全 文 :园艺学报,2016,43 (7):1236–1244.
Acta Horticulturae Sinica
1236 doi:10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0964;http://www. ahs. ac. cn
收稿日期:2016–02–24;修回日期:2016–07–04
基金项目:国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目(CARS-28);山东省自然科学基金项目(ZR2014CL024)
* 通信作者 Author for correspondence(E-mail:yinchengmiao@163.com;mzhiquan@sdau.edu.cn)
微酸性电解水对苹果连作土壤环境的影响
相 立 1,徐少卓 1,王功帅 1,沈 向 1,陈学森 1,宋华鲁 2,李法德 2,
尹承苗 1,*,毛志泉 1,*
(1 山东农业大学园艺科学与工程学院,作物生物学国家重点实验室,山东泰安 271018;2 山东农业大学机械与电子
工程学院,山东泰安 271018)
摘 要:以平邑甜茶幼苗(Malus hupehensis Rehd.)为试材,在盆栽条件下研究了连作土壤浇灌微酸
性(pH 6.0)电解水对土壤环境和平邑甜茶幼苗生长的影响。结果表明,连作土壤中浇入微酸性电解水能
够显著提高平邑甜茶幼苗的生物量,与连作土对照相比,幼苗根长度、根表面积、根体积和根系呼吸耗
氧速率分别提高了 47.03%、141.79%、101.31%和 37.31%,连作土壤中真菌数量降幅达 48.1%,细菌/真菌
比值增加 120%;应用 T-RFLP 技术分析了连作土壤真菌的群落结构,并采用多样性指数分析、聚类分析
和主成分分析,发现微酸性电解水处理的土壤真菌群落具有最高的丰富度指数、多样性指数、均匀度指
数和最低的优势度指数,而连作土壤的真菌群落具有最高的优势度指数和最低的丰富度指数、多样性指
数、均匀度指数。微酸性电解水处理后,土壤真菌构成一个独立的群落结构,这些群落能够适应电解水
处理后的土壤环境并成为环境的优势群落。微酸性电解水可减轻苹果连作障碍。
关键词:苹果;平邑甜茶;微酸性电解水;连作;微生物
中图分类号:S 661.1 文献标志码:A 文章编号:0513-353X(2016)07-1236-09
Effects of Slightly Acid Electrolyzed Oxidizing Water on Apple Replanted
Soil Environment
XIANG Li1,XU Shao-zhuo1,WANG Gong-shuai1,SHEN Xiang1,CHEN Xue-sen1,SONG Hua-lu2,
LI Fa-de2,YIN Cheng-miao1,*,and MAO Zhi-quan1,*
(1College of Horticulture Science and Engineering,Shandong Agricultural University,State Key Laboratory of Crop
Biology,Tai’an,Shandong 271018,China;2College of Mechanical and Electronic Engineering,Shandong Agricultural
University,Tai’an,Shandong 271018,China)
Abstract:Effects of SAEW(Slightly Acid Electrolyzed Oxidizing Water,pH 6.0)on the replanted
soil environment and Malus hupeheusis Rehd. seedlings biomass were investigated in pot experiments.
Results showed that SAEW significantly enhanced Malus hupeheusis Rehd. seedling biomass. Compared
with the control,SAEW increased the length of roots,surface area of roots,total roots volume and root
activity by 47.03%,141.79%,101.31% and 37.31%,respectively. Compared with the control,SAEW
decreased the numbers of fungi by 48.1%,and the ratio of bacteria to fungi increased by 120%. T-RFLP
(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)was applied in the analysis of soil fungal
相 立,徐少卓,王功帅,沈 向,陈学森,宋华鲁,李法德,尹承苗,毛志泉.
微酸性电解水对苹果连作土壤环境的影响.
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diversity. Based on the T-RFLP,diversity index analysis,cluster analysis and principal component
analysis,the simpson index of SAEW on the replanted soil was improved,Shannon index,Pielou index
and Margalef index were reduced significantly. However,the SAEW treatment soil expressed a reverse
trend. SAEW on the replanted soil formed independent community structure,and these communities
could adapt to their own specific soil environment and become the dominant population. SAEW could
reduce apple replant disease.
Key words:apple;Malus hupehensis;SAEW;replant disease;microorganism
随着苹果园进入老龄化阶段,果园更新和连作栽培在所难免。苹果连作障碍常表现为植株产量
降低,品质变劣,生长受限甚至树体死亡,造成严重的经济损失(Laurent et al.,2008)。连作障碍
在世界各苹果主产区普遍发生,已成为各优势产区普遍存在和亟需解决的生产问题。Mazzola(1999)
研究发现,苹果再植园土壤中微生物系统随着栽培时间的增加而发生变化,认为导致苹果连作障碍
的直接原因为土壤微生物群落组成的变化。在移栽前,对土壤消毒可有效缓解苹果再植病(Wilon et
al.,2004)。在美国东北部的经济果园中控制连作障碍主要是通过种植前的土壤熏蒸,甲基溴、威百
亩、氯化苦等被广泛应用,但因这些熏蒸剂大都污染环境且对人体有害,因此替代熏蒸剂的土壤消
毒研究变得非常重要(Yao et al.,2006;尹承苗 等,2014a)。
电解水又称氧化还原电位水(electrolyzed oxidizing water,EOW),是在特殊的装置中电解食盐
或稀盐酸得到的具有特殊功能的酸性电解水(acid electrolyzed water,AEW)、碱性电解水(alkaline
electrolyzed water,AIEW)和中性电解水(neutral electrolyzed water,NEW)的总称,最早起源于
日本(Shimizu & Hurusawa,1992)。通常根据 pH 值不同,酸性电解水又分为强酸性电解水(strongly
acid electrolyzed water,pH ≤ 2.7)和微酸性电解水(slightly acid electrolyzed water,SAEW,5.0 ≤
pH ≤ 6.5)。微酸性电解水具有安全,经济,杀菌能力强、范围广,无污染,无残留,容易操作,
副作用少等优点(李华贞 等,2011)。另外,2002 年日本将强酸性电解水和微酸性电解水又以次氯
酸水的名字指定为食品添加剂(杀菌剂);而弱酸性电解水也作为食品添加剂获得了日本食品安全委
员会的批准(Yoshida et al.,2004)。Abadias 和 Usall(2008)、Guentzel 等(2007)将微酸性电解水
应用于鲜切蔬菜的研究,结果表明微酸性电解水能有效抑制或杀灭鲜切果蔬表面的病原性微生物,
且抑制效果好于强酸性电解水。郝建雄等(2006)的研究表明,微酸性电解水可以控制小麦条锈病
等病害。Koide 等(2009)的研究表明,微酸性电解水可有效用于食品行业和种植业的消毒。
本研究中以平邑甜茶(苹果常用砧木)为试材,探讨微酸性电解水对其幼苗以及连作土壤环境
的影响,为减轻苹果连作障碍提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料与处理
试验于 2014 年在山东农业大学园艺科学与工程学院国家苹果中心试验基地进行。试验用土取
自山东省泰安市满庄镇 25 年生红富士苹果园[砧木为八棱海棠(Malus micromalus)],棕壤土,速
效钾含量为 108.86 mg · kg-1,速效磷为 9.28 mg · kg-1,硝态氮为 13.23 mg · kg-1,铵态氮为 4.32
mg · kg-1,有机质为 5.06 g · kg-1。
Xiang Li,Xu Shao-zhuo,Wang Gong-shuai,Shen Xiang,Chen Xue-sen,Song Hua-lu,Li Fa-de,Yin Cheng-miao,Mao Zhi-quan.
Effects of slightly acid electrolyzed oxidizing water on apple replanted soil environment.
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采用山东农业大学机械与电子工程学院李法德教授实验室的浸没式电解混合装置,以 HCl 为电
解质,电解一定时间后制得微酸性电解水[pH(6.0 ± 0.05),氧化还原电位(1 050 ± 20)mV,有效
氯含量(70 ± 5)mg · L-1]。
供试材料为平邑甜茶(Malus hupeheusis Rehd.)实生苗。将平邑甜茶种子于 4 ℃层积 30 d 左右,
种子露白后,于 2014 年 4 月播种于育苗培养钵中。2015 年 5 月 1 日至幼苗长至 6 片真叶时,取长
势基本一致的幼苗移栽至上部内径 25 cm,下部内径 17 cm,高 18 cm 的泥盆中,每盆定植 2 株幼
苗。
盆中苹果连作土壤分别作如下 3 个处理:(1)连作土对照;(2)电解水处理,移栽幼苗前 3 d
盆内浇灌新制的电解水(泥盆的体积与浇灌电解水的比例为 9︰1);(3)溴甲烷熏蒸。每处理设 30
盆重复,处理后正常肥水管理。
1.2 测定指标
平邑甜茶生物量的测定:于 7 月 15 日、8 月 15 日和 9 月 15 日用常规方法测定平邑甜茶幼苗的
株高和地径。完整取出植株地上部和根系,清洗干净,阴凉处晾干后用天平测鲜质量,然后 105 ℃
杀青 30 min,80 ℃烘至恒重后测干质量。
平邑甜茶根系相关指标的测定:于 8 月 15 日将幼苗取出,小心用水洗净根系后,放于盛有水
的硬塑料板中,并将根系展开,用专业版 WinRHIZO(2007 年版)根系分析系统分析处理样品图像,
记录根长度、根系表面积和根体积。取新鲜白根,用英国 Hansatech 公司的 Oxytherm 氧电极测根系
呼吸速率(向红 等,2013;王元丽 等,2014)。
土壤微生物测定:8 月 15 日采集土样,细菌采用土壤浸出液 LB 培养基培养,稀释平板计数法
计数;PDA 选择性培养基培养真菌,稀释平板计数法计数(程丽娟和薛泉宏,2000)。
末端限制性片段长度多态性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP)
技术分析:参照尹承苗等(2014b)的方法,按照 E. Z. N. A. Soil DNA Kit 说明书提取样品土壤总
DNA,并进行 ITS-PCR 扩增,用限制性内切酶 HhaⅠ对 PCR 纯化产物进行酶切,将酶切产物送至
生工生物工程(上海)股份公司进行测序。对测序结果进行真菌群落多样性分析、聚类分析和主成
分分析。
1.3 数据分析
试验数据采用 Microsoft Excel 2003 进行计算和作图,差异显著性通过 SPSS 19.0 软件进行邓肯
氏新复极差法检测。
2 结果与分析
2.1 微酸性电解水对连作条件下平邑甜茶株高、地径及生物量的影响
由表 1 可以看出,3 个处理的平邑甜茶幼苗株高、地径、鲜质量和干质量在 7、8、9 月份均表
现出相同的趋势:溴甲烷熏蒸 > 微酸性电解水处理 > 连作对照。9 月 15 日,微酸性电解水处理的
平邑甜茶幼苗的株高、地径、鲜质量和干质量分别比同期对照增长 33.48%、16.67%、75.68%和
140.87%。
相 立,徐少卓,王功帅,沈 向,陈学森,宋华鲁,李法德,尹承苗,毛志泉.
微酸性电解水对苹果连作土壤环境的影响.
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表 1 微酸性电解水对平邑甜茶幼苗生长的影响
Table 1 Effects of SAEW on plant biomass growth of Malus hupehensis seedling
日期
Date
处理
Treatment
株高/cm
Height
地径/mm
Diameter
鲜质量/g
Fresh weight
干质量/g
Dry weight
连作土(对照)Replanted soil(Control) 17.77 ± 1.147 c 2.43 ± 0.102 c 5.70 ± 1.132 c 1.46 ± 0.167 c
微酸性电解水处理
Slightly acid electrolyzed water treatment
27.03 ± 0.584 b 3.45 ± 0.160 b 13.32 ± 1.565 b 3.15 ± 0.248 b
07–15
溴甲烷处理 Methyl bromide treatment 33.97 ± 1.534 a 4.20 ± 0.167 a 20.57 ± 1.268 a 6.13 ± 0.340 a
连作土(对照)Replanted soil(Control) 27.80 ± 3.156 c 4.40 ± 0.251 c 25.20 ± 2.322 c 10.05 ± 0.796 c
微酸性电解水处理
Slightly acid electrolyzed water treatment
44.50 ± 3.482 b 6.27 ± 0.075 b 44.87 ± 2.887 b 18.22 ± 0.919 b
08–15
溴甲烷处理 Methyl bromide treatment 61.27 ± 1.867 a 7.56 ± 0.239 a 74.95 ± 2.367 a 24.88 ± 0.676 a
09–15 连作土(对照)Replanted soil(Control) 44.30 ± 2.608 c 7.16 ± 0.386 c 37.67 ± 4.593 c 12.88 ± 1.221 c
微酸性电解水处理
Slightly acid electrolyzed water treatment
59.13 ± 2.284 b 8.35 ± 0.268 b 66.18 ± 3.517 b 31.02 ± 1.510 b
溴甲烷处理 Methyl bromide treatment 71.77 ± 1.846 a 11.69 ± 0.491 a 99.33 ± 1.413 a 54.78 ± 2.092 a
注:表中不同小写字母表示不同处理间的差异(P < 0.05)。下同。
Note:Different letters in the table stand for the significant difference at the 0.05 level. The same below.
2.2 微酸性电解水对连作条件下平邑甜茶根系的影响
如表 2 所示,与连作对照相比,微酸性电解水处理植株的根长度、根表面积、根体积和根系呼
吸耗氧速率分别增加了 47.03%、141.79%、101.31%和 37.31%。
表 2 微酸性电解水对单株幼苗根系的影响
Table 2 Effects of SAEW on the roots
处理
Treatment
根长度/cm
Roots length
根表面积/cm2
Roots surface
根体积/cm3
Roots volume
根系呼吸耗氧速率/
(nmol · min-1 · g-1 FW)
Root activity
连作土(对照)Replanted soil(Control) 2 825.95 ± 359.60 c 487.70 ± 56.09 c 12.09 ± 0.88 c 311.21 ± 18.13 c
微酸性电解水处理
Slightly acid electrolyzed water treatment
4 155.18 ± 167.41 b 1 179.20 ± 71.43 b 24.35 ± 1.25 b 427.34 ± 17.29 b
溴甲烷处理 Methyl bromide treatment 5 301.03 ± 228.03 a 1 654.70 ± 33.62 a 29.72 ± 1.59 a 616.28 ± 28.55 a
2.3 微酸性电解水对连作条件下土壤微生物的影响
由表 3 可知,连作土壤中浇入微酸性电解水后土壤中的真菌数量减少了 48.1%,但是微酸性电
解水处理使连作土壤中细菌/真菌增加,增加幅度为 52.8%。这可能是因为连作土壤中浇入微酸性电
解水后真菌减少的程度大于细菌减少的程度,导致连作土壤向细菌化发展,有利于土壤的良性发育。
表 3 微酸性电解水对土壤微生物的影响
Table 3 The influence of SAEW on soil microorganisms
处理
Treatment
土壤细菌数/(× 105 CFU · g-1)
The number of soil bateria
土壤真菌数/(× 103 CFU · g-1)
The number of soil fungi
细菌/真菌
Bacteria/fungi
连作土(对照)Replanted soil(Control) 33.73 ± 1.84 a 42.57 ± 2.13 a 79.92 ± 7.37 c
微酸性电解水处理
Slightly acid electrolyzed water treatment
26.51 ± 3.68 ab 22.09 ± 2.13 b 122.14 ± 18.66 b
溴甲烷处理 Methyl bromide treatment 17.67 ± 1.06 b 8.03 ± 2.24 c 266.20 ± 83.61 a
Xiang Li,Xu Shao-zhuo,Wang Gong-shuai,Shen Xiang,Chen Xue-sen,Song Hua-lu,Li Fa-de,Yin Cheng-miao,Mao Zhi-quan.
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2.4 微酸性电解水处理的连作土壤真菌 T-RFLP 分析
T-RFLP 可用于连作苹果园土壤真菌的群落结构研究,通过多样性指数、聚类分析和主成分分
析比较不同处理间的土壤真菌多样性,可以掌握连作苹果园土壤真菌的群落结构特征变化(Wang et
al.,2004)。
由表 4 可以看出,微酸性电解水处理土壤具有最高的真菌丰富度指数、多样性指数、均匀度指
数和最低的优势度指数,而连作对照具有最高的优势度指数和最低的丰富度指数、多样性指数、均
匀度指数。由此可见,微酸性电解水处理改变了土壤真菌的群落结构,提高了土壤真菌群落的丰富
度、多样性和均匀度,降低了连作土壤真菌群落单一有害真菌的优势度。
表 4 土壤真菌多样性分析
Table 4 Species diversity of soil fungi
处理
Treatment
多样性指数
Shannon index
优势度指数
Simpson index
均匀度指数
Pielou index
丰富度指数
Margalef index
连作土(对照)Replanted soil(Control) 2.29 ± 0.03 c 0.15 ± 0.00 a 0.80 ± 0.01 b 3.79 ± 0.13 c
微酸性电解水处理
Slightly acid electrolyzed water treatment
2.49 ± 0.04 a 0.13 ± 0.01 b 0.83 ± 0.02 a 4.83 ± 0.01 a
溴甲烷处理 Methyl bromide treatment 2.38 ± 0.04 b 0.14 ± 0.01 ab 0.80 ± 0.01 b 4.11 ± 0.00 b
由图 1 聚类分析可以看出,浇灌微酸性电解水的土壤真菌群落结构与连作土壤完全独立开来,
可以说明微酸性电解水处理后明显改变了连作苹果园土壤的真菌群落结构。
图 1 不同处理间真菌 T-RFLP 图谱的聚类分析
Fig. 1 Cluster analysis of T-RFLP patterns of different treatments
根据主成分的提取原则(尹承苗 等,2014b),由图 2 可以看出酸性电解水处理后的土壤真菌
群落与连作土对照、溴甲烷熏蒸土壤真菌群落分为 2 个相对独立的群落,进一步说明微酸性电解水
处理明显改变了连作苹果园土壤的真菌群落结构。
相 立,徐少卓,王功帅,沈 向,陈学森,宋华鲁,李法德,尹承苗,毛志泉.
微酸性电解水对苹果连作土壤环境的影响.
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图 2 不同处理间真菌 T-RFLP 图谱的主成分分析
CK-1 ~ CK-3 为连作土(对照);T1-1 ~ T1-3 为微酸性电解水处理;T2-1 ~ T2-3 为溴甲烷处理。
Fig. 2 PCA for T-RFLP patterns of different treatments
CK-1–CK-3 stand for replanted soil(control);T1-1–T1-3 stand for slightly acid electrolyzed water treatment;
T2-1–T2-3 stand for methyl bromide treatment.
3 讨论
苹果连作障碍是国内外苹果主产区普遍存在的问题(Bai et al.,2009)。在中国,受土地资源限
制,大面积苹果园老龄化,普遍面临连作现象,苹果连作条件下植株根系数量减少、功能减弱,生
长势减弱,产量减少,造成巨大的经济损失。如何有效缓解或克服连作障碍已成为苹果产业可持续
发展的一项重要工作(孙海兵 等,2011;Tewoldemedhin et al.,2011a)。己有报道,与苹果连作障
碍有关的主要致病真菌属有柱孢属、镰刀属、丝核属、疫霉属和腐霉属等(Dullahide et al.,1994;
Mazzola,1998)。Tewoldemedhin 等(2011b)从连作果园苹果腐烂的根中分离到了大量的尖孢镰刀
菌。van Schoor 等(2009)研究发现,在南非所有连作苹果园中,土壤有害真菌镰刀属、柱孢属以
及腐霉属是引起连作障碍的主要原因,真菌是某些地区苹果连作障碍的主要原因,病原菌往往是由
许多真菌组成的真菌复合体。目前,生产上克服连作障碍的方法有轮作、抗性砧木、土壤消毒、生
物菌肥和生物防治等(刘恩太 等,2014)。其中土壤杀菌消毒是简单有效的连作障碍控制途径。目
前,土壤熏蒸杀菌剂包括溴甲烷、棉隆、威百亩、氯化苦等,但这些熏蒸剂大都污染环境且对人体
有害。
微酸性电解水(SAEW)具有广谱杀菌性、效率高、经济、安全、环保等诸多优点。关于 SAEW
的杀菌机理,许多研究表明有效氯含量越高,杀菌效果越好(Kim et al.,2000;Oomori et al.,2000;
Zhang et al.,2011;贾国梁 等,2015),有效氯包括次氯酸、次氯酸根离子或溶解的单质氯等,次
氯酸是 SAEW 具有杀菌能力的最有效形式,其次是次氯酸盐。HCIO 可以通过氧化核酸和蛋白质来
破坏微生物细胞结构(Whangchai et al.,2010)。也有研究认为酸性电解水(AEW)的杀菌效果主
要是有效氯含量(available chlorine content,ACC)和氧化还原电位(oxidation-reduction potential,
ORP)的联合抗菌效果(Arevalos-sanchez et al.,2013)。Monnin 等(2012)和 Liao 等(2007)认
为高 ORP 值使 SAEW 具有杀菌效果。Liao 等(2007)研究指出通过电子显微镜学和荧光测量技
Xiang Li,Xu Shao-zhuo,Wang Gong-shuai,Shen Xiang,Chen Xue-sen,Song Hua-lu,Li Fa-de,Yin Cheng-miao,Mao Zhi-quan.
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术显示出高氧化还原电位(ORP)值可以破坏大肠杆菌 O157:H7 外膜和内膜,从而导致大肠杆菌
O157:H7 的失活。其失活机理为 ORP 可能影响和损坏 GSSG/2GSH 的第一氧化还原状态的稳定,
破坏了 E. coli O157:H7 的结构和功能,并渗透 E. coli O157:H7 外膜和内膜,导致 E. coli O157:
H7 的坏死。Suzuki 等(2002)通过酶联免疫吸附测定、高效液相色谱法等手段研究发现电解水(EOW)
的理化指标达到一定程度[pH(2.5 ~ 2.8),氧化还原电位(oxidation-reduction potential,ORP)1 180
mV,有效氯含量(available chlorine content,ACC)36.3 μg · mL-1]可以灭活。Zhang 等(2012)研
究发现经过酸性电解水(AEW)室温处理 15 min 后,花生中 85%黄曲霉毒素 AFB1 被除掉,而且经
过处理,花生中的营养素(蛋白质、脂质、碳水化合物成分)没有显著性变化,花生表皮的颜色也
没有发生变化。Audenaert 等(2012)的研究表明,EOW 在体外试验和体内试验均可抑制镰孢菌属,
但是由于氧化应激反应,中性电解水(NEW)也造成了镰孢菌属产生的真菌毒素(如 DON)增多,
可见利用 EOW 抑菌的方法需要进一步优化,如通过延长浸泡时间、增加浸泡次数等方法再次将真
菌毒素杀死(贾国梁 等,2015)。本试验中通过浇灌 SAEW 来杀灭连作土壤中的有害真菌。一般土
壤细菌数量越多,真菌数量越少,细菌/真菌越高,就越有利于作物生长(Sun et al.,2001;Wu et al.,
2008)。本研究中发现,浇灌微酸性电解水显著降低了苹果连作土壤中真菌和细菌数量,降低幅度为:
真菌 > 细菌。因此,浇灌微酸性电解水使苹果连作土壤中细菌/真菌增加。这可能是因为连作土壤
中浇入微酸性电解水后真菌繁殖的程度小于细菌繁殖的程度,导致连作土壤向细菌化发展,有利于
土壤的良性发育。多样性分析结果显示,微酸性电解水处理的土壤与连作土对照的真菌多样性存在
差异,表现为微酸性电解水处理具有最高的丰富度指数、多样性指数、均匀度指数和最低的优势度
指数;聚类分析发现,微酸性电解水与连作土的土壤真菌群落结构有明显差异,说明微酸性电解水
处理明显改变了连作苹果土壤中的真菌群落结构。本研究中的植株数据显示,微酸性电解水处理的
连作条件下平邑甜茶植株株高、地径和干鲜质量均显著提高,同时根系长度、表面积、体积和根系
呼吸速率等显著增加,说明微酸电解水处理促进了连作平邑甜茶幼苗的生长。但是微酸性电解水处
理与溴甲烷对照相比,仍有很大差距。
微酸性电解水处理使连作土壤的真菌数量显著减少,细菌与真菌比值增加,土壤真菌群落发生
改变,平邑甜茶幼苗的根系长度、表面积、体积和根系呼吸速率增加,且生物量显著增加。应用微
酸性电解水进行连作土壤杀菌消毒无污染、无残留、安全、经济、对人体无毒无害、简便易行,有
很好的应用前景。因此,可将微酸性电解水作为有效减轻苹果连作障碍的技术措施。
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