全 文 ：园艺学报，2015，42 (1)：1–9.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0804；http：//www. ahs. ac. cn 1
苹果转CpTI基因株系花粉特性研究
师校欣 1，周瑞金 1,2，王倩倩 1，常腾飞 1，冯莎莎 1,3，杜国强 1,*
（1河北农业大学园艺学院，河北保定 071001；2河南科技学院园艺园林学院，河南新乡 453003；3 河北北方学院园
艺系，河北张家口 075000）
摘 要：转基因植物的花粉特性研究是进行遗传改良和转基因生态风险评价的一项基础工作。对 7 ~
8 年生转 CpTI 基因‘嘎拉’苹果花粉特性进行了研究，结果表明：转基因苹果花粉在大小、形态和表面
纹饰等方面与对照花粉没有明显差别；转基因苹果花粉中畸形花粉多；供试的 13 个株系中 12 个株系的
花药中花粉量显著低于对照，6 个株系的花粉离体萌发率显著降低；测定了 3 个转基因株系的花粉生活力，
其中 2 个株系显著低于对照。转基因‘嘎拉’苹果花粉人工授粉至普通‘富士’苹果柱头上能正常萌发，
但中后期花粉管伸长较慢，花粉管到达胚珠的时间比对照延后约 8 h。花器不同发育阶段内源激素测定表
明，转基因株系各时期 GA3 含量均低于对照，而 ABA 含量在花蕾期低于对照，在气球期和平展期高于对
照。对花药和花粉发育过程显微观察发现，转基因株系花药的结构及其发育正常，而花粉囊壁绒毡层的
延迟分解影响了花粉发育可能是其花粉数量少、育性低的原因。
关键词：苹果；外源基因；花粉；育性；绒毡层
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）01-0001-09

Characteristics of Pollen from Transgenic Lines of Apple Carrying
Exogenous CpTI Gene
SHI Xiao-xin1，ZHOU Rui-jin1,2，WANG Qian-qian1，CHANG Teng-fei1，FENG Sha-sha1,3，and DU
Guo-qiang1,*
（1College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China；2College of Landscape
Architecture，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang，Henan 453003，China；3Department of Horticulture，
Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China）
Abstract：It is one of the fundamental works for gene transformation and its ecosystem hazard
evaluation to study the pollen characteristics of transgenic plants. In this research，some characteristics of
pollen from seven- or eight-year-old transgenic plants of apple that carried exogenous CpTI gene were
analyzed. The results showed that no signi ficant difference was found in terms of size，morphology，and
exine ornamentation of the pollen in the transgenic plants compared to those in the non-transgenic control.
It was found that transgenic plants had more abnormal pollen grains. Of the thirteen transgenic lines
tested，12 lines had significant lower amount of pollen，and six exhibited significantly lower germination
rate when cultured in vitro. The pollen viability of three transgenic lines was determined，of which two was


收稿日期：2014–09–16；修回日期：2014–12–08
基金项目：河北省自然科学基金项目（C2012204091，C2014204115）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gdu@hebau.edu.cn）
Shi Xiao-xin，Zhou Rui-jin，Wang Qian-qian，Chang Teng-fei，Feng Sha-sha，Du Guo-qiang.
Characteristics of pollen from transgenic lines of apple carrying exogenous CpTI gene.
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significantly lower than that of the control. The transgenic Gala apple pollen grains germinated normally
via controlled pollination on Fuji apple stigma. But the pollen tubes extended relatively slow during the
middle and late developing stages，and another eight hours was needed to reach the ovules compared to the
control. The concentration of gibberellic acid of the flower from transgenic Gala apple was lower than that
of the non-transgenic control during all development stages tested. The concentration of abscisic acid in
transgenic ones was lower during the pink stage and higher during the ball stage and full open stage.
Microscopic observation of the anther structure showed no difference. The tapetum of the pollen sac wall
in transgenic plants decomposed late，and affected the pollen grain development，which could be one of the
reasons leading to the less of the pollen grain and the poor viability in transgenic plants.
Key words：apple；exogenous gene；pollen；viability；tapetum

基因漂流是转基因植物可能引起的主要生态风险之一（樊龙江 等，2001）。转基因植物的花粉
既是保证杂交成功的关键，又是有花植物基因漂移的主要散布形式（Pilcher et al.，2001；魏兴华 等，
2005），因此转基因植物的花粉特性研究是进行遗传改良和转基因生态风险评价的一项基础工作（曾
凡锁 等，2008）。Bergelson 等（1998）发现转基因拟南芥异交率增强近 20 倍。魏兴华等（2005）
选用含 bar、crylAb、BADH 和 Xa21 等 4 种基因的 5 份转基因水稻品系研究显示外源基因插入没有
改变水稻品种的异交潜力。bar 基因导入对转基因水稻花粉育性、结实率等无明显影响，说明抗性
植株没有发生雌雄配子败育（林静 等，2007）。另有研究表明，外源基因插入可能影响配子的发育，
导致外源基因不能有效地通过配子传递给后代。如 Sangtong 等（2002）在转基因玉米中发现小麦
Glu-1DX5 基因不能有效地通过花粉进行传递，造成转基因的分离异常；Limanton-Grever 和 Jullien
（2001）发现外源基因只能通过雄配子进行传递，可能是插入基因影响了雌配子的存活能力。育性
下降是转基因当代植株普遍表现出的一种现象（唐祚舜 等，2001）。Gahakwa 等（2000）在转基因
水稻的 R2 子代植株中观察到畸形花粉粒；转抗虫基因白桦（曾凡锁 等，2008）、转基因蓝猪耳（孙
姝兰，2008）、转 CBF1 基因烟草（张可菡 等，2007）、共转化 Anti-trxs 和 Bar 基因小麦（任江萍 等，
2006）、转 hPt 基因水稻（唐祚舜 等，2001）等花粉活力明显低于非转基因植株或出现花器官变异，
转查尔酮合酶基因矮牵牛甚至表现雄性不育（邵莉 等，1996）。
考虑到外源基因可能插入到影响花粉活力的基因位点上（Zhang et al.，1996），转基因植株花粉
的发芽力、花粉管伸长能力与受精能力低于相应的非转基因植株，所以一般认为转入的基因通过花
粉传递的能力小于卵细胞，因而以转基因植株作母本更有利于转基因的传递（Christou et al.，1989；
Ulian et al.，1994）。
目前，转基因农作物花粉育性及生态安全性的研究报道较多，而对于多年生果树的相关研究较
少，转豇豆胰蛋白酶抑制剂（Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI）基因苹果树花粉育性及安全性评价尚
未见报道。
CpTI 来源于加利福尼亚黑眼豆，是一种植源性的抗虫蛋白，其产物能抑制取食昆虫肠道中蛋白
酶的活力，使昆虫取食难以消化，导致昆虫缺乏营养，停止发育并最终死亡，与 Bt 毒蛋白相比更具
抗虫广谱性（徐鸿林 等，2008）。本课题组曾在 2005—2007 年连续 3 年发现转 CpTI 基因苹果花
粉萌发率较对照降低。苹果是异花授粉植物，其花粉量和花粉活力直接影响授粉条件。对转 CpTI
基因苹果花粉特性进行研究，可为转基因苹果生产中授粉树的合理配置和苹果转基因生态风险评价
提供依据。
师校欣，周瑞金，王倩倩，常腾飞，冯莎莎，杜国强.
苹果转 CpTI 基因株系花粉特性研究.
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1 材料与方法
1.1 材料
转 CpTI 基因‘嘎拉’苹果（Malus × domestica‘Gala’）的 13 个株系和非转基因‘嘎拉’和‘富
士’的组培苗，经生根、移栽，2004 年定植于河北农业大学园艺学院标本园内。于 2011 年气球期
采摘转基因植株不同株系和对照植株的花朵，室内脱药、除杂、干燥散粉后，用于分析。
1.2 试验设计与方法
1.2.1 转基因株系花粉粒结构电子显微镜观察
将室温干燥后的花粉粒均匀涂抹于粘有双面胶的样台上，真空喷镀，在 KYKY-2800B 型扫描电
镜下观察花粉的形态及外壁纹饰特点，取有代表性的花粉粒调查赤道轴和极轴长。
1.2.2 转基因植株单花药花粉数量测定
取 20 个饱满花药放入 1.5 mL 离心管中，25 ℃下散粉，滴入 1 mL 偏磷酸钠溶液，加盖振荡。
吸取数滴悬浮花粉液至血球计数板，显微镜下观察。每一花药中的花粉量 =（每格花粉数 × 10 × 25 ×
1 000）/20。每一试材重复 6 次，取平均值。
1.2.3 转基因植株花粉离体萌发率与生活力测定
配制含 100 g · L-1 蔗糖、10 g · L-1 琼脂及 0.1 g · L-1 硼酸的培养基，在载玻片 1 cm 大小的培养基
液滴上播种花粉，25 ℃保湿培养 12 h 后显微镜观察。每株系花粉重复 3 个载玻片，每载玻片观察 3
个视野，统计总花粉数与发芽的花粉数，计算花粉的萌发率。
取适量花粉于载玻片上，滴 1 ~ 2 滴 TTC 溶液，盖片，40 ℃下放置 20 min，显微镜观察，染成
红色的为具有生活力的花粉。每片观察 6 个视野，计算花粉活力百分比。
1.2.4 转基因植株花粉萌发动态观察
以转基因‘嘎拉’为父本，普通‘富士’为母本（对照为非转基因‘嘎拉’与‘富士’）人工授
粉，分别于授粉后 2、4、6、8、12、16、24、32、40、48 和 60 h 各采花 20 朵，雌蕊 FAA 液固定，
8 mol · L-1 KOH 软化子房 8 ~ 12 h，蒸馏水浸泡 1 h，苯胺蓝染色 4 h，轻压制片，荧光显微镜下观察。
1.2.5 转基因植株花粉形成过程的显微观察
2012 年 3 月中旬至 4 月中旬，每隔 3 d 取样，每次采约 10 个花蕾（芽）或花序，改良 FAA 液（70%
酒精︰甲醛︰冰醋酸 = 90︰5︰5）固定，酒精系列脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，显微观察照相。
1.2.6 转基因植株花朵不同开放阶段内源激素的测定
采摘‘嘎拉’苹果转基因植株和对照植株处于花蕾期、气球期和平展期的花朵，去除萼片、花
瓣，剩下雌、雄蕊，从中称取 1 ~ 3 g 加冰甲醇 30 mL 研磨，4 ℃超声波振荡 1 h，0 ~ 4 ℃过夜后过
滤溶液，残渣再加冰甲醇 20 mL，4 ℃超声波振荡 0.5 h，过滤，合并滤液减压浓缩至 10 mL，经 0.45 μm
滤膜过滤后，上清液用高效液相色谱法测定赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）含量。
2 结果与分析
2.1 转CpTI基因‘嘎拉’苹果花粉形态
扫描电镜下观察，非转基因‘嘎拉’正常花粉粒赤道面观为椭圆形，赤道轴与极轴的比值为 1.904，

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具较狭窄萌发沟，沟端在极面不汇合，外壁多清晰纵向平行条纹纹饰，也可见回旋状纹饰；转基因
‘嘎拉’花粉中畸形花粉较多，发育正常的花粉粒在大小、形态、纹饰等方面与对照基本相同，赤
道轴与极轴的比值为 1.923（图 1）。

图 1 ‘嘎拉’苹果转基因（A ~ C）与非转基因（D ~ F）花粉形态扫描电镜观察
Fig. 1 The morphology of the pollen grains from transgenic（A–C）and non-transgenic（D–F）Gala
observed under scanning electron microscope

2.2 转CpTI基因‘嘎拉’苹果的花粉数量和生活力
分别比较了 13 个转基因‘嘎拉’株系和对
照的花药中花粉粒数（表 1），除 6 号转基因株
系与对照差异不显著外，其余 12 个株系的花药
花粉量均显著低于非转基因对照，不同株系间
也有差别，最高的每个花药含有花粉粒为 6 900
粒，最低仅为 2 667 粒。
表 1 转 CpTI 基因‘嘎拉’苹果花粉量及花粉生活力
Table 1 Pollen grain quantity and viability of the transgenic
lines of Gala carrying exogenous CpTI gene
转基因株系
Transgenic
line
每个花药的花粉量
Pollen grain quantity
number per anther
萌发率/%
Germination
rate
生活力/%
Viability
1 5 200 ± 583 b 63.0 ± 5.4 ab –
2 4 200 ± 768 c 65.3 ± 5.7 ab –
3 5 125 ± 427 bc 29.1 ± 3.3 def –
4 4 000 ± 570 c 70.5 ± 6.5 a 43.6 ± 7.5 bc
5 5 100 ± 430 bc 24.5 ± 6.7 ef –
6 6 900 ± 640 ab 61.3 ± 1.3 abc –
7 4 800 ± 752 bc 71.8 ± 3.7 a 58.7 ± 2.3 ab
8 4 875 ± 1068 bc 53.9 ± 7.7 abcd –
9 2 833 ± 459 c 11.4 ± 2.1 f –
10 4 750 ± 1010 bc 32.4 ± 1.3 de 25.0 ± 3.9 c
11 3 900 ± 510 c 35.9 ± 6.4 cde –
12 5 000 ± 570 bc 52.7 ± 3.8 abcd –
13 2 667 ± 422 c 41.7 ± 1.1 bcde –
非转基因株系
Non-transgenic
plant
8 200 ± 1793 a 76.5 ± 0.5 a 69.5 ± 2.2 a
注：同列数值后不同字母表示差异达 0.05 显著水平。–：未检测。
Note：The different letters follow the value in the same column
indicate significant difference at 0.05 level. –：Not tested.
将花粉在蔗糖培养基播种后统计花粉离体
萌发率，转基因株系间差别较大（表 1），3、5、
9、10、11、13 号株系显著低于对照，其余 7
个株系与对照差异不显著。
测定了 3 个转基因株系的花粉生活力，4
号和 10 号株系显著低于对照，7 号株系与对照
差异不显著（表 1）。经花粉染色分析，4 号株
系染成红色花粉数量明显少于对照（图 2），表
明其生活力下降。
总体来看，外源基因导入对转基因植株育
性有一定影响，转基因植株的花粉数量、离体
萌发率、花粉生活力均有不同程度的下降。
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图 2 转基因‘嘎拉’苹果 4 号株系（A）与非转基因对照（B）花粉生活力观察
Fig. 2 The viability of the pollen grains from transgenic line 4（A）and
non-transgenic plant（B）Gala observed under microscope

2.3 转基因苹果花粉萌发动态
分别用 10 号转基因株系和非转基因‘嘎拉’花粉为‘富士’人工授粉后不同时间荧光制片显
微观察发现，授粉 4 h 后非转基因花粉粒在柱头上萌发伸长，6 h 左右到达花柱总长度的 1/4，8 h 到
达花柱的 2/3，12 h 接近花柱基部；40 h 进入子房并到达胚珠；转基因花粉与对照花粉初期萌发动
态无明显差异，但花粉管伸长相对较慢，在授粉 6 ~ 8 h 后其与对照花粉管到达花柱同一位置的时间
延后，到达胚珠的时间比对照延后约 8 h，这可能与其花粉生活力低有关。授粉后 60 h 非转基因和
转基因‘嘎拉’花粉管全部进入‘富士’胚珠（图 3）。
图 3 转基因‘嘎拉’花粉经人工授粉在‘富士’雌蕊中的萌发、生长状态
A ~ C 为非转基因材料（A：授粉 4 h 花粉在柱头表面萌发；B：授粉 12 h 花粉管接近花柱基部；C：授粉 40 h 花粉管进入胚珠）；
D ~ F 为转基因材料（D：授粉 4 h 花粉在柱头表面萌发；E：授粉 16 h 花粉管到达花柱基部；F：授粉 48 h 花粉管进入胚珠）。
Fig. 3 The germination and growth status of the transgenic Gala pollen in Fuji apple pistils via controlled pollination
A–C as non-transgenic control（A：Pollen grains germinated on the stigma 4 hours after pollination；B：Pollen tube reached into an ovary
12 hours after pollination；C：Pollen tube entered an ovule 40 hours after pollination）；D–F as transgenic plants
（D：Pollen grains germinated on the stigma 4 hours after pollination；E：Pollen tube reached into an ovary
16 hours after pollination；F：Pollen tube entered an ovule 48 hours after pollination）.

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2.4 转基因苹果花药和花粉发育的显微观察
为揭示转基因花粉育性降低的原因，对 10 号转基因株系花粉形成过程进行了石蜡切片显微观
察。转基因株系雄蕊原基发育良好（图 4，A1），经细胞分裂、分化，顶端膨大发育成花药，基部伸
长形成花丝（图 4，A2），幼期花药发育时，首先在 4 个对称方位细胞分裂加快，分化出孢原细胞，
进一步分化出花粉囊壁和造孢细胞（图 4，A3），花粉囊壁由表皮、纤维层、中层和绒毡层细胞组成，
造孢细胞进行分裂或直接发育为花粉母细胞（图 4，A4），再由花粉母细胞减数分裂经二分体和四分

图 4 转基因‘嘎拉’苹果花粉形成过程的显微观察
A：转基因；B：非转基因。1：雄蕊原基（SP）；2：花药（AN）和花丝（FI）分化；3：4 个花粉囊（PS）和造孢细胞（SC）发育；
4：花粉囊壁（PSW）和花粉母细胞（MMC）；5：小孢子（MS）发育；6：未成熟花粉粒（PPG）；
A7：转基因株系花粉囊壁绒毡层（TA）延迟分解；A8、B7、B8：成熟花粉囊和花粉粒（PG）。
Fig. 4 The pollen development process of transgenic Gala observed under microscope
A：Transgenic；B：Non-transgenic. 1：Stamen primordial（SP）；2：Differentiation of anther（AN）and filament（FI）；3：Differentiation of
pollen sac（PS）and sporogenous cells（SC）；4：Pollen sac wall（PSW）and microspore mother cell（MMC）；5：Microspore（MS）
development；6：Premature pollen grain（PPG）；A7：Tapetum（TA）of the pollen sac wall in the transgenic plants decomposed late；
A8，B7，B8：Matured pollen sac and pollen grain（PG）.
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体时期形成单核花粉粒（图 4，A5、A6），单核花粉粒初期细胞壁薄，核位于细胞的中央，以后不
断从解体的绒毡层细胞吸取营养和水分，细胞增大，外壁增厚，形成成熟花粉粒（图 4，A8）。绒毡
层是紧邻花粉囊壁的最内一层细胞，对花粉发育有重要作用，当单核花粉粒从四分体中释放出来后，
绒毡层细胞开始降解，并向药室释放营养物质，至花粉成熟期，绒毡层细胞完全降解。试验观察发
现，转基因‘嘎拉’花粉绒毡层有延迟降解现象（图 4，A7），影响了花粉发育，可能是其花粉数量
少、育性低于非转基因‘嘎拉’的原因。
2.5 外源基因对花器官不同开放阶段内源激素的影响
对转基因和对照‘嘎拉’不同发育阶段的花器（雄蕊和雌蕊）进行内源激素测定。如表 2 所示，
GA3 含量随花开放逐渐下降，转基因花器中从气球期到平展期下降较快，其各时期均低于非转基因
对照；而对照从花蕾期到气球期下降较快。ABA 含量随花发育呈上升趋势，转基因花在花蕾期低于
对照，在气球期和平展期高于对照。

表 2 外源 CpTI 基因对‘嘎拉’苹果花不同开放阶段内源激素含量的影响
Table 2 Effect of exogenous CpTI on content of hormones in flower during florescence in transgenic Gala
GA3/（μg · kg-1 FW） ABA/（μg · kg-1 FW） 材料
Material 花蕾期
Pink stage
气球期
Ball stage
平展期
Full open stage
花蕾期
Pink stage
气球期
Ball stage
平展期
Full open stage
转基因
Transgenic Gala
797.5 ± 17.46 779.1 ± 24.37 546.0 ± 36.03 1.0 ± 0.27 88.8 ± 6.82 94.5 ± 5.77
非转基因
Non-transgenic Gala
1 293.1 ± 86.58 845.2 ± 43.56 840.2 ± 40.28 31.0 ± 7.90 37.5 ± 5.07 85.1 ± 7.27
3 讨论
从理论上讲，单个基因导入受体后对受体基因组的影响较小，受体也能很快稳定。但越来越多
的研究表明，转基因当代或后代植株多个性状产生了不同程度的变异，其中生长矮小、育性降低等
比较有代表性（范树国 等，2000；崔海瑞 等，2001；任江萍 等，2006）。可能是因为 T-DNA 插
入受体基因组位点不同或外源基因的表达，影响了受体植物的代谢过程，从而使表型发生了改变
（Benedict et al.，1996）。邵莉等（1996）研究推测，转查尔酮合酶基因矮牵牛出现雄性不育现象是
由于查尔酮合酶在绒毡层细胞中表达受到抑制，从而抑制了与育性有密切关系的类黄酮的合成。还
有研究认为转基因植物的性状改变是组织培养和再生过程中的体细胞无性系变异造成的。张可菡等
（2007）对两个花器官差异较大的转基因烟草（一个同对照）植株中扩增出完全相同的 T-DNA 插
入位点的侧翼序列，且 T-DNA 插入在非编码区，说明花器官的变异不是 T-DNA 插入造成的，可能
是由植株培养过程中细胞变异引起的。基因枪法共转化的 Anti-trxs 和 Bar 基因小麦，当代植株表现
植株高度下降，育性降低，但在 T2 代得到明显回复，因此认为 T0 植株的表型异常可能是由于组培
苗较弱，移栽后适应能力差的一种暂时现象，而不是外源基因导入导致的遗传性变异（任江萍 等，
2006）。在转基因水稻中也得出类似结果（唐祚舜，2001）。
转 CpTI 基因‘嘎拉’苹果植株的花粉存在外源基因，说明外源基因有通过花粉传递的可能性
（王倩倩 等，2013）。本研究结果显示外源基因插入对‘嘎拉’花粉形态没有显著影响，但多数转
基因株系花粉数量、离体萌发率、生活力低于非转基因植株，另外花器官的 GA3 和 ABA 含量发生
了变化。Sawhney 和 Shukla（1994）指出，乙烯大量产生，ABA 含量提高以及 GA3 和细胞分裂素含

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量降低，均导致植物雄性不育。本试验中转基因花器官 GA3 含量低于对照，而 ABA 含量在蕾期后
迅速增加可能是导致其花粉萌发率低的原因之一。通过花粉粒发育过程的显微观察发现，转基因花
药初期发育正常，但单核花粉粒释放后，有绒毡层不能及时解体的现象，导致花粉粒发育受阻。花
药绒毡层是紧邻花粉囊壁的最内一层细胞，代谢活性高，含丰富的脂质、蛋白质，酶、糖类、孢粉
素等，当单核花粉粒从四分体释放出来，绒毡层细胞开始降解，为小孢子发育提供营养，至花粉成
熟期，绒毡层细胞完全降解。绒毡层细胞提前或延迟降解都会影响花粉粒的正常发育（张虹 等，
2008）。本试验中转 CpTI 基因‘嘎拉’植株是通过根癌农杆菌介导的叶盘法获得，转基因株系的这
种花粉粒的发育异常可能与外源基因导入和（或）组培变异有关。本课题组曾经对茎尖组培的‘富
士’、‘金冠’品种的花粉生活力与非组培嫁接树进行比较，二者没有显著差异，而且组培苗遗传稳
定性好，后代未发现变异（刘颖，2011）。因此推测这种花粉粒的发育异常是由于基因转化所致。
虽然苹果转基因植株花粉数量、离体萌发率、生活力等育性指标明显降低，但苹果是异花授粉
植物，只要合理配置授粉树，其育性降低对产量和品质不会有影响；从另一角度说，苹果转基因植
株育性降低，可以降低外源基因通过苹果花粉基因漂流的生态危险，利大于弊。

References
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