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Genetic Studies and Molecular Markers Screening of Apple Resistance to Glomerella Leaf Spot

苹果对炭疽菌叶枯病抗性遗传的研究及其分子标记筛选



全 文 :园艺学报,2015,42 (11):2105–2112.
Acta Horticulturae Sinica
doi:10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0288;http://www. ahs. ac. cn 2105
收稿日期:2015–07–09;修回日期:2015–11–16
基金项目:国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目(CARS-28-01-07);山东省科技发展计划项目(2014GNC110017);山东省良
种产业化工程项目(620902);‘十二五’农村领域国家科技计划项目(2013BAD02B01)
* 通信作者 Author for correspondence(E-mail:hydai@qau.edu.cn;Tel:0532-86080008)
苹果对炭疽菌叶枯病抗性遗传的研究及其分子
标记筛选
刘源霞 1,2,李保华 3,王彩虹 2,刘春晓 2,孔祥华 2,祝 军 2,戴洪义 2,*
(1 湖南农业大学园艺园林学院,长沙 410128;2 青岛农业大学园艺学院,青岛市园艺植物遗传改良与育种重点实验
室,山东青岛 266109;3青岛农业大学农学与植物保护学院,山东青岛 266109)
摘 要:利用两个对炭疽菌叶枯病高抗的苹果品种(系)‘富士’和‘QF-2’及两个高感品种‘金
冠’和‘嘎拉’为亲本配制了 4 个杂交群体‘富士’ב金冠’,‘金冠’ב富士’,‘嘎拉’ב富士’,
‘富士’בQF-2’。以 F1 群体植株为试验材料,对苹果炭疽菌叶枯病的抗性进行鉴定评价和遗传分析。
结果表明,4 个群体中抗、感植株的分离比分别符合 1︰1,1︰1,0︰1 和 1︰0 的理论比值,初步推测苹果
抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制,抗病基因型为 rr,感病基因型为RR和Rr。以‘金冠’ב富士’F1
群体为试材,采用分离群体分组分析(BSA)方法,通过对均匀覆盖苹果染色体组的 500 对 SSR 引物的
筛选,获得了一个与抗病性状相关的分子标记 S0506206-243bp,该标记与抗性基因位点的连锁距离为 9.8 cM。
关键词:苹果;炭疽菌叶枯病;抗性遗传;SSR 标记
中图分类号:S 661.1 文献标志码:A 文章编号:0513-353X(2015)11-2105-08

Genetic Studies and Molecular Markers Screening of Apple Resistance to
Glomerella Leaf Spot
LIU Yuan-xia1,2,LI Bao-hua3,WANG Cai-hong2,LIU Chun-xiao2,KONG Xiang-hua2,ZHU Jun2,
and DAI Hong-yi2,*
(1Horticulture & Landscape College,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2Qingdao Key Laboratory
of Genetic Improvement and Breeding in Horticultural Plants,College of Horticulture,Qingdao Agricultural University,
Qingdao,Shandong 266109,China;3College of Agronomy and Crop Protection,Qingdao Agricultural University,Qingdao,
Shandong 266109,China)
Abstract:Genetic study of apple resistance to Glomerella Leaf Spot(GLS)were carried out by using
4 F1 hybrid groups(‘Fuji’בGolden Delicious’,‘Golden Delicious’בFuji’,‘Gala’בFuji’and
‘Fuji’בQF-2’)generated from two highly resistant variety or selection,‘Fuji’and‘QF-2’,and two
highly susceptible varieties‘Golden Delicious’and‘Gala’. The results showed that the separation ratio
of resistant plants to the susceptible ones in 4 F1 hybrid groups were statistically consistent with the
theoretical ratios of 1︰1,1︰1,1︰0 and 0︰1. By comprehensive analysis,the conclusions could be drawn
as the follows:The apple resistance to GLS may controlled by a single recessive gene. The genotype of the
resistant plants was rr,while the genotypes of the susceptible ones were RR and Rr. Using‘Golden

Liu Yuan-xia,Li Bao-hua,Wang Cai-hong,Liu Chun-xiao,Kong Xiang-hua,Zhu Jun,Dai Hong-yi.
Genetic studies and molecular markers screening of apple resistance to glomerella leaf spot.
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Delicious’בFuji’F1 hybrid groups and the Bulked Segregation Analysis(BSA)method,the marker
S0506206-243bp associated with disease resistance character to GLS were identified through screening
500 SSR primers covering the whole apple genome evenly,and the genetic distance between the marker
and the resistant gene to GLS was 9.8 cM.
Key words:apple;Glomerella leaf spot;inheritance of resistance;SSR marker

苹果炭疽菌叶枯病(Glomerella Leaf Spot,GLS)是近几年在中国苹果产区新出现的流行性病害,
主要危害苹果叶片,造成病叶早期干枯、脱落,也侵染果实引起坏死性斑点。该病首次在巴西被报
道,1988 年在巴西巴拿马州‘嘎拉’和‘金冠’苹果上发现了一种新型叶斑病,经鉴定其病原为围
小丛壳 Glomerella cingulate(Leite et al.,1988;González & Sutton,1999;González,2003),为盘
长孢状刺盘孢 Colletotrichum gloeosporioides 的有性态,定名为围小丛壳叶斑病(Glomerella leaf spot,
GLS),在中国被称为炭疽菌叶枯病。1997—1999 年在巴西 6 个苹果产区均发现此病,由于易感病
品种‘嘎拉’在巴西广泛种植,导致该病成为巴西苹果的主要病害(Crusius et al.,2002;Velho et al.,
2013)。1998 年在美国发现该病害(González & Sutton,1999;González,2003)。经进一步鉴定认
为引起炭疽菌叶枯病的病原分别属于尖孢刺盘孢 C. acutatum 和围小丛壳 G. cingulata(González et
al.,2006),这两种菌分别归属于尖孢刺盘孢复合群和盘长孢状刺盘孢复合群(王薇 等,2015)。2011
年中国江苏丰县、安徽砀山、淮北等地栽培的‘嘎拉’、‘金冠’等苹果品种大面积发生叶斑病,经
鉴定该病为苹果炭疽菌叶枯病,病原为围小丛壳 G.cingulata(宋清 等,2012;Wang et al.,2012)。
经王薇等(2015)进一步研究,明确了在中国引起该病害的病原为果生刺盘孢(Colletotrichum
fructicola)和隐秘刺盘孢(C. aenigma),均归属于盘长孢状刺盘孢复合群,刺盘孢属分类学专家 Arx
(1957)将果生刺盘孢 C. fructicola 作为盘长孢状刺盘孢的异名。中国是否存在尖孢刺盘孢复合群
的病原,还没有明确的结论。
在山东莱阳、江苏丰县、安徽砀山等地调查及本研究的室内接种鉴定均发现,不同苹果品种对
炭疽菌叶枯病的抗性存在显著差异。‘金冠’、‘嘎拉’、‘秦冠’和‘乔纳金’等为高感品种,‘富士’
和‘红星’等为高抗品种,尤其是‘富士’在田间自然环境下几近免疫。该结论与 Becker 等(2000)、
王薇等(2015)报道的结果相吻合。培育和种植抗病品种是防控植物病害的重要途径之一。研究苹
果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律,筛选对炭疽菌叶枯病抗性基因的分子标记,对苹果抗病分子育
种有着极其重要的意义。本研究中采用两个高抗苹果炭疽菌叶枯病品种(系)‘富士’和‘QF-2’(‘秦
冠’ב富士’杂交后代中的高抗品系);两个高感病品种‘金冠’和‘嘎拉’作亲本配制了 4 个杂
交群体,采用室内人工接种的方法对 F1 单株进行了苹果炭疽菌叶枯病的抗性鉴定。采用 BSA(Bulked
Segregation Analysis,分离群体分组分析)法和 SSR(Simple Sequence Repeats,简单重复序列)分
子标记相结合的手段筛选抗性标记,以期揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律,发掘与抗性基因
紧密连锁的分子标记,为开展苹果抗炭疽菌叶枯病分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试材料
选择青岛农业大学苹果试验基地(山东省胶州市)2009—2014 年种植的 4 个杂交组合的 F1 群
刘源霞,李保华,王彩虹,刘春晓,孔祥华,祝 军,戴洪义.
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体及 4 个亲本作为室内人工接种鉴定的试验材料。4 个群体分别是:‘金冠’ב富士’F1 代 207 株,
‘富士’ב金冠’F1 代 95 株,‘嘎拉’ב富士’F1 代 262 株,‘富士’בQF-2’F1 代 198 株。
‘金冠’ב富士’群体还用于苹果炭疽菌叶枯病抗性基因分子标记研究。
1.1.2 供试病菌
室内人工接种采用的病菌取自山东省莱西市南墅镇上庄村的‘嘎拉’苹果炭疽菌叶枯病病叶。
经鉴定病原为围小丛壳 G. cingulata(Wang et al.,2012)。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种的培养及悬浮孢子液的配制
将病叶在 25 ℃室内保湿培养 3 d,病叶上产生分生孢子,挑取单孢,获得纯培养菌株,在 5 ℃
冰箱中保存。接种前将保存的菌种转接到 PDA 培养基中,25 ℃活化,待菌落长满培养皿的 2/3 时,
用接种环刮除气生菌丝,25 ℃继续培养 2 ~ 3 d,至培养基中长出橘黄色分生孢子角。
用接种环挑取适量分生孢子角,放入盛有无菌蒸馏水的烧杯中摇匀,用血球计数板检测孢子悬
浮液浓度,调至 104 个 · mL-1,备用。孢子悬浮液现配现用,放置时间不超过 1 h。
1.2.2 样品采集及室内抗病性鉴定
从供试苹果树上剪取一年生健壮的新梢,每个材料取 4 个枝条(2 个用于接种鉴定,2 个用作
对照),剪除枝条两端,保留顶部 4 个完全展开的叶片。
用 0.6%的次氯酸钠对叶片表面消毒,然后用无菌水冲洗,沥干,用小型喷雾器将摇匀后的分生
孢子悬浮液均匀喷洒到叶片正反两面,至叶片刚刚开始流水为止。将接种及喷有无菌蒸馏水的枝条
(对照)均匀分插到两个孔穴盘上,置于装有适量蒸馏水的泡沫箱内,加盖密封保湿,置于 25 ℃
恒温培养箱内暗培养。4 d 后进行抗性鉴定和数据记录,将叶片上无病斑的定为“抗病”,记为(R),
把有病斑的定为“感病”,记为(S)。卡方检验采用 SPSS 13.0 软件进行分析。
鉴于该病尚无有效防治措施,为防止病原传播,本研究中未进行田间接种鉴定。
1.2.3 DNA 的提取与抗感 DNA 池的构建
随机选取‘金冠’ב富士’F1 群体中经过抗性鉴定的 96 个单株,每株取嫩叶 0.2 g,–70 ℃
保存。参考田义轲等(2003)的方法提取、纯化基因组 DNA,并将 DNA 浓度稀释到 4 ng · µL-1。
根据该组合群体的离体接种鉴定结果,按 BSA 分析方法的要求,选取 10 份高抗单株的 DNA
等量混合构建 DNA 抗池;选取 10 份高感单株的 DNA 等量混合构建 DNA 感池。
1.2.4 SSR 分子标记筛选与连锁分析
对均匀分布于苹果 17 对染色体上的 500 对 SSR 引物进行筛选,其中包括已发表的 300 对 SSR
引物,以及根据苹果基因组序列自行设计的 200 对 SSR 引物。
SSR 反应体系为 15 µL,内含 4 ng · µL-1 基因组 DNA 2 µL,1 × Master Mix 7.5 µL,0.2 µmol · L-1
左右引物各 0.8 µL。PCR 扩增程序为:94 ℃预变性 5 min,然后按 94 ℃变性 30 s,54 ℃退火 40 s,
72 ℃延伸 30 s 的程序进行 35 个循环,最后 72 ℃延伸 8 min,4 ℃保存。PCR 产物使用 3.5%的琼脂
糖凝胶电泳检验。
对检测群体中各单株的 SSR 标记基因型分别赋值并记录,与抗池带型相同的记为“A”,与感
池带型相同的记为“B”。将表型抗性鉴定结果与标记基因型数据相结合,采用 Mapmaker 3.0 软件
计算标记与抗性基因间的遗传距离。
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表 1 不同苹果品种(系)对炭疽菌叶枯病抗性的室内接种鉴定
Table 1 Indoor inoculation assessment of resistance of different
apple varieties or strains to GLS
亲本
Parents
叶片平均病斑数
The average number of disease spot
抗病性
Disease resistance
富士 Fuji 0 抗病 Resistant
QF-2 0 抗病 Resistant
金冠 Gold Delicious 21.1 感病 Susceptible
秦冠 Qinguan 22.8 感病 Susceptible
嘎拉 Gala 22.4 感病 Susceptible
2 结果与分析
2.1 不同苹果品种(系)对炭疽菌叶枯病的抗性表现
通过室内人工接种对 5 个品种(系)进行
抗性鉴定(表 1),可以看出:‘富士’和‘QF-2’
的叶片无病斑,表现为对炭疽菌叶枯病的高抗
性;‘金冠’、‘嘎拉’和‘秦冠’的叶片均有病
斑,且病斑数均在 20 个以上,表现出对炭疽菌
叶枯病极易感染性。室内接种鉴定结果(图 1)
与在砀山等发病区田间抗性调查结果(图 2)
相一致,说明不同品种(系)对苹果炭疽菌叶
枯病的抗性差异明显,遗传性对苹果炭疽菌叶枯病的抗性起着主导作用,同时也证实了上述品种可
以作为苹果炭疽菌叶枯病遗传规律研究的典型材料。








图 1 室内接种 4 d 后对炭疽菌叶枯病的抗性表现
Fig. 1 The resistance performance of 5 apple varieties to GLS after inoculating four days













图 2 不同苹果品种对炭疽菌叶枯病抗性的田间表现
左图为树干上嫁接富士(B)的嘎拉(A);右图为树干上部嫁接富士(B)的秦冠(C)。
Fig. 2 Resistance performance of the different apple varieties to GLS in the field
Left picture is Gala(A)and Fuji(B)grafted on the top of Gala;Right picture is Qinguan(C)and Fuji(B)grafted on the top of Qinguan.
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2.2 不同苹果杂交组合 F1 对炭疽菌叶枯病抗性表现及抗性遗传规律
‘金冠’ב富士’组合 F1 代群体共调查 207 株,其中抗病株 93 株,感病株为 114 株,经适合
性检验,卡方值为 1.07;‘富士’ב金冠’组合 F1 代群体共调查 95 株,其中抗病株为 40 株,感病
株为 55 株,卡方值为 1.20(表 2)。二者卡方值均小于 χ20.05 = 3.84,说明样本的抗与感的表型比值
符合 1︰1 的理论分离比,初步判断该试验组合中苹果对炭疽菌叶枯病的抗性由单基因控制。经计算
‘金冠’ב富士’组合正反交之间抗感差异的卡方值为 0.21(< χ20.05 = 3.84),二者没有显著性差
异,说明苹果抗炭疽菌叶枯病为细胞核遗传,不受胞质遗传物质影响,即不存在母性遗传效应。
‘嘎拉’ב富士’杂交后代中共调查了 262 株,出现了 4 株抗病单株,经适合性检验,P 值为
0.12,大于 0.05,无显著性差异,符合 0︰1 的理论比值,说明该杂交后代抗病对感病呈隐性单基因
遗传;‘富士’בQF-2’杂交后代群体中共调查了 198 株,出现 3 株感病植株,P 值为 0.25,符合
1︰0 的理论比值(表 2),说明该杂交后代抗病性受单基因控制。
综合上述研究结果,可以认为苹果对炭疽菌叶枯病的抗性由隐性单基因控制。

表 2 不同杂交组合 F1 代对苹果炭疽菌叶枯病的抗性表现
Table 2 The performance of resistance to GLS among F1 generation derived from different apple crosses
株数 Plants 杂交组合
Cross combination 总株数
Total plants
抗病
Resistant
感病
Susceptible
抗感比
Ratio of
R to S
抗感期望比值
Expected ratio
of R to S
χ2 P
金冠 × 富士 Gold Delicious × Fuji 207 93 114 0.82︰1 1︰1 1.07 0.30
富士 × 金冠 Fuji × Gold Delicious 95 40 55 0.73︰1 1︰1 1.20 0.27
嘎拉 × 富士 Gala × Fuji 262 4 258 0.02︰1 0︰1 – 0.12
富士 × QF-2 Fuji × QF-2 198 195 3 65︰1 1︰0 – 0.25

2.3 ‘金冠’ב富士’F1 代个体抗感比的 SSR 验证及抗性基因的分子标记
从 500 对 SSR 引物中初步筛选出在‘金冠’ב富士’F1 代 DNA 抗感池间呈多态性的引物 67
对。将初选 67 对引物同时在抗感池及抗感亲本间进行多态性复选,结果只筛选出 1 对引物
(S0506206)可以清晰区分抗感双亲和抗感池 DNA,其扩增多态性片段大小为 243 bp。
在 96 株‘金冠’ב富士’杂交 F1 代个体中进行引物 S0506206 的标记基因型分析,结果显示
44 株感病植株出现 243 bp DNA 片段,52 株抗病植株无此片段,部分单株检测结果见图 3。经适合
性分析,卡方值为 0.33(< χ20.05 = 3.84),符合 1︰1 的理论分离比,与表型调查和分析结果一致。
将表型鉴定数据与分子标记数据相结合,利用 Mapmaker 3.0 软件进行连锁分析,SSR 分子标记
S0506206 与苹果炭疽菌叶枯病抗性基因相连锁,其遗传距离为 9.8 cM。


图 3 SSR 标记 S0506206 在金冠 × 富士 F1 代群体部分单株中的检测结果
M:2 000 marker;B1:抗病池;F:富士;B2:感病池;G:金冠;R1 ~ R9:抗病单株;S1 ~ S10:感病单株。箭头所示为特异扩增带。
Fig. 3 Identified results of SSR marker S0506206 in part plants of Golden Delicious × Fuji F1 generation
M:2 000 marker;B1:Resistant bulk;F:Fuji;B2:Susceptible bulk;G:Golden Delicious;R1–R9:Resistant plants;
S1–S10:Susceptible plants. Arrow indicated the specific amplified band.
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2.4 苹果不同杂交组合的亲本及后代对炭疽菌叶枯病抗性的基因型推测
综合分析不同杂交组合的亲本及后代对苹果炭疽菌叶枯病抗性的表型性状和分子标记鉴定的结
果,可以假设本试验群体中,对苹果炭疽菌叶枯病的抗病植株基因型为 rr,感病植株为 RR 或 Rr,
并由此推测出供试亲本品种(系)‘富士’、‘金冠’、‘嘎拉’、‘QF-2’的基因型分别为 rr、Rr、RR
和 rr,‘秦冠’为 Rr(图 4)。



图 4 亲本和杂交 F1 单株的基因型推测
Fig. 4 Speculated genotypes of parents and their F1 plants
3 讨论
病害的发生是寄主与病原菌在一定环境条件下相互作用的结果。所以接种条件和病原菌的致病
性对寄主的抗性鉴定结果有着重要的影响。本试验所采用的接种方法和试验条件是根据 Wang 等
(2015)所得出的试验结论进行的,采用适宜的孢子浓度和温度、湿度,使寄主与病原菌的互作关
系得到充分体现。所用的病原菌是从‘嘎拉’感病叶片上采集、分离、纯化的,对‘嘎拉’、‘金冠’、
‘秦冠’等具有强致病性,保证了鉴定结果的可靠性。
目前对于苹果炭疽菌叶枯病的一些报道还仅限于对引起病害的相关因素、病原菌的生理学、致
病机制、寄主响应及防治措施等方面的研究(Jonkers,1973;Borsboom,1974;Kender & Jonkers,
1975;González et al.,2006;Wang et al.,2012,2015;Velho et al.,2013;Leonardo & Marciel,2013;
王薇 等,2015),对于抗性遗传规律少有报道,而抗病基因分子标记及遗传定位等方面的研究尚未
见报道。
本研究中利用 4 个杂交群体的后代个体对炭疽菌叶枯病抗性表现进行了综合分析,得出苹果杂
交后代中抗炭疽菌叶枯病受隐性单基因控制的结论,这与 Dantas 等(2009)研究认为‘嘎拉’、‘富士’
等苹果品种对炭疽菌叶枯病的抗性是由一对隐性基因控制的结果相一致。本研究中认为抗病基因型
为 rr,感病基因型为 RR 或 Rr,由此推测供试杂交群体的亲本品种(系)‘富士’、‘金冠’、‘嘎拉’
和‘QF-2’的基因型分别为 rr、Rr、RR 和 rr,‘秦冠’的基因型为 Rr。由于苹果在遗传构成上高度
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杂合,又是自交不亲和植物,且杂种树童期较长,使得对苹果树抗病遗传规律的研究很难采用和借
鉴其它作物的遗传群体的创建方法,如自交,回交,侧交等手段获得 F2、BC 等分离群体。本试验
除了采用 4 个不同的杂交群体后代对炭疽菌叶枯病的抗性进行表型鉴定外,还利用筛选出的与抗病
基因连锁的 SSR 标记 S0506206 对‘金冠’ב富士’杂交后代群体的抗性进行了分子鉴定,其结果
与表型鉴定所得到的研究结论相吻合,充分证明了推论的可靠性。这一方法可以为类似果树的抗病
性遗传研究提供参考。
SSR 广泛分布于苹果基因组中,对‘金冠’苹果基因组(Velasco et al.,2010)SSR 位点的统计
显示,在 17 条染色体中存在 163 426 个 SSR 位点,平均每隔 3.22 kb 就存在 1 个 SSR 遗传位点(关
玲 等,2011)。SSR 分子标记技术具有重复性好、可靠性高、操作容易、共显性等优点,在苹果遗
传连锁图谱构建、遗传多样性检测、基因定位及分子辅助育种等方面广为应用(Goulão & Oliveira,
2001;王爱德 等,2005;Zhang et al.,2007;高华 等,2011)。本研究中利用 BSA 法和 SSR 分子
标记技术相结合的手段首次发掘到 1 个与抗苹果炭疽菌叶枯病相关联的 SSR 分子标记 S0506206,
经连锁分析,其与抗炭疽菌叶枯病基因间的遗传距离为 9.8 cM。在苹果育种实践中,为了提高选择
的精度,还需要进一步筛选遗传距离更小的新的标记。

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Malacarne G,Malnoy M,Micheletti D,Moretto M,Perazzolli M,Si-Ammour A,Vezzulli S,Zini E,Eldredge G,Fitzgerald L M,Gutin
N,Lanchbury J,Macalma T,Mitchell J T,Reid J,Wardell B,Kodira C,Chen Z,Desany B,Niazi F,Palmer M,Koepke T,Jiwan D,
Schaeffer S,Krishnan V,Wu C,Chu V T,King S T,Vick J,Tao Q,Mraz A,Stormo A,Stormo K,Bogden R,Ederle D,Stella A,
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