全 文 ：园艺学报，2015，42 (11)：2113–2122.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0362；http：//www. ahs. ac. cn 2113
收稿日期：2015–07–16；修回日期：2015–09–23
基金项目：国家自然科学基金项目（31171935）；中央高校基本科研业务费项目（KYZ201310）；江苏省自然科学基金项目（BK2011639）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wsh3xg@njau.edu.cn）
苹果叶片受斑点落叶病菌侵染过程中细胞 Ca2+
定位及 MdCPK 的表达
魏萌涵，倪维晨，竹龙鸣，蔡斌华，王三红*
（南京农业大学园艺学院，南京 210095）
摘 要：以苹果感病品种‘红星’和抗病品种‘红玉’为材料，研究了苹果与斑点落叶病菌（Alternaria
alternata apple pathotype）互作过程中超微结构，细胞 Ca2+分布，以及在钙信号转导途径中具有重要作用
的钙依赖蛋白激酶基因（CDPK）的表达，探讨钙信号在苹果防御斑点落叶病菌侵染中的作用。结果表明，
在未接种状态下，叶肉细胞结构完好，叶绿体呈卵圆形沿细胞边缘排列，Ca2+主要分布在细胞间隙和液泡
中，‘红玉’细胞间隙 Ca2+密度比‘红星’大。接种斑点落叶病菌 8 h，‘红星’叶肉细胞中的 Ca2+沉淀主
要分布在胞质中，而液泡等细胞器中减少；‘红玉’的 Ca2+沉淀主要集中在胞质和筛管分子中，液泡和细
胞间隙中减少，且趋向于在细胞壁外围和液泡膜上沉积。接种 18 h，‘红星’叶肉细胞间隙 Ca2+沉淀密度
增加，而‘红玉’中的 Ca2+沉淀主要集中在叶肉细胞的胞质和液泡，以及筛管分子中。接种 24 h，‘红星’
叶肉细胞结构已发生形变，质膜发生裂解，筛管壁木质化加厚，Ca2+沉淀主要分布在液泡中；‘红玉’叶
片细胞结构完好，Ca2+沉淀主要分布在液泡和胞质中。接种 36 h，‘红星’叶肉细胞受到菌丝入侵，结构
和形态遭到破坏，在未受损叶肉细胞中 Ca2+沉淀主要集中在液泡中，在受损的细胞中 Ca2+沉淀无序地散
布在受损细胞周围及细胞间隙；此时‘红玉’叶肉细胞中 Ca2+沉淀主要集中在胞质和液泡中，并且能够
保持 Ca2+动态平衡。在接种后不同阶段，‘红星’和‘红玉’叶片中 MdCPKs 基因呈现不同的表达特点：
大多 MdCPKs 在‘红玉’中的表达量在 24 h 达到最高值；‘红星’中在 36 h 达到表达峰值，且表达量也
比‘红玉’中低得多。上述结果表明，钙信号响应斑点落叶病菌侵染，在抗病苹果品种‘红玉’中，Ca2+
内流是细胞质 Ca2+上升的主要来源；在感病品种‘红星’中，细胞器 Ca2+释放是细胞质 Ca2+的主要来源。
‘红玉’苹果 MdCPKs 基因响应病菌侵染比‘红星’苹果早而且强烈。
关键词：苹果；斑点落叶病菌；钙离子定位；钙依赖蛋白激酶（CDPK）
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）11-2113-10

Ca2+ Redistribution and Expression of MdCPK in Apple Leaves Infected by
Alternaria alternata Apple Pathotype
WEI Meng-han，NI Wei-chen，ZHU Long-ming，CAI Bin-hua，and WANG San-hong*
（College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）
Abstract：To investigate the function of calcium signal of apple trees during defense process in
response to Alternaria alternata apple pathotype（A. alternata AP），this study analyzed the leaf cell

Wei Meng-han，Ni Wei-chen，Zhu Long-ming，Cai Bin-hua，Wang San-hong.
Ca2+ redistribution and expression of MdCPK in apple leaves infected by Alternaria alternata apple pathotype.
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ultra-structure，distribution change of calcium and relative expression of MdCPKs during the plant-
pathogen interaction period. The susceptible and resistant cultivars to A. alternata AP，Red Delicious and
Jonathan apple were used as materials. The variation of Ca2+ subcellular localization and relative
expression of MdCPKs in leaves were detected by transmission electron microscope and qRT-PCR analysis
when leaves were attacked by A. alternata AP. The results were as follows：The cell structure of Red
Delicious and Jonathan remained intact and calcium antimonate deposits localized mainly in the vacuoles
and intercellular spaces of the mesophyll cells under the resting conditions，while the density of calcium
precipitation in intercellular spaces is higher in Jonathan than that in Red Delicious. Calcium gathered in
the cytoplasms and remarkable reduced in the vacuoles in Red Delicious，while it not only gathered in the
cytoplasms but also in the sieve tubes in Jonathan，declined in the vacuoles and intercellular spaces，and
tended to locate in the outside of the cell wall and vacuole membrane when leaves were inoculated with A.
alternata AP at 8 hpi（hours post inoculation）. Calcium in the leaf cells of Red Delicious tended to move
from the cells to the intercellular spaces at 18 hpi，while a large number of calcium localized in the
cytoplasms，vacuoles and sieve tubes in Jonathan at this time. When inoculated A. alternata AP at 24 hpi，
the cell structure of Red Delicious had been distorted，plasmalemma were broken and sieve tube wall was
lignified，and calcium mainly localized in the cytoplasms，while the cell structure of Jonathan still kept
integrity and calcium localized in the vacuoles and cytoplasms. Some cells in Red Delicious were invaded
by hyphae at 36 hpi. Calcium deposits mainly localized in the vacuoles in the undamaged cells，and
distributed in intercellular spaces disorderly around the damaged cells，however，the calcium level kept
dynamic homeostasis in the leaf cells of Jonathan at this time. The relative expression of MdCPKs in Red
Delicious and Jonathan showed different characters during the different stages of A. alternata AP infection.
Most MdCPKs reached to the highest expression level at 24 hpi in Jonathan while that delayed at 36 hpi in
Red Delicious，and the relative expression of MdCPKs in Jonathan were higher than in Red Delicious. The
results indicated that calcium signal involved in the response of apple to A. alternata AP infection. The
increasing of cytoplasm calcium in Jonathan and in Red Delicious mainly resulted from the inflow of
extracellular spaces and the release of organelle respectively when they attacked by A. alternata AP.
Moreover，MdCPKs in Jonathan responded to the infection earlier and more intensely than they did in Red
Delicious.
Key words：apple；Alternaria alternata apple pathotype；localization of calcium；Calcium-Dependent
Protein Kinase（CDPK）

苹果斑点落叶病最早发现于美国（Roberts，1924），是由链格孢苹果专化型（Alternaria alternata
apple pathotype）引起的一种真菌性病害，主要危害叶片，造成早期落叶，严重影响苹果产量和品质，
是目前中国苹果主产区的主要病害之一（胡同乐 等，2006）。目前关于苹果抗斑点落叶病机理的研
究报道很少。钙信号是植物重要的第二信使，参与许多环境和激素等刺激做出的应答反应（Allen et
al.，2001），在植物抗病防御反应中具有重要调控作用，是病原菌侵入植物细胞后产生抗病反应的早
期信号之一（Dangl et al.，1996）。在正常情况下，胞质 Ca2+浓度维持在较低水平，胞内 Ca2+主要贮
存在液泡、细胞核、内质网、叶绿体和线粒体等“钙库”中；当细胞受到刺激时，胞外 Ca2+通过细
胞膜上的钙通道进入胞内，使胞质 Ca2+浓度大幅度增加，产生钙信号，引起早期防御反应，而 Ca2+
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通道阻断剂或螯合剂可以阻止这一过程（关春蕾 等，2007）。胞内 Ca2+的变化可激活下游各类胞质
自由钙离子响应原件并传递下去。在植物中有 4 种 Ca2+结合蛋白：钙依赖蛋白激酶（CDPK）、钙调
素（CaM）、类钙调素蛋白（CMLs）以及钙调磷酸脂酶 B 类蛋白（CBL）（McCormack & Braam，
2003）。其中，CaM、CML 和 CBL 因缺少效应器，只能起传递钙信号的作用，其活性主要通过与互
作蛋白的相互作用进行调控（Luan et al.，2002）；而 CDPK 不仅含有 Ca2+结合位点，还含有效应器
结构，使得 CDPK 不仅能传递钙信号，还受 Ca2+的直接调控，在复杂的信号转导途径中起着重要作
用（Hrabak et al.，2003）。有大量研究表明 CDPK 广泛参与植物逆境胁迫等过程中钙信号的转导过
程（Romeis et al.，2001；Boudsocq & Sheen，2013），但细胞钙信号系统对病原菌侵染响应与植物
的抗病性之间的关系还不十分清楚。苹果叶片细胞内、外 Ca2+水平和分布的动态变化是否与品种抗
病性的差异有关，目前尚未见该方面研究报道。探讨不同抗性苹果受斑点落叶病菌侵染叶片细胞中
Ca2+的定位，以及信号通路中重要基因表达的变化，对阐明钙信号在苹果抗斑点落叶病中的调控机
理有着重要的意义。
1 材料与方法
1.1 植物材料及其接种
以嫁接于八棱海棠砧木的盆栽 2 年生抗斑点落叶病苹果品种‘红玉’和感病品种‘红星’（Abe
et al.，2010）为试验材料，2014 年 5 月于南京农业大学园艺学院果树生物技术实验室试验基地取长
势相同的一年生枝条第 4、5 片幼叶供病菌接种。
供试苹果斑点落叶病菌（A. alternata AP）由西北农林科技大学郭云忠教授提供。菌株接种在马
铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（购自北京奥博星生物技术有限责任公司）中。在 26 ℃培养箱中
培养 1 周，用直径 5 mm 的打孔器取下菌饼。苹果叶片用无菌水冲洗干净，吸干水分，将菌饼正面
无伤定点接种于苹果幼叶下表皮的主叶脉两侧，每侧各 3 个接种点。将接种叶片置于培养箱中，光
照强度 4 000 lx，12 h 光照/12 h 黑暗，25 ℃保湿培养。
1.2 Ca2+的亚细胞定位
Ca2+的细胞化学定位参照张红和简令成（1994）的方法。分别于接种后 0、8、18、24 和 36 h
取样，用于 Ca2+定位分析。将接种部位的叶片切成 1 mm × 2 mm 的小块，投入用 2%焦锑酸钾（pH
7.6，用 0.1 mol · L-1 pH 7.1 磷酸缓冲液配制）配制的 2.5%的戊二醛固定液中，抽真空后于 4 ℃固定，
过夜。用含 2%焦锑酸钾的磷酸缓冲液洗涤 3 次，每次 30 min；然后在 1%锇酸磷酸缓冲液（pH 7.6）
中固定 2 h；再用蒸馏水洗涤 3 次，每次 30 min。依次用 30%、40%、50%、70%、80%、90%和 100%
乙醇脱水，每次 15 min，再用 100%丙酮脱水 2 次，每次 30 min。Epon812 环氧树脂包埋，在 37、
45 和 60 ℃下分别聚合 12、12 和 24 h，最后在 LKB-8800 型超薄切片机上切片，经 1.5%醋酸双氧
铀—柠檬酸铅双重染色，于 JEM-1230 型透射电镜下进行钙的细胞化学和超微结构观察并拍照。
对照切片的处理：在电镜下确定某切片中已有电子致密的沉淀物后，将载有该切片的铜网漂浮
在 100 mmol · L-1 的 EGTA（pH 8.0）溶液中，60 ℃处理 1 h，使 Ca2+与 EGTA 螯合，洗脱，再置于
透射电镜下观察并拍照，若电子致密物为 Ca2+沉淀，处理后该处将留下空白点。
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1.3 RNA 的提取及 MdCPK 表达分析
叶片在接种 0、8、18、24、36 和 72 h 分别取样，去除菌饼，用蒸馏水冲洗干净，迅速将其投
入液氮中，每个处理重复 3 次，用于分析 MdCPKs 的表达量变化。叶片总 RNA 的提取采用改良 CTAB
法（蔡斌华 等，2009）。用 PrimerScript® reagent Kit 试剂盒（TaKaRa 公司，日本）将 RNA 反转录
为 cDNA。以拟南芥受真菌激发子诱导的 AtCPK1（AT5G04870.1）氨基酸序列在苹果的基因组序列
中进行比对，筛选序列相似性较高的 MdCPKs 基因 MdCPK1a（76.28%）、MdCPK1b（71.70%）、
MdCPK2（57.94%）、MdCPK4（54.61%）、MdCPK20b（62.93%）和 MdCPK26a（61.88%）用于分
析。以 Tubulin（AJ421411）作为内参基因（Zhang et al.，2014），用 Beacon Designer 7 设计特异性
引物（表 1）。实时荧光定量 PCR 在 ABI7300 上进行，反应程序按照宝生物 SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ
试剂盒说明书要求进行，反应程序为：95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 20 s；60 ℃退火 20 s；72 ℃
延伸 40 s，40 个循环。设置 3 次重复。数据分析采用 ABI7300system 软件和 2-∆∆Ct 法（Livak &
Schmittgen，2001）。结果采用 SPSS17.0 软件及 Excel 2007 进行数据处理及作图，差异显著性分析
采用 Duncan’s 新复极差法。
表 1 试验中所用的引物及序列
Table 1 Sequence of the primers in the experiment
引物序列 Primer sequence（5′→3′） 基因名称
Gene name
基因 ID
Gene ID 正向 Forward 反向 Reverse
MdCPK1a MDP0000153100 GACTCGCTGGTTCGGTGTTAC CCTCCTCACATCCTCCACATCC
MdCPK1b MDP0000142687 AGAAACCGAGCCAAAGCAATCC ACCGAACCAGCCTGAAGTCC
MdCPK2 MDP0000232344 GACTATTGTTCAACGGAGAG AGTTCGTCTTGAGTGATGTA
MdCPK4 MDP0000232885 CGACACGCCTTCCGATGAC TCCGCTTCAGGTCCATAAATCTTG
MdCPK20b MDP0000513005 AGAATGTGATGTTTGGAGTG TTCAATAAGACAAGGCCATG
MdCPK26a MDP0000297184 ACCACTCCCAGTCCAGTTTG GGGACTTATGAGGGGTGGAT
Mdtubulin AJ421411 AGGATGCTACAGCCGATGAG GCCGAAGAACTGACGAGAATC
2 结果与分析
2.1 苹果叶片接种斑点落叶病菌后细胞超微结构的变化
电镜观察结果（图 1）表明，‘红星’和‘红玉’叶片在接种斑点落叶病菌前细胞结构完好，叶绿
体清晰可见，呈卵圆形沿细胞边缘排列，其表面双层膜结构完整，内含物丰富，类囊体多；内部基
粒片层和基质片层丰富（图 1，a ~ d）。接种未超过 18 h，叶肉细胞的细胞结构无明显变化，而维管
细胞的筛管壁发生不同程度的木质化（图 1，f、h、i、l 白色箭头所示）。接种 24 h，‘红星’叶肉细
胞的细胞结构已发生形变，质膜发生裂解，叶绿体膨大，基粒片层变得疏松（图 1，m），筛管分子
的木质化程度加重（图 1，n）；‘红玉’叶肉细胞结构完整，叶绿体等细胞器排列有序，膜结构完整，
叶绿体内分布有少量嗜锇颗粒（图 1，o、p）。接种 36 h，可观察到菌丝侵入‘红星’和‘红玉’叶
片细胞中，其中，‘红星’叶肉细胞结构遭到破坏，受损严重的细胞发生细胞壁分解，质膜和液泡膜
等破裂、叶绿体变形，叶绿体外被膜发生解体，基粒片层断裂、降解，叶绿体内分布着较多的小颗
粒状物质（图 1，q），较轻的发生质壁分离（图 1，r 椭圆所示）、叶绿体膨大；‘红玉’叶肉细胞结
构基本完整，细胞壁加厚，但叶绿体等细胞器也发生不同程度的裂解，叶绿体基粒片层交错散落（图
1，s）。
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图 1 ‘红星’和‘红玉’苹果幼叶接种斑点落叶病菌后胞内钙离子分布情况
Ch：叶绿体；Is：细胞间隙；X：木质部导管；H：菌丝；V：液泡；M：线粒体；N：细胞核；CC：伴胞；
SE：筛分子；ER：内质网；CW：细胞壁；PL：细胞膜；Os：嗜锇颗粒。下同。
Fig. 1 Ca2+ distribution in apple mesophyll cells of Red Delicious and Jonathan apples inoculated with A. alternata AP
Ch：Chloroplast；Is：Intercellular space；X：Xylem vessels；H：Hypha；V：Vacuole；M：Mitochondria；
N：Nucleus；CC：Companion cell；SE：Sieve element；ER：Endoplasmic reticulum；CW：Cell wall；
PL：Plasmalemma；Os：Osmiophilic granules. The same below.
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2.2 苹果叶片接种斑点落叶病菌后细胞内 Ca2+的变化
电镜观察结果表明，在没有接种苹果斑点落叶病菌时，‘红星’和‘红玉’叶肉细胞形态以及
胞内 Ca2+分布相似，Ca2+主要分布在细胞间隙和液泡、叶绿体等细胞器中（图 1，b）；‘红玉’叶肉
细胞的细胞间隙 Ca2+沉淀的分布密度高于‘红星’，此时‘红玉’筛管分子中 Ca2+沉淀颗粒很少（图
1，c）。
接种 8 h，‘红星’和‘红玉’胞内 Ca2+分布发生明显变化，胞质中 Ca2+沉淀颗粒增多（图 1，
e ~ h）。不同的是，‘红星’叶肉细胞液泡等细胞器中的 Ca2+沉淀密度降低（图 1，e），在维管细胞
中观察不到 Ca2+沉淀（图 1，f）；‘红玉’细胞间隙和液泡中的 Ca2+沉淀密度有所下降（图 1，g），
且 Ca2+趋向于细胞壁外围和液泡膜上沉积（图 1，g 黑色箭头所示），维管细胞的筛管分子中也有大
量 Ca2+沉淀出现（图 1，h）。
接种 18 h，‘红星’叶肉细胞间隙 Ca2+沉淀密度增加（图 1，j），液泡中的 Ca2+密度有所下降，
在维管束细胞中仍然观察不到 Ca2+沉淀颗粒（图 1，i）；‘红玉’叶肉细胞 Ca2+沉淀主要集中在胞质
和液泡（图 1，k），以及维管细胞的筛管分子中（图 1，l）。
接种 24 h，‘红星’叶片细胞的 Ca2+沉淀主要分布在液泡中，细胞间隙和胞质中很少，而‘红玉’
叶片细胞 Ca2+沉淀颗粒主要分布在液泡和胞质中，但胞质中 Ca2+的沉淀密度有所下降（图 1，o、p）。
接种 36 h，‘红星’叶片中，质膜和内膜结构相对完整的细胞 Ca2+主要分布在液泡中，但结构
受损的细胞 Ca2+从胞内外流，在受损细胞间隙和周围有大量 Ca2+颗粒沉淀（图 1，q）；而‘红玉’
叶片细胞 Ca2+主要集中在液泡中，细胞壁上也发现有很多 Ca2+沉淀颗粒（图 1，t 黑色箭头所示）。
对照切片的处理：将已经确定有电子致密沉淀物的切片经 EGTA 处理后，如图 2，a1、a2 箭头
所示，在原来有沉淀物的区域处变成透明，说明了切片中 Ca2+定位的真实性。


图 2 Ca2+定位的真实性检测
a1：未用 EGTA 处理的切片；a2：用 EGTA 处理的对照切片。
Fig. 2 The authenticity detection of Ca2+ localization
a1：Untreatment with EGTA；a2：Treatment with EGTA.

2.3 接种斑点落叶病菌后苹果叶片 MdCPK 基因的表达变化
在叶片接种苹果斑点落叶病菌后，所分析的 MdCPKs 基因在‘红玉’品种中大多在 24 h 时相对
表达量达到最高值（图 3）：MdCPK1a、MdCPK1b 和 MdCPK26a 在病菌侵染初期（18 h 前）表达量
变化不大，甚至略显下调趋势，24 h 达到表达峰值，其表达量比侵染前上调 3 ~ 8 倍，此后呈下调
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表达，72 h 表达量最低；MdCPK4 和 MdCPK20b 在接种 8 h 时，就呈上调表达，在侵染 24 h 上调到
峰值，而 MdCPK2 在 18 h 达到峰值，与侵染前相比上调接近 120 倍（图 3）。所分析的大多数 MdCPKs
基因（MdCPK1a、MdCPK4 和 MdCPK26a）在‘红星’中先被诱导下调表达，然后诱导上调表达，
在 36 h 达到表达峰值，随后下调；MdCPK1b 在侵染的过程中一直下调表达，而 MdCPK20b 呈上调
表达（除了侵染 24 h 与对照无差异外）；MdCPK2 在侵染 18 h 时达到峰值，随后呈现下调表达。从
结果分析来看，‘红星’MdCPKs 基因对斑点落叶病菌侵染响应时间比‘红玉’滞后，而且表达量也
低得多。

图 3 ‘红星’和‘红玉’幼叶接种斑点落叶病后 MdCPKs 相对表达量的变化情况
图中竖线表示标准误。不同小写字母表示不同处理时间在相同品种中差异显著（P < 0.05）。
Fig. 3 The relative expression of MdCPKs in the leaves of Red Delicious and Jonathan apples inoculated with A. alternata AP
Vertical line means the standard error. Different small letters mean significant difference at P < 0.05 level
in different inoculation time of the same cultivar.
3 讨论
3.1 病菌侵染不同抗性苹果叶片细胞中 Ca2+分布的动态变化
钙信号在果树的抗逆反应中起着重要的作用，通过参与偶联细胞信号和胞内生理生化反应调控
果树对外界环境的反应。已有大量研究表明，在逆境条件下，植物体通过改变细胞质基质中 Ca2+的
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浓度，将产生的钙信号传递，并实现其功能（Jian et al.，2004）。在本研究中，未接种苹果斑点落叶
病菌时，‘红星’和‘红玉’苹果叶片细胞中的焦锑酸钙沉淀颗粒主要分布在细胞间隙和胞内“钙库”，
如液泡、叶绿体等细胞器中，二者主要差异表现为‘红玉’叶肉细胞间隙 Ca2+沉淀密度比‘红星’
大。接种病原菌后，‘红星’与‘红玉’叶肉细胞质 Ca2+沉淀密度都比接种前增加，然而在‘红星’
中，液泡 Ca2+沉淀密度下降明显，且 Ca2+沉淀趋于液泡膜和叶绿体膜附近，推测胞内“钙库”释放
是胞质 Ca2+增加的主要来源；在‘红玉’中细胞间隙 Ca2+下降显著，且在短时间内就可以观察到大
量的 Ca2+沉淀聚集在细胞质中，从而推测胞外 Ca2+内流是‘红玉’叶肉胞质 Ca2+增加的主要来源。
在一些互作体系中已证明，Ca2+内流形成的钙信号与植保素合成有一定关系，也是诱导防卫反应的
重要条件（Kurosaki et al.，1987；关春蕾 等，2007）。因而，可能是由于胞外 Ca2+内流，刺激了寄
主产生一系列防御反应，如植保素的合成等，从而使‘红玉’表现出比‘红星’更高的抗病能力。
但‘红星’和‘红玉’对斑点落叶病抗性的差异是否由于钙信号下游植保素合成水平不同造成还有
待进一步证实。
Ca2+内流主要通过质膜特定的钙通道由 ATP 提供能量逆电化学梯度将其转运入细胞质，Ca2+释
放则是通过液泡等细胞器内膜上三磷酸肌醇（IP3）激活的Ca2+释放通道，环腺苷二磷酸核糖（cADPR）
激活的 Ca2+释放通道和 Ca2+诱导的 Ca2+释放通道释放到细胞质中（Toyoda et al.，1992；Vandelle et
al.，2006），因而植物细胞质膜和内膜结构的完整是保证 Ca2+运输和完成信号传递的必要条件。在
试验中发现，‘红星’叶片在斑点落叶病菌侵染 24 h 后，叶片细胞的结构发生改变，叶绿体膨大，
36 h 发生质壁分离，甚至膜系统破损，由此造成 Ca2+通道失去功能，Ca2+不能运回液泡恢复静息态
水平，破坏和扰乱了细胞正常的生理和功能。‘红玉’叶片在侵染 24 h，液泡 Ca2+沉淀密度增大，
Ca2+从细胞质正常向液泡移动，液泡起着“钙库”作用；侵染 36 h，在细胞壁上观察到有 Ca2+沉淀
颗粒分布，说明此时内膜和质膜结构和功能依然完好，Ca2+从细胞质运回液泡和细胞间隙，逐渐恢
复静息态水平。推测‘红星’叶片的组织结构特点（气孔大，角质层薄等），使病菌较易侵入叶肉细
胞，斑点落叶病菌 AM 毒素破坏了细胞质膜结构，导致钙信号受阻；而抗病品种‘红玉’叶片在受
到斑点落叶病菌侵染早期，细胞质膜未受到破坏，受病菌刺激，钙信号响应迅速且强烈，激发了下
游的一系列抗病防御反应。
3.2 苹果 CDPKs 参与对斑点落叶病的抗性调控
植物响应不同的外界刺激后，产生的钙信号被不同的钙感受器及响应元件识别，再由一些钙传
感蛋白将钙信号向下游进一步级联放大、传递，激活下游早期响应基因的表达和离子通道的活性，
从而产生特异性抗逆响应（Lee & Rudd，2002；McAinsh & Pittman，2009）。CDPKs 就是这一类钙
传感蛋白，它含有 4 个 EF 手型结构用于结合 Ca2+，在静息条件下，CDPK 的自我抑制结构域与激
酶域互作而抑制其激酶活性，受外界环境刺激促使胞质 Ca2+浓度上升，Ca2+与 CDPK 的结构域结合
导致构象变化，激活 CDPK 的激酶活性，促发蛋白磷酸化，使钙信号放大，调控植物信号转导途径
中下游基因的表达。CDPK 可通过调控不同信号途径，参与病原菌的响应，启动防御反应。Kobayashi
等（2007）发现马铃薯 StCDPK4和 StCDPK5通过磷酸化作用可以直接激活呼吸爆发氧化酶（StRboh），
从而参与调节活性氧（ROS）信号通路。在拟南芥上研究发现，AtCPK1 受真菌激发子诱导表达，
超表达 AtCPK1 能促进水杨酸（SA）的合成，从而通过调节 SA 信号通路来调节植物的抗病性，使
植物对病原菌产生广谱抗性（Coca & San Segundo，2010）。在本研究中分析了苹果基因组与 AtCPK1
同源的 6 个 MdCPKs 基因对斑点落叶病菌侵染的响应，结果表明，它们都受斑点落叶病菌的诱导，
在感病、抗病苹果品种间 MdCPKs 基因呈现表达时间和表达强度的差异，证实了 MdCPKs 基因参与
魏萌涵，倪维晨，竹龙鸣，蔡斌华，王三红.
苹果叶片受斑点落叶病菌侵染过程中细胞 Ca2+定位及 MdCPK 的表达.
园艺学报，2015，42 (11)：2113–2122. 2121

苹果与斑点落叶病菌的互作，其响应时间和表达强度可能影响苹果对斑点落叶病菌的抗性，具体机
理还有待进一步研究。
在所分析的 MdCPKs 中，MdCPK2 基因在抗病品种‘红玉’中强烈受斑点落叶病菌诱导，且远
远高于在感病品种‘红星’中的表达，推测 MdCPK2 是苹果防御反应中的重要调控基因。通过进一
步分析，发现烟草 NtCDPK2 与 MdCPK2 相似性高于其它几个 MdCPKs 基因。超表达的 NtCDPK2
通过激活 JA 和 ET 相关基因的表达，从而参与 JA/ET 调控的信号通路（Ludwig et al.，2005）；病毒
诱导的 NtCDPK2 基因沉默阻碍了小种专化型病菌引起的过敏性反应，降低了植物的抗病性（Romeis
et al.，2001）。有研究发现，JA/ET 介导的信号途径参与寄主对腐生型病原菌和食草昆虫的抗性，SA
介导的信号途径参与对活体营养型病原菌的抗性（Thomma et al.，2001；Kessler & Baldwin，2002；
Glazebrook，2005）。苹果专化型斑点落叶病菌属链格孢真菌，是一种腐生型真菌，寄生于植物表面，
产生 AM 毒素对寄主造成伤害（Otani et al.，1995）。因此推测，MdCPK2 可能通过参与 JA/ET 介导
的信号通路调控苹果对斑点落叶病的抗性。
4 结论
在斑点落叶病感病和抗苹果品种叶片中，Ca2+定位及钙信号表现不同的特点。苹果受斑点落叶
病菌侵染，抗病品种‘红玉’Ca2+由细胞间隙内流是细胞质钙的主要来源，而感病品种‘红星’中
Ca2+由液泡等细胞器释放是胞质钙的主要来源。感病品种细胞膜系统比抗病品种更易于损害，由此
阻断了钙信号及其下游的防御反应。Ca2+分布的变化激活了 CDPK 的活性，在抗病品种中 CDPK 基
因响应时间比感病品种中早，且具有较高的表达水平，证实了 MdCPKs 参与调控寄主植物的抗病反
应。

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