全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（3）：409–416 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–09–11；修回日期：2014–01–27
基金项目：国家自然科学基金项目（31125024）；国家‘863’计划课题（2011AA100205）；教育部创新团队项目（IRT13065）；湖北省
自然科学基金创新群体项目（2013CFA001）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：guoww@mail.hzau.edu.cn；Tel：027-87281543）
柑橘 10个品种实生后代多倍体的发掘及 SSR鉴
定
梁武军，解凯东，郭大勇，谢宗周，徐 强，伊华林，郭文武*
（华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，农业部华中地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，武汉
430070）
摘 要：秋季采摘柑橘成熟果实并剥取种子，将小粒种籽和瘪籽播于 MT 培养基，待萌发长出 2 ~ 3
片真叶时，取其叶片检测倍性；将饱满种籽播种于露地，对其幼苗首先通过形态筛选获得似多倍体的植
株，然后取其叶片用流式细胞仪进行倍性检测；最后对获得的多倍体植株进行 SSR 分子鉴定。试验结果
表明，获得早金甜橙、卡特夏橙、塔罗科血橙、日辉橘、Ortanique 橘橙、默科特橘橙、华农本地早橘、
朱红橘和 Flame 葡萄柚等 9 个品种的四倍体分别为 6、1、3、12、3、6、2、1 和 10 株；获得早金甜橙、
塔罗科血橙、Itabori 甜橙和 Ortanique 橘橙等 4 个品种的三倍体分别为 1、1、2、4 株。用 13 对多态性 SSR
引物对胚抢救获得的三倍体和四倍体的来源进行鉴定，发现早金甜橙、Itabori 甜橙的三倍体再生植株为异
源三倍体；塔罗科血橙、Ortanique 橘橙的三倍体可能为同源三倍体；早金甜橙和 Ortanique 橘橙的四倍体
可能为同源四倍体；塔罗科血橙四倍体为异源四倍体。采用 37 对多态性引物对从饱满种籽中获得的 8 个
品种四倍体的来源进行鉴定，发现均为同源四倍体。这些自然发掘的多倍体资源对柑橘无核育种和相关
基础研究具有重要价值。
关键词：柑橘；多倍体；SSR 分子标记
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）03-0409-08

Spontaneous Generation and SSR Characterization of Polyploids from Ten
Citrus Cultivars
LIANG Wu-jun，XIE Kai-dong，GUO Da-yong，XIE Zong-zhou，XU Qiang，YI Hua-lin，and GUO
Wen-wu*
（Key Laboratory of Horticultural Plant Biology（Ministry of Education），Key Laboratory of Central China Horticultural
Crop Biology and Germplasm Enhancement（Ministry of Agriculture），Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，
China）
Abstract：Seeds were extracted from mature fruits and undeveloped seeds were cultured in vitro and
mature seeds were sowed in field. Seedlings with 2–3 true leaves after germination were analyzed by
flow cytometry to screen polyploids，and simple sequence repeat（SSR） markers were used to characterize
the genetic origin of these polyploids. The results showed that a total of 44 tetraploid seedlings were

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obtained from all studied diploid genotypes，i.e. 6，1，3，12，3，6，2，1 and 10 seedlings from Early Gold
sweet orange，Cutter Valencia，Tarocco blood orange，Sunburst mandarin，Ortanique tangor，Murcott
tangor，Huanong Bendizao tangerine，Zhuhongju tangerine and Flame grapefruit respectively. A total of 8
triploid seedlings were obtained from all studied diploid genotypes，i.e. 1，1，2，4 seedlings from Early
Gold sweet orange，Tarocco blood orange，Itabori sweet orange and Ortanique tangor respectively. The
genetic origin of polyploids obtaining by embryo rescue were determined by 13 SSR markers，and the
results showed that the regenerated triploid plants of Early Gold and Itabori sweet oranges were
allotriploid and that of Tarocco blood orange and Ortanique tangor maybe were autotriploid. The
regenerated tetraploid plants of Early Gold sweet orange and Ortanique tangor maybe were autotetraploid
and those of Tarocco blood orange were allotetraploid. SSR analysis validated that the band profiles of
tetraploids derived from other eight diploid cultivars were identical to their diploid maternal line. These
exploited natural polyploids hold great value for both citrus seedless breeding and basic research.
Key words：Citrus；polyploidy；SSR（Simple Sequence Repeat）

柑橘许多优良地方品种果实有籽，甚至多籽，影响其商品价值（邓秀新 等，1996）。三倍体由
于减数分裂异常，不能形成正常的配子，而柑橘又具有单性结实特性，从而可产生无籽或少籽果实
（Lee，1988；王子成和李忠爱，2007）。因此，三倍体作为天然的无籽类型被育种家和消费者所青
睐。柑橘三倍体可以通过二倍体自然挖掘、二倍体与四倍体倍性杂交、胚乳培养等方法获得。而挖
掘自然发生的三倍体可以有效缩短育种周期，避免了培育四倍体的过程；也避免了胚乳培养移栽成
活困难，与砧木嫁接亲和性差等问题。伴随胚抢救与流式细胞仪倍性检测技术的应用，柑橘自然发
生的三倍体、四倍体、五倍体、六倍体和八倍体均已有报道，其中三倍体和四倍体较普遍。Esen 和
Soost（1971）从二倍体后代获得三倍体再生植株；Oiyama 和 Kobayashi（1991）从二倍体后代的小
种籽中获得了三倍体和五倍体；Usman 等（2006）采用胚抢救技术有效获得金柑、橘、甜橙和葡萄
柚类等自然发生的三倍体；天然三倍体品种塔希提莱檬已被大面积栽培推广，且表现出良好的丰产
性（Hasnain et al.，2003）；Aleza 等（2010b）经过十多年的杂交工作已从二倍体杂交组合中获得超
过 4 000 株系的三倍体，且从中获得三倍体‘Garbi’和‘Safor’橘品种，并在西班牙作为良好的中
熟和晚熟品种栽培（Aleza et al.，2010a；Cuenca et al.，2010）。中国研究者也从二倍体后代的小种
籽中获得三倍体（陈力耕和胡运权，1981；高峰，1988；向素琼和梁国鲁，2003）。研究表明，二倍
体柑橘品种间杂交或自然授粉后获得的三倍体大多来自小粒种子（Esen & Soost，1971）。
无融合生殖是一种自然发生的生殖方式，普遍存在于柑橘属及其近缘属植物中(洪棋斌 等，
2001）。自然条件下，珠心细胞自发加倍的现象在多胚性柑橘品种中普遍发生。自首次报道自然发生
的四倍体金豆（Fortunella hindsii）以来，众多学者也开展了发掘柑橘天然四倍体的工作（Ollitrault et
al.，2008）。Allario 等（2011）从柠檬实生后代的群体获得同源四倍体柠檬；Aleza 等（2011）从不
同地域、不同品种实生后代获得大量柑橘四倍体；洪柳等（2005）从椪柑中发掘获得了同源四倍体。
至今，在金柑属（Fortunella）、枳属（Poncirus）和柑橘属（Citrus）的实生苗后代中均有四倍体发
生的报道。
过去对柑橘多倍体的鉴定主要依赖于传统的形态学与细胞学方法，对于大规模的多倍体筛选，
形态学的不可靠性，染色体制片过程的复杂性等显然不能满足对大规模群体的快速鉴定。近年来，
胚抢救与流式细胞术的快速发展与应用，使得从大规模二倍体群体中快速鉴定获得多倍体得以实现。
鉴于自然多倍体挖掘的有效性，本研究中结合胚抢救技术与流式细胞仪倍性检测技术，从 10 个二倍
体柑橘接穗品种实生后代中发掘多倍体新种质，以期为柑橘多倍体育种奠定材料基础。
3 期 梁武军等：柑橘 10 个品种实生后代多倍体的发掘及 SSR 鉴定 411

1 材料与方法
1.1 供试材料
早金甜橙[Citrus sinensis（L.）Osbeck]、卡特夏橙[C. sinensis（L.）Osbeck]、塔罗科血橙（C. sinensis
Osbeck）、Itabori甜橙[C. sinensis（L.）Osbeck.]、日辉橘[C. reticulata Blanco ×（C. paradisi Macf. ×
Citrus reticulata）]、Ortanique橘橙（C. reticulata × C. sinensis）、默科特橘橙（C. reticulata × C. sinensis）、
华农本地早橘（C. reticulata Blanco）、朱红橘（C. reticulata Blanco）、Flame葡萄柚（C. paradisi）等
10个品种均栽植于华中农业大学种质资源圃，多数品种是多胚类型，华农本地早橘品种是单多胚混
合类型。
1.2 离体和露地播种
2012 年秋季分别采摘 10 个柑橘品种的成熟果实，剥取种籽，将种籽分为饱籽、瘪籽和小种籽
（大小为饱种籽的 1/3 ~ 1/6）。小种籽和瘪籽用 1 mol · L-1 NaOH 浸泡 10 min 后，剥去外种皮，再
用 3% ~ 5% NaClO 灭菌 15 min，无菌水清洗 3 ~ 5 次，播种于 MT 培养基，整个过程在无菌条件下
操作。最后置于光照培养室中培养。培养条件：温度（25 ± 2）℃，光照强度 1 500 lx，光照时间
16 h · d-1。饱籽先用沙藏保存，第 2 年春天露地播种。播种时将土壤疏松整平，用铲子挖 2 ~ 4 cm
的穴沟，浇足水，将种子撒播于穴沟内，覆 1 ~ 2 cm 细土后覆膜。
1.3 流式细胞仪鉴定
由瘪籽和小种籽经胚抢救获得的再生植株长出 2 ~ 3 片真叶时，取其叶片用流式细胞仪快速鉴
定其倍性（张俊娥 等，2003）。露地播种的饱满种籽萌发长到 3 ~ 5 片真叶时，首先根据多倍体的
特征进行形态初选，采集似多倍体的植株叶片，用流式细胞仪检测倍性。将获得的多倍体植株移入
营养钵，温室保存。多倍体发生率（%）= 流式细胞仪鉴定获得的三倍体和四倍体植株数/检测植株
数 × 100。四倍体发生率（%）= 流式细胞仪鉴定获得的四倍体植株数/群体植株总数 × 100。
1.4 利用 SSR 分子标记鉴定父本来源
基因组 DNA 提取参照程运江等（2001）的方法，用 NanoDroP1000 紫外分光光度计（Thermo
Scientific，USA）检测 DNA 浓度和质量，然后用 TE 缓冲液将 DNA 原液浓度稀释到 50 ~ 100 ng · μL-1，
置于–40 ℃冰箱保存备用。
SSR 引物来自 Xu 等（2013），由上海 Sangon 公司合成（部分引物见表 1）。扩增反应在 PTC-200
PCR 仪（MJ. Research Inc.）上进行。扩增程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火
30 s，72 ℃延伸 40 s，32 个循环；72 ℃延伸 10 min；最后 4 ℃保存。扩增产物经 95 ℃加热变性 10
min 后，在恒定功率 80 W 条件下，6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳约 1 h 后银染。

表 1 部分 SSR 引物序列
Table 1 Sequence of part of SSR primers
引物代号 Primer code 正向引物 F-primer 反向引物 R-prime
Ma3-96 ATCATTTCAACAAGGGACGG TCGCCAATCAAACAACAAAA
Ma3-120 GCTCGCAAACACTCTCTGAA CAAGAAAGGGCAAGAAAACG
Ma3-2 CGCACTTGAAACGCCTAATA TCTGCATCACAGTCGTAGCA
Ma3-143 AATTTGTTGCTGTGCTTCCC GATCTGGGTTGGATCCTTGA
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2 结果与分析
2.1 流式细胞仪倍性鉴定结果
经胚抢救培养，从早金甜橙、塔罗科血橙、
Itabori 甜橙、日辉橘、Ortanique 橘橙和 Flame
葡萄柚等 7 个品种的瘪籽和小种籽成功地获得
再生植株。
用流式细胞仪对其倍性检测（图 1），表明
分别获得早金甜橙、塔罗科血橙、Itabori 甜橙
和 Ortanique 橘橙的三倍体 1、1、2、4 个株系；
早金甜橙、塔罗科血橙、日辉橘、Ortanique 橘
橙、Flame 葡萄柚的四倍体 1、3、2、1、4 个
株系（图 2）。
对 7 个品种多倍体群体发生率统计表明，
Ortanique 橘橙的多倍体发生率最高，为 1.95%；
默科特橘橙则没有获得多倍体（表 2）。


图 2 柑橘多倍体的发掘流程
A：饱种籽和小种籽；B：鉴定获得的三倍体；C：获得的多倍体群体。
Fig. 2 The procedure to obtain polyploid citrus
A：Developed and small seeds of Tarocco blood orange：B：Germinated embryos of triploid Tarocco blood orange rescued from
small seeds：C：Triploid and tetraploid plants in greenhouse.


表 2 不同二倍体品种开放性授粉后代小种籽再生植株的倍性检测
Table 2 Embryo rescue，plant regeneration and ploidy level of plants obtained
品种
Variety
检测植株数
Number of plants detected
三倍体株数
Number of 3x
四倍体株数
Number of 4x
多倍体发生率/ %
Frequency of polyploids
早金甜橙 Early Gold sweet orange 175 1 1 1.14
塔罗科血橙 Tarocco blood orange 211 1 3 1.90
Itabori 甜橙 Itabori sweet orange 118 2 0 1.70
日辉橘 Sunburst mandarin 200 0 2 1.00
Ortanique 橘橙 Ortanique tangor 256 4 1 1.95
默科特橘橙 Murcott tangor 200 0 0 0
Flame 葡萄柚 Flame grapefruit 230 0 4 1.74

图 1 塔罗科血橙二倍体及其三倍体的流式细胞仪倍性检测
Fig. 1 Tarocco blood orange diploid and triploid ploidy
level analysis by flow cytometry
3 期 梁武军等：柑橘 10 个品种实生后代多倍体的发掘及 SSR 鉴定 413

对早金甜橙、日辉橘、Ortanique 橘橙、默科特橘橙、Flame 葡萄柚、华农本地早橘、朱红橘和
卡特夏橙 8 个品种通过形态学初选，分别获得似四倍体的植株 12、15、5、37、8、10、4、3 株；用
流式细胞仪对其进行鉴定，最终分别获得 8 个品种的四倍体 5、10、2、6、6、2、1、1 株（表 3）；
早金甜橙、卡特夏橙和朱红橘的四倍体发生率最高，均为 1.00%；Ortanique 橘橙四倍体发生率最低，
仅 0.05%（表 3）。

表 3 不同二倍体品种开放性授粉后代饱满种籽实生群体四倍体的检测
Table 3 Plant regeneration and tetraploid plants obtained
品种
Variety
群体株数
Population
形态鉴定似四倍体
的株数
Putative tetraploids
四倍体株数
Number of
tetraploids
四倍体发生率/ %
Frequency of
tetraploids
早金甜橙 Early Gold sweet orange 500 12 5 1.00
日辉橘 Sunburst mandarin 3 000 15 10 0.33
Ortanique 橘橙 Ortanique tangor 4 000 5 2 0.05
默科特橘橙 Murcott tangor 3 000 37 6 0.20
Flame 葡萄柚 Flame grapefruit 2 000 8 6 0.30
华农本地早橘 Huanong Bendizao tangerine 1 000 10 2 0.20
朱红橘 Zhuhongju tangerine 100 4 1 1.00
卡特夏橙 Cutter Valencia 100 3 1 1.00

2.2 SSR 分子标记鉴定结果
从 50 对引物中筛选出 13 对多态性引物对胚抢救获得的早金甜橙、塔罗科血橙、Ortanique 橘橙
和 Itabori 甜橙三倍体与四倍体植株、亲本二倍体、周围品种清江椪柑和高班柚进行 SSR 鉴定。
SSR 扩增图谱表明早金甜橙和 Itabori 甜橙的三倍体除有母本的遗传条带外，还有来自外源基因
的遗传条带（图 3，A、D）。而塔罗科血橙和 Ortanique 橘橙的三倍体与其母本二倍体的 SSR 图谱带
型完全一致（图 3，B、C）。

图 3 三倍体和四倍体的 SSR 指纹图谱
A：早金甜橙三倍体与四倍体 SSR 图谱（Ma3-2 引物）；B：塔罗科血橙三倍体与四倍体 SSR 图谱（Ma3-96 引物）；
C：Ortanique 橘橙三倍体与四倍体 SSR 图谱（Ma3-96 引物）；D：Itabori 甜橙三倍体 SSR 图谱（Ma3-2 引物）。
1：清江椪柑；2：高班柚；3：早金甜橙；4：塔罗科血橙；5：Ortanique 橘橙；6：Itabori 甜橙。
a：三倍体；b：四倍体。
Fig. 3 SSR profile of triploids and tetraploids
A：SSR profile of triploids and tetraploids of Early Gold sweet orange（Primer of Ma3-2）：B：SSR profile of triploids and tetraploids of
Tarocco blood orange（Primer of Ma3-96）：C：SSR profile of triploids and tetraploids of Ortanique tangor（Primer of Ma3-96）：
D：SSR profile of triploids Itabori sweet orange（Primer of Ma3-2）.
1：Qingjiang Ponkan；2：Gaoban pummelo；3：Early Gold sweet orange；4：Tarocco blood orange；
5：Ortanique tangor；6：Itabori sweet orange.
a：Triploid；b：Tetraploid.
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对四倍体后代的扩增图谱结果表明，早金甜橙和 Ortanique 橘橙的四倍体扩增图谱与母本二倍
体带型完全相同（图 3，A、C）；而塔罗科血橙四倍体除包含母本的遗传条带外，还有来自外源植
株 Ortanique 橘橙的条带（图 3，B）。
以对应的二倍体母本为对照，用 37 对多态性 SSR 引物对从早金甜橙、日辉橘、Ortanique 橘橙、
默科特橘橙、Flame 葡萄柚、华农本地早橘、朱红橘和卡特夏橙等 8 个品种饱籽中获得的四倍体植
株进行 SSR 鉴定。结果表明，8 个品种的四倍体与其二倍体对照的 37 对 SSR 标记的扩增图谱也完
全相同（图 4 为早金甜橙的 4 株四倍体与其亲本二倍体的 4 对 SSR 标记的扩增图谱）。



图 4 早金甜橙二倍体和四倍体的 SSR 图谱
Fig. 4 SSR profile of diploids and tetraploids of Early Gold sweet orange

3 讨论
本研究中从早金甜橙、塔罗科血橙、Itabori 甜橙和 Ortanique 橘橙等 4 个二倍体品种实生后代获
得了三倍体再生植株。这些三倍体可直接用于柑橘无核品种的选育，也可利用其三倍体花粉的低育
性培育柑橘单倍体（Germana & Chiancone，2001）。同时也从早金甜橙、卡特夏橙、塔罗科血橙、
Itabori 甜橙、日辉橘、Ortanique 橘橙、默科特橘橙、华农本地早橘、朱红橘、Flame 葡萄柚等 9 个
品种中获得了四倍体，为未来柑橘三倍体无核育种奠定了种质基础（Jaskani et al.，2007：Aleza et al.，
2012）。
本研究中从早金甜橙、塔罗科血橙、Ortanique 橘橙、Itabori 甜橙 4 个品种中获得的三倍体植株
均来自小种籽的胚抢救培养。对于从二倍体柑橘小种籽中获得三倍体这一现象，已有研究表明，这
些三倍体小种籽由未经减数的雌配子（2n）与经减数了的雄配子（n）受精产生，其小种籽中胚和胚
乳倍性比（3x︰5x = 0.6）小于正常的二倍体种籽倍性比（2x︰3x = 0.67），从而导致了小种籽的早熟
和小籽化，且有文献报道柑橘未减数配子通常由第二次减数分裂异常导致（Esen & Soost，1971；
Fatta Del Bosco et al.，2007；Chen et al.，2008；Ollitrault et al.，2008；Vardi et al.，2008）。采用 13
对多态性 SSR 引物对早金甜橙和 Itabori 甜橙三倍体后代的来源鉴定表明，这些三倍体除有母本的遗
传物质外，还有来自外源的遗传物质，推测其可能是母本产生的 2n 雌配子与周围柑橘品种正常雄配
子结合产生的异源三倍体。而塔罗科血橙和 Ortanique 橘橙三倍体后代扩增图谱与其对应母本二倍
体的扩增图谱完全相同，推测其可能由母本产生的2n雌配子与自身n雄配子受精形成的同源三倍体。
但对于同源多倍体的鉴定，后期还需筛选定位于柑橘 9 条染色体上更多的多态性引物对其鉴定。
采用 37 对多态性 SSR 引物对由饱满种籽获得的四倍体植株来源进行鉴定，结果表明这些四倍
3 期 梁武军等：柑橘 10 个品种实生后代多倍体的发掘及 SSR 鉴定 415

体带型与其相应二倍体母本带型完全相同。由于本研究选取的 8 个接穗品种均为多胚或单多胚混合
类型，若其四倍体是来自杂交起源的异源四倍体，要使 37 对 SSR 引物分析的带型均一致，为小概
率事件，很难发生。因此，从 8 个品种获得的四倍体植株应是珠心细胞自然加倍形成的同源四倍体。
与二倍体相比，柑橘多倍体表现出一定的优越性，即更高的杂合性，可提高远缘杂交的亲和性；
基因组加倍潜在地提高了其对环境的适应性（Ollitrault et al.，2008；Dong & Adams，2011）。本研
究获得的三倍体、四倍体新种质，不仅为柑橘多倍体的相关基础与应用研究提供了良好的种质材料，
而且可能从中培育出有潜力的品质优良的无核柑橘新品种。
4 结论
通过胚抢救与流式细胞仪倍性检测技术，获得了早金甜橙、卡特夏橙、塔罗科血橙、Itabori 甜
橙、日辉橘、Ortanique 橘橙、默科特橘橙、华农本地早橘、朱红橘、Flame 葡萄柚等 10 个柑橘品种
的三倍体、四倍体新种质，为柑橘倍性育种奠定了种质基础。

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