板，用 MdHXK1 的特异引物进行了 qRT-PCR 分析。MdHXK1 表达受盐、
低温和 ABA 诱导。在盐胁迫下，MdHXK1 表达量在处理后 6 h 达到最高；低温条件下，MdHXK1
表达量在处理后 1 h 达到最高；ABA 处理后 6 ~ 48 h，MdHXK1 表达量维持较高水平（图 7）。

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图 7 MdHXK1 基因在非生物胁迫下的表达水平
Fig. 7 Expression pattern of MdHXK1 gene under abiotic stress

2.7 MdHXK1 蛋白原核表达
未经 IPTG 诱导处理的蛋白提取物没有诱导蛋白产生，而 IPTG 诱导 1、3、6 h 的蛋白提取物都
有一条约 70 kD 的条带（图 8），由于 His 标签大小为 20 kD 左右，所以诱导蛋白的实际大小约为 50
kD，与 MdHXK1 预测蛋白的大小（54 kD）接近。此外，诱导产生的 MdHXK1 蛋白以包涵体的形
式存在。











图 8 pET32a-HXK1 在大肠杆菌 BL21 中的表达、上清液和包涵体蛋白的 SDS-PAGE
Fig. 8 SDS-PAGE of pET32a-HXK1 expression products，soluble protein in the supernatant and inclusion body protein
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3 讨论
已有试验证明在拟南芥中过表达 AtHXK1 后，幼苗对外源葡萄糖高度敏感（Jang et al.，1997），
说明己糖激酶具有糖感知功能，能够感知外界营养、光和激素信号，调控拟南芥生长，因此被称为
双功能兼职酶（Moore，2004）。
在拟南芥（Karve et al.，2008）、水稻（Cho et al.，2006a）及小立碗藓（Olsson et al.，2003）中，
大部分 HXK 同源基因都具有 9 个外显子，但是成员间内含子长短的差异比较大。本研究中克隆得
到的苹果己糖激酶基因 MdHXK1，含有 9 个外显子。MdHXK1 蛋白功能域预测的结果表明其存在信
号肽和跨膜结构域，说明 MdHXK1 蛋白可能是一种分泌蛋白，在核糖体完成合成之后，其前体蛋
白在信号肽引导下到达指定部位，然后在剪切位点将信号肽切除，从而成为成熟蛋白质发挥作用。
序列比对表明苹果 MdHXK1 基因与中国白梨、梅、甜瓜、葡萄、欧洲大叶杨、荷花、野生大豆、树
棉、醉蝶花和野茶树等植物中的 HXK1 基因具有高度同源性。进化树分析进一步表明，苹果 MdHXK1
与中国白梨 HXK1 进化关系最为接近，推测二者功能相近。MdHXK1 蛋白像己糖激酶家族大部分成
员一样，还包含 hexokinase_1 和 hexokinase_2 两个保守结构域，预测这两个结构域都存在 ATP 绑定
位点，具有磷酸转移酶活性，能够将 ATP 的磷酸基团转移到含有羟基的受体上，两者所包围的空间，
应该是进行酶催化的活性区域。
在植物细胞中己糖激酶位于细胞质和高尔基体、线粒体、叶绿体等细胞器中，其不同的亚细胞
定位导致其功能上的差异（秦巧平 等，2003）。在细胞质中，作为糖酵解反应的关键酶，己糖激酶
起催化葡萄糖磷酸化的作用，这一过程能使葡萄糖活化，有利于其进一步参与接下来的合成与分解
代谢，同时还能使已经进入细胞的葡萄糖不再逸出（张超 等，2012）；线粒体膜上，HXK 蛋白参与
糖酵解过程，将丙酮酸运输到线粒体合成 NADH 和 ATP，再被 HXK 及参与糖酵解和糖核苷酸合成
过程中的其他酶利用（Damari-Weissler et al.，2006；Kandel-Kfir et al.，2006）。在细胞核内，已有
报道指出拟南芥中 HXK1 蛋白可以与 VHA-B1 和 RPT5B 形成一个复合体，直接作用于葡萄糖信号
调节基因的启动子上，从而调控目的基因的表达（Cho et al.，2006b）。本研究结果表明，苹果 HXK1
蛋白主要定位于细胞质、线粒体和细胞核等细胞器中，与前人在拟南芥中的研究结果一致。Southern
blotting 试验结果显示，MdHXK1 在苹果‘嘎啦’基因组中有一个拷贝。
已有研究证明，糖可促使花青素在花瓣中的积累，而 HXK 抑制剂能够抑制该表型，说明该过
程是依赖 HXK 途径的（Zheng et al.，2009）。荧光定量 PCR 的数据显示，MdHXK1 在苹果不同组织
中都有表达，在花中表达量最高。MdHXK1 在花中的高表达量可能与花青素积累有关。在苹果果实
发育的不同时期，MdHXK1 的表达量不同，可能与苹果发育过程中糖代谢和积累的进程有关。在果
实发育初期，由于细胞分裂和生长需要大量能量，MdHXK1 表达量提高，使得糖代谢加快，以满足
植物需要。随着果实发育，对能量和碳骨架的需求逐渐降低，MdHXK1 的表达量降低（Li et al.，2012）。
苹果果实不同发育时期的葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖含量与 MdHXK1 的基因表达水平不完
全一致，实际上，苹果基因组中有 6 个基因编码己糖激酶（Li et al.，2012），因此，除 MdHXK1 基
因以外，应还有其它己糖激酶基因参与了葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖含量的调控。
另外，以前的研究发现，葡萄糖和 ABA 二者共同调节 ABA 合成与信号转导相关基因的表达，
该过程通过己糖激酶进行（Arenas-Huertero et al.，2000）；拟南芥 AtHXK2 可以被低温、渗透和盐胁
迫诱导（Kreps et al.，2002）；本研究显示，MdHXK1 启动子上含有响应 ABA 和低温的顺式作用元
件，并且 MdHXK1 的表达受盐、低温和 ABA 的诱导。同时，通过原核诱导，成功获得并纯化了
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良等奠定了基础。

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