全 文 ：园艺学报，2015，42 (3)：435–444.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-1036；http：//www. ahs. ac. cn 435
收稿日期：2014–12–01；修回日期：2015–02–12
基金项目：中央高校基本业务费专项资金项目（XDJK2014D032，XDJK2014C024）；重庆市研究生科研创新项目（CYS14045）；国家自
然科学基金项目（31101521）；现代农业产业技术体系项目（CAR-27）；国家果树种质重庆柑桔圃项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhaoxiaochun@cric.cn）

柑橘 CHS 基因序列多态性及表达水平对类黄酮
生物合成的影响
王志彬，申晚霞，朱世平，薛 杨，赵晓春*
（中国农业科学院/西南大学柑桔研究所，国家柑桔工程技术研究中心，重庆 400712）
摘 要：查尔酮的合成是类黄酮生物合成途径中的一个关键节点。从 10 个柑橘种质中克隆了查尔酮
合成酶（chalcone synthase，CHS）基因，并对其不同时期的果实和叶片中的类黄酮含量进行了测定，分
析了 CHS 基因的序列多态性与类黄酮含量之间的关系；同时通过 qRT-PCR 检测了 CHS 基因在不同种质
之间以及同一种质的不同组织间的表达差异。结果表明，柑橘 CHS 基因的核苷酸序列高度保守，相似度
达 98%以上。聚类分析表明，CHS 氨基酸序列的多态性有物种特异性，而且与类黄酮含量有一定的相关
性。CHS 基因的表达水平在不同种质、部位及生长发育时期有显著差异，这些差异与类黄酮的含量有显
著的相关性，说明 CHS 基因对类黄酮的生物合成有明显影响。
关键词：柑橘；类黄酮；查尔酮合成酶；多态性；差异表达
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0435-10

Polymorphism and Expression of Chalcone Synthase Gene in Citrus
Related to the Flavonoids Content
WANG Zhi-bin，SHEN Wan-xia，ZHU Shi-ping，XUE Yang，and ZHAO Xiao-chun*
（Citrus Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Southwest University，National Engineering
Research Center for Citrus，Chongqing 400712，China）
Abstract：Chalcone synthase is one of the most important enzymes in flavonoids biosynthesis
pathway. In this study，the CHS genes encoding chalcone synthase were isolated from 10 citrus species.
Their expressions in different parts of plant and different time of the development were analysed by
qRT-PCR. The flavonoids content at different development stages of fruits and leaves were investigated.
The results indicated that in different citrus species，the CHS genes are very conservative with a high level
of similarity at 98%. However，polymorphism on amino acid sequence of CHS was found among different
citrus species，which demonstrated certain relationship with flavonoids content. The study reveals that
expression level of CHS genes significantly different among different species，part of plant and
development stages，indicating the CHS gene plays an important role in the biosynthesis of flavonoids in
citrus.

Wang Zhi-bin，Shen Wan-xia，Zhu Shi-ping，Xue Yang，Zhao Xiao-chun.
Polymorphism and expression of chalcone synthase gene in citrus related to the flavonoids content.
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Key words：citrus；flavonoids；chalcone synthase；polymorphism；differential expression

甜橙、酸橙、柠檬、枸橼、宽皮柑橘和葡萄柚等柑橘类植物的果实、树皮、树叶、花及根中广
泛存在类黄酮物质（叶兴乾 等，2008）。迄今为止，从柑橘中鉴定出的类黄酮超过了 60 种，包括黄
酮、黄烷酮，以及主要存在于血橙中的花青苷和主要存在于柠檬中的黄酮醇（Di Majo et al.，2005；
Tripoli et al.，2007）等，它们均具有重要的生物活性（Tarahovsky et al.，2014），如抗氧化、抗炎、
抗病毒、抗肿瘤、清除自由基和保护心脑血管等（Middleton et al.，2000；Akhlaghi & Bandy，2009）。
而且，类黄酮与植物的抗逆性密切相关，在抵抗逆境胁迫中发挥重要作用（Treutter，2006；宴校，2011）。
不同柑橘种质，以及植株的不同组织部位的类黄酮含量存在很大的差异。查尔酮是合成各种类
黄酮的基本骨架，查尔酮的合成处于类黄酮生物合成途径的上游。查尔酮合成酶（chalcone synthase，
CHS）为类黄酮合成途径中的第一个特异性酶，它催化 3 分子的丙二酰–CoA 和 1 分子的对香豆酰–
CoA 结合形成查尔酮。因此，CHS 酶催化的反应是整个类黄酮合成途径的重要限速步骤（Shih et al.，
2008；Wang et al.，2010）。第一个 CHS 基因是从紫外线辐射处理的欧芹悬浮培养细胞中分离获得的
（Reimold et al.，1983），目前已报道的 CHS 基因序列超过 4 000 条，来自 19 个科，涉及苔藓、蕨
类、裸子植物和被子植物（杨继和顾红雅，2006；李莉 等，2007；周兴文 等，2011；康亚兰 等，
2014），但在柑橘中的报道尚少，未见对其在不同柑橘种质中的等位基因数量、功能差异及基因表达
活性等的报道。
本研究拟克隆不同柑橘种质的 CHS 基因，以分析其序列在不同柑橘种质间的差异，同时分析
CHS 基因在不同种质、不同组织部位的表达水平以及类黄酮的含量，研究柑橘 CHS 基因与类黄酮
合成之间的相关性，探索类黄酮生物合成途径中关键基因的遗传调控机制，为通过遗传改良技术调
控柑橘次生代谢产物合成途径，提高类黄酮的产量奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及取样
试验材料全部来自国家果树种质（重庆）柑橘圃。2012 年对北京柠檬[Citrus limon（L.）Burm. f.
‘Meyer Lemon’]、枳柚（C. paradisi Macf. × Poncirus trifoliata L. Raf.）、宜昌橙（C. ichangensis
Swingle‘Ichang Papeda’）、塔罗科血橙[C. sinensis（L.）Osbeck‘Tarroco’]、粉红汤姆逊葡萄柚（C.
paradisi Macf.‘Pink Thompson’）、梁平柚[C. grandis（L.）Osbeck‘Liangpingyou’]、大坑野橘（C.
daoxianensis S. W. He）、澳指檬杂种（C. reticulata Blanco）、广西凭祥土柠檬（C. limonia Osbeck
‘Guangxipingxiang’）和巴西酸橙（C. aurantium L.‘Brazil Sour Orange’）10 个种质分别于 7 月、9
月和生理成熟期采集果实。2014 年 5 月 7 日，采集上述 10 个种质同一植株上成熟叶与幼叶（约 50%
伸展度）；同年 5 月 23 日、6 月 19 日、7 月 24 日、8 月 29 日、9 月 29 日和 10 月 27 日分别采集北
京柠檬的果实；6 月 19 日、7 月 24 日、8 月 29 日、9 月 29 日和 10 月 27 日分别采集塔罗科血橙的
果实。
叶片和果实的采样方法为：天气晴朗的条件下，随机选取生长健壮的植株，按东西南北 4 个方
向采取适量样品立即置于液氮中速冻，于–80 ℃下保存备用。不同组织部位的材料采集方法为：随
机选取生长健壮的植株，按东西南北 4 个方向分别取适量主根韧皮部，主茎韧皮部和幼茎韧皮部，
立即置于液氮中速冻，于–80 ℃下保存备用。
王志彬，申晚霞，朱世平，薛 杨，赵晓春.
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1.2 类黄酮含量检测
委托农业部柑橘及苗木质量监督检验测试中心（重庆），采用冉玥等（2013）报道的方法检测
圣草枸橼苷（eriocitrin）、芦丁（rutin）、芸香柚皮苷（ruenaringin）、柚皮苷（naringin）、橙皮苷
（hesperidin）、新橙皮苷（neohesperidin）、香风草苷（didymin）、柚皮素（narirutin）、橙皮素（hesperitin）、
甜橙黄酮（sinensetin）、川皮苷（nobiletin）、橘黄酮（tangeretin）等 12 种柑橘主要类黄酮的含量。
含量用 mg · g -1 FW 表示，FW（fresh weight）为鲜质量。
1.3 CHS 基因的克隆与生物信息学分析
使用植物总 RNA 抽提试剂盒（Tiangen，北京）从 10 个不同种质的幼嫩叶片中提取总 RNA，
以总 RNA 为模板，使用反转录试剂盒（Promega，北京）和 APdT 引物（表 1）经反转录获得 cDNA。
使用特异引物通过 PCR 扩增获得 cDNA 序列片段，经克隆测序拼接后得到 CHS 基因的 mRNA 的全
长序列。使用植物总 DNA 抽提试剂盒（Tiangen，北京）提取北京柠檬基因组 DNA，使用位于 ORF
两端的引物（CHSF3、CHSR3）对基因组 CHS 基因进行 PCR 扩增，获得 CHS 的基因组 DNA 片段。
PCR 反应所用的酶为 PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 高保真酶（TaKaRa，大连），所有测序由华
大基因和上海生工完成，每个序列各测 3 个重复。
利用 Vector NTI Advance 11 对 10 个种质的 CHS 基因进行序列比对；BioXM 2.6 软件推导其氨
基酸序列；在线软件 Prot Param（http：//web.expasy.org）预测编码蛋白的分子量和等电点；TMHMM
2.0 在线软件（http： //www.cbs.dtu.dk）分析跨膜结构域；SignalP Server 在线软件（http： //
www.cbs.dtu.dk）预测信号肽；PDB 预测蛋白的二级结构；使用 MEGA 软件对编码区氨基酸序列进
行聚类分析。
1.4 CHS 基因的表达量分析
以 β-actin 为内参基因，以 Wang 等（2010）报道的实时定量引物 CHSq F1 和 CHSq R1 做实时
荧光定量 PCR，分别检测 CHS 基因在 10 份不同种质的老叶和幼叶，北京柠檬 5 个不同组织、部位
以及北京柠檬和塔罗科血橙果实成熟过程中果皮中的表达情况，其中幼嫩叶片中的表达以巴西酸橙
为 1，成熟叶片以粉红汤姆逊葡萄柚为 1，北京柠檬 5 个不同组织以嫩叶为 1，塔罗科血橙和北京柠
檬不同发育时期果皮中的表达分别以 6 月 19 日果皮和 5 月 23 日果皮为 1。本试验所使用的引物的
信息见表 1。

表 1 试验中用到的引物
Table 1 Primers used in this study
引物
Primer
序列
Sequence（5′–3′）
产物长度/bp
Product size
退火温度/℃
Annealing temperature
AP dT primer* GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT
CHSq F1；CHSq R1 CGGAGATCACGGCAGTCATCT；CAGCACCATCACCGAACAAA 87 60
CHS F3；CHS R3 CCAAGCACGAGCCACAAACA；ACAAACACCGAGCACGAACC 1 240 55
CHS F4；CHS R4 GGCGTCGACATGCCCGGC；ACCGGGGTGAGCGATCCAG 479 55
CHS F5；CHS R5 ACAAGTCAATGATTAAGAAG；GCAGCAGCACCATCACCG 452 55
CHS F6；CHS R6 CTGGATCGCTCACCCCGG；GACCTTTGGGCATTTACAG 505 55
β-actin F；β-actin R CCAAGCAGCATGAAGATCAA；ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG 101 60
注：*为 cDNA 反转录第一链的接头引物。
Note：*Adaptor PolyA Primer used in reverse transcription for the synthesis of first strand of cDNA.
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2 结果与分析
2.1 不同柑橘种质中 CHS 基因的克隆与序列分析
从 10 个柑橘种质中克隆获得了 CHS 基因的 cds 序列，并提交到 GenBank（Accession Number：
KP720583 ~ 720592）。获得 1 313 bp 的 CHS 基因的 cDNA 片段，包含完整的开放阅读框（1 173 bp），
编码 391 个氨基酸。序列比对发现 10 个柑橘种质的 CHS 基因与已报道的 3 个柑橘品种的 CHS 基因
编码区核苷酸序列相似度高达 98%以上，但在 7 个核苷酸位点存在差异，并编码不同的氨基酸（表 2）。

表 2 不同柑橘种质 CHS 基因的核苷酸及其所编码的氨基酸序列的差异
Table 2 The difference on nucleotide and amino acid sequences of CHS among different citrus species
核苷酸/氨基酸差异位点/bp
The location of variable site on nucleotide/amino acid sequences 编号
Code
种质名称
Species
16 ~ 18 442 ~ 444 868 ~ 870 886 ~ 888 961 ~ 963 1012 ~ 1014 1060 ~ 1062
1 北京柠檬 C. limon（L.）Burm. f.‘Meyer Lemon’ GAG/Glu CTC/Leu CTT/Leu ACT/Asn AGG/Glu TCA/Ser GCT/Ala
2 枳柚 C. paradisi Macf. × Poncirus trifoliata L. Raf. GAG/Glu CTC/Leu CTT/Leu ACT/Asn AGG/Glu TCA/Ser GCT/Ala
3* 温州蜜柑‘国庆 4 号’
C. unshiu Marcow‘Guoqing 4’
GAG/Glu CTC/Leu CTT/ Leu ACT/ Asn AGG/ Glu CCA/Pro GCT/Ala
4 宜昌橙 C. ichangensis Swingle‘Ichang Papeda’ GAC/Asp CTC/Leu CTT/Leu ACT/Asn AGG/Glu TCA/Ser GCT/Ala
5* 柚‘冯威’C. maxima‘Fengwei’ GAG/Glu CTC/Leu GTT/Val GCT/Ser AGG/Glu TCA/Ser GCT/Ala
6 塔罗科血橙 C. sinensis（L.）Osbeck‘Tarroco’ GAG/Glu CTC/Leu GTT/Val ACT/Asn AGG/Glu TCA/Ser GCT/Ala
7 粉红汤姆逊葡萄柚
C. paradisi Macf.‘Pink Thompson’
GAG/Glu CTC/Leu GTT/Val ACT/Asn AGG/Glu TCA/Ser GCT/Ala
8 梁平柚 C. grandis（L.）Osbeck‘Liangpingyou’ GAG/Glu CTC/Leu CTT/Val ACT/Asn AGG/Glu TCA/Ser GCT/Ala
9 大坑野橘 C. daoxianensis S. W. He GAG/Glu CTC/Leu CTT/Leu ACT/Asn GGG/Gly TCA/Ser GTT/Val
10 澳指檬杂种 C. reticulata Blanco GAG/Glu ATC/Ile CTT/Leu ACT/Asn GGG/Gly TCA/Ser GTT/Val
11* 甜橙‘红宝石’C. sinensis‘Ruby’ GAG/Glu CTC/Leu GTT/Val ACT/Asn AGG/Glu TCA/Ser GCT/Ala
12 广西凭祥土柠檬
C. limonia Osbeck‘Guangxipingxiang’
GAG/Glu ATC/Ile CTT/Leu ACT/Asn GGG/Gly TCA/Ser GTT/Val
13 巴西酸橙
C. aurantium L.‘Brazil Sour Orange’
GAG/Glu ATC/Ile CTits coded
T/Leu
ACT/Asn GGG/Gly TCA/Ser GTT/Val
注：单核苷酸在 CHS 基因 cDNA 序列中所处位置从起始密码 ATG 算起；* CHS 序列来自 NCBI。黑体下划线代表突变的核苷酸，斜体
代表由核苷酸差异引起的氨基酸变化。
Note：The location of single nucleotide in CHS mRNA sequence is counted from ATG. * The CHS gene sequences are derived from NCBI. The
bold letters inunderline and italics indicate the mutation of nucleotide and corresponding amino acid，respectively.

生物信息学分析发现，柑橘查尔酮合成酶的不稳定系数介于 34.25 ~ 35.95 之间，属于相对稳定
的疏水蛋白且均无跨膜结构域和信号肽（表 3），据此推测查尔酮合成酶在游离核糖体上合成后不经
蛋白转运，直接在细胞质基质的特定部位行使催化功能。
聚类分析（图 1）显示，13 个柑橘种质（包括 3 个已报道的种质）的 CHS 基因可被聚为两大类，
梁平柚、‘冯威’柚和粉红汤姆逊葡萄柚等 3 个柚类种质有较为相近的 CHS mRNA 序列，表现出了
一定的物种特异性和遗传进化关系。
用引物 CHS F3 和 CHS R3 从北京柠檬的基因组 DNA 中克隆得到了一个长度为 1 225 bp 的 CHS
片段，其中发现了一个内含子，长度为 102 bp，与 cDNA 比对发现其剪接位点不符合 5′-GT…AG-3′
的剪接方式，因此，此柑橘 CHS 基因的内含子为非Ⅱ型剪接内含子（徐德立和赵小立，2003）。
通过 SWISS-MODEL（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk）预测了 10 个柑橘种质中查尔酮合成酶的二级
结构，发现有 4 个变异的氨基酸位点（16 ~ 18 bp、442 ~ 444 bp、961 ~ 963 bp 和 1 060 ~ 1 062 bp）
出现在 α 螺旋上，另外 3 个均不在任何结构域上；同时，在 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）
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上查找‘国庆 4 号’温州蜜柑（Wang et al.，2010）查尔酮合成酶的活性位点注释，以‘国庆 4 号’
查尔酮合成酶（GenBank：ACQ41890.1）为模板，通过逐一筛查，发现突变的位点均不分布在活性位
点上。

表 3 柑橘 13 个种质查尔酮合成酶的化学性质
Table 3 Chemical characters of CHS from 13 citrus species
编号
Code
品种名称
Species
分子量
Molecular
mass
不稳定系数
Instability
index（II）
总平均疏水指数
Grand average of
hydropathicity
理论等
电点
pI
跨膜结构域和信号肽
Transmembrane domain
and signal peptide
1 北京柠檬 C. limon（L.）Burm. f.‘Meyer Lemon’ 42 636.1 35.49 –0.098 6.28 无 No
2 枳柚 C. paradisi Macf. × Poncirus trifoliata L. Raf. 42 636.1 35.49 –0.098 6.28 无 No
3* 温州蜜柑‘国庆 4 号’
C. unshiu Marcow‘Guoqing 4’
42 646.2 35.49 –0.101 6.28 无 No
4 宜昌橙 C. ichangensis Swingle‘Ichang Papeda’ 42 622.1 35.00 –0.098 6.28 无 No
5* 柚‘冯威’C. maxima‘Fengwei’ 42 595.1 35.95 –0.091 6.28 无 No
6 塔罗科血橙 C. sinensis（L.）Osbeck‘Tarroco’ 42 622.1 35.77 –0.097 6.28 无 No
7 粉红汤姆逊葡萄柚
C. paradisi Macf.‘Pink Thompson’
42 622.1 35.77 –0.097 6.28 无 No
8 梁平柚 C. grandis（L.）Osbeck‘Liangpingyou’ 42 622.1 35.77 –0.097 6.28 无 No
9 大坑野橘 C. daoxianensis S. W. He 42 592.1 34.25 –0.084 6.47 无 No
10 澳指檬杂种 C. reticulata Blanco 42 592.1 34.25 –0.083 6.47 无 No
11* 甜橙‘红宝石’C. sinensis‘Ruby’ 42 592.1 34.25 –0.083 6.47 无 No
12 广西凭祥土柠檬
C. limonia Osbeck‘Guangxipingxiang’
42 592.1 34.25 –0.083 6.47 无 No
13 巴西酸橙 C. aurantium L.‘Brazil Sour Orange’ 42 592.1 34.25 –0.083 6.47 无 No
注：* CHS 序列来自 NCBI。
Note：* The CHS gene sequences are derived from NCBI.


图 1 基于 13 个柑橘种质的 CHS 基因 ORF 所编码蛋白的聚类分析
*为已报道的柑橘 CHS 基因。
Fig. 1 Clustering analysis of CHS from 13 citrus species
*Those citrus CHS cDNA sequences are derived from published database.

2.2 CHS 基因在北京柠檬不同组织中的表达及对类黄酮合成的影响
柠檬是果皮和果汁兼用的果品，用途极为广泛。图 2 为北京柠檬不同组织和器官中类黄酮含量
的检测结果。可以看出，不同组织和器官中的类黄酮含量差异显著，根中的类黄酮含量最低（2.74
mg · g-1 FW），嫩叶中类黄酮含量最高（11.90 mg · g-1 FW），两者相差 4.3 倍，类黄酮含量由低至高
依次为根、主茎、幼茎、幼果和嫩叶，表现出明显的组织特异性。
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Polymorphism and expression of chalcone synthase gene in citrus related to the flavonoids content.
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图 2 北京柠檬 5 个不同组织和器官中类黄酮含量
Fig. 2 Flavonoids content in different tissues and
organs of Citrus limon‘Meyer Lemon’
图 3 CHS 基因在北京柠檬不同组织和器官中的表达
Fig. 3 Expression of CHS gene in different tissues and
organs of Citrus limon‘Meyer Lemon’
qRT-PCR 检测了 CHS 基因在北京柠檬不同组织和器官中的表达水平（图 3），CHS 基因的表达
也存在明显的组织特异性，幼果中的表达水平最高，其次为嫩叶，根中的表达水平最低，除幼果外，
CHS 基因在不同组织和器官中的表达差异与类黄酮含量的变化趋势基本一致，也是由低至高依次为
根、主茎、幼茎、嫩叶。
相关性分析显示，北京柠檬 5 个不同组织和器官中的类黄酮含量与 CHS 基因的表达量之间有明
显的正相关（r = 0.63），说明 CHS 基因的表达水平是导致类黄酮含量差异的主要因素；在根、主茎、
幼茎和幼果之间 CHS 基因的表达水平与类黄酮含量之间呈现出更为显著的正相关关系（r = 0.99），
更明确地表明 CHS 基因的表达量决定了类黄酮的合成量。


2.3 CHS 基因在果皮中的表达及与类黄酮含量的关系
为了进一步明确 CHS 基因在果实生长发育过程中对类黄酮生物合成所起的作用，分别检测了北
京柠檬和塔罗科血橙在果实生长发育过程中果皮中的类黄酮含量，并通过 qRT-PCR 检测了 CHS 基
因在同一时期的表达水平。从图 4 和图 5 上可以看出，5 月 23 日（北京柠檬）和 6 月 19 日（塔罗
科血橙）的果皮中类黄酮含量最高（北京柠檬的花期早于塔罗科血橙），而且该时期 CHS 基因的表
达水平也是最高的。随着果实的进一步生长发育，北京柠檬果皮中类黄酮含量出现一个明显的下降，
在果实生长发育的中期有一个回升，随后缓慢下降。在塔罗科血橙幼果期后的果皮中类黄酮含量也
有一个明显的下降，但和北京柠檬不同的是，随后没有出现较为明显的含量升高再下降，而且在后
期的果实生长发育中含量下降不明显，到成熟后期甚至有上升的趋势，推测塔罗科血橙果实发育后
期类黄酮含量的增加可能是在这时期花青苷的合成所致。
qRT-PCR 结果显示，在北京柠檬果实成熟过程中，果皮中 CHS 基因的表达水平表现出先降低
后升高的现象（图 4），与类黄酮含量的变化趋势一致；在塔罗科血橙果实生长发育过程中，5 个不
同时期果皮中 CHS 基因的表达水平也表现出和类黄酮含量相似的变化趋势（图 5）。
相关性分析表明，北京柠檬果实发育过程中，果皮中 CHS 基因的表达与类黄酮的含量之间呈显
著正相关（r = 0.91）；同样，在塔罗科血橙果实生长发育过程中，CHS 基因的表达量也显著影响类
黄酮的含量，相关系数超过 0.99。因此，查尔酮合成酶基因的表达量能显著影响类黄酮的生物合成，
表明 CHS 对类黄酮生物合成有极为重要的作用。
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图 4 北京柠檬果实生长发育过程中果皮中的
类黄酮含量及 CHS 表达
Fig. 4 Flavonoids content and expression of CHS gene in the
peels of developing fruit of Citrus limon‘Meyer Lemon’
图 5 塔罗科血橙果实生长发育过程中果皮中的
类黄酮含量及 CHS 的表达
Fig. 5 Flavonoids content and expression of CHS gene in the
peels of developing fruit of Citrus sinensis‘Tarroco’


2.4 柑橘种质中类黄酮的含量与 CHS 基因表达之间的关系
2012 年对 10 个柑橘种质果实中类黄酮含量进行了检测（图 6），7 月份的测试样品因果实尚未
完全分化，采用全果处理，其后批次只检测果皮中类黄酮的含量。从图 6 可以看到，在 3 个不同时
期，不论是全果还是果皮样品，枳柚（2）、塔罗科血橙（6）、巴西酸橙（13）、大坑野橘（9）和
粉红汤姆逊葡萄柚（7）5 个种质的类黄酮含量始终处在较高水平（> 10 mg · g-1 FW）；而北京柠檬
（1）、广西凭祥土柠檬（12）、梁平柚（8）和宜昌橙（4）等 4 个种质始终处在较低水平（< 4.5 mg · g-1
FW）；澳指檬杂种（10）居于中间水平，10 个不同种质间类黄酮含量差异明显。


图 6 柑橘 10 个不同种质果实中类黄酮含量变化
代号 1 ~ 13 对应的种质名称详见表 2。
Fig. 6 Flavonoids content in the fruits of 10 citrus species
The code 1–13 corresponding to the name of the germplasms as shown in Table 2.

柑橘叶片也是类黄酮的主要来源（李利改 等，2013）。本研究中对不同种质叶片的 CHS 基因与
类黄酮含量之间的关系进行了分析。对 10 个种质幼叶和成熟叶中类黄酮的含量进行检测发现，与果
实中观察到的情况一样，在不同种质之间叶片中类黄酮含量也存在明显差异，并且同一种质的幼叶
中类黄酮含量明显高于成熟叶（图 7）。
CHS 基因在 10 个不同种质幼叶和成熟叶中也存在表达差异，在幼叶中 CHS 基因的表达水平均明
显高于成熟叶（图 7），说明幼嫩的叶片中查尔酮的生物合成更为活跃，使得类黄酮的含量明显比成熟
叶高。相关性分析表明，柑橘叶片中 CHS 基因的表达水平与果皮中类黄酮含量成正相关（r = 0.76）。
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图 7 柑橘 10 个种质幼叶和成熟叶中类黄酮含量和 CHS 基因的表达水平
代号 1 ~ 13 对应的种质名称详见表 2。
Fig. 7 Flavonoids content in the young leaves and mature leaves of 10 citrus species and their CHS expression
The code 1–13 corresponding to the name of the germplasms as shown in Table 2.

2.5 CHS 氨基酸位点的变异与类黄酮含量之间的关系
大坑野橘、澳指檬杂种、粉红汤姆逊葡萄柚和巴西酸橙 4 个种质叶片中的类黄酮含量明显比其
它种质中高，而且在该 4 个种质的果皮中也检测到高类黄酮含量（图 6），聚类分析（图 1）显示，
除粉红汤姆逊葡萄柚外，其余 3 个种质的 CHS 基因序列高度相似，而且这 3 个种质的 CHS 基因同
时发生了两个氨基酸位点的变异（site 5：Glu→Gly；site 7：Ala→Val），可以推测，该 3 个种质的
高类黄酮含量可能与这两个突变的氨基酸位点相关。通过生物信息学预测查尔酮合成酶的二级结构，
发现 site 5 与 site 7 均位于查尔酮合成酶二级结构的 α 螺旋上，由此推测 site 5 与 site 7 的突变可能
对查尔酮合成酶的结构产生影响，从而提高了查尔酮合成酶的活性。
3 讨论
自 1983 年 Reimold 等首次分离 CHS 基因以来，在对超过 1 000 种植物的研究中，除金鱼草的 CHS
基因（王金玲 等，2000）含有两个内含子之外，其余均只含有 1 个内含子，不同科植物之间 CHS 的
氨基酸同源性高达 80%（Lanz et al.，1991），呈现出较高的保守性。本研究中从 10 个不同柑橘种质中
克隆得到的 CHS 基因在序列上存在差异，表现出了丰富的多样性，这和其它物种中报道的情况相似，
CHS 基因在柑橘中也是高度保守的，没有发现对 CHS 酶的活性产生重大改变的等位基因，也没有发
现基本不含类黄酮的柑橘种质。10 个种质在编码区仅有少数几个核苷酸的差异，但为数不多的核苷
酸差异却导致查尔酮合成酶在 7 个氨基酸位点发生变化。虽然生物信息学分析未能表明 7 个突变的
氨基酸位点对查尔酮合成酶的功能有明确的影响，但仍有必要通过转基因技术等对其功能进行验证。
对查尔酮合成酶基因的研究有很多报道，但多集中在对花青苷和豆科植物异黄酮合成的研究
上，在柑橘中的研究鲜见报道。绝大多数的 CHS 基因组序列含有两个外显子，相比于外显子 1，外
显子 2 的长度和序列都更加保守（钟德馨 等，2013）。对两个外显子进行功能域预测发现，10 个柑橘
种质的查尔酮合成酶有差异的 7 个氨基酸位点均不在该蛋白的活性位点、产物结合位点、丙二酰辅
酶 A 结合位点以及二聚体接口等区域。但大坑野橘、澳指檬杂种和巴西酸橙的查尔酮合成酶氨基酸序
列的突变与其高类黄酮含量性状应该不是巧合，其 CHS 酶活性与类黄酮合成的关系有待进一步验证。
查尔酮的合成是类黄酮生物合成途径中一个关键点，CHS 基因的表达与类黄酮的含量呈现出了
密切的关系。Xu 等（2007）报告指出，在银杏中，CHS 基因的表达水平、酶的活性水平以及类黄
王志彬，申晚霞，朱世平，薛 杨，赵晓春.
柑橘 CHS 基因序列多态性及表达水平对类黄酮生物合成的影响.
园艺学报，2015，42 (3)：435–444. 443

酮的含量三者之间有良好的正相关关系，并且 CHS 基因的时空表达与相应的类黄酮含量之间也存在
正相关关系。马婧（2012）将金荞麦[Fagopyrum dibotrys（D. Don）Hara]CHS 基因转入烟草，发现
转基因植株上 CHS 基因的表达水平与类黄酮含量也表现出正相关关系。本研究中，柑橘的不同组织
部位以及不同的生长发育时期 CHS 基因的表达水平与类黄酮含量之间都表现出明显的正相关关系，
说明 CHS 基因在柑橘类黄酮生物合成中具有极为重要的作用。
基因的表达受诸多因子的影响，且CHS在双子叶植物中存在多基因家族的现象（Helariutta et al.，
1996；Han et al.，2006；Jiang et al.，2008）。生物信息学分析表明，克里曼丁基因组中可能有两个
CHS 家族基因（Ciclev10005133m.g 和 Ciclev10015535m.g），分别与 CitCHS1 和 CitCHS2 对应，它
们的氨基酸序列相似性为 92.07%；甜橙基因组中可能仅有 1 个 CHS（orange1.1g016330m.g），与克
里曼丁基因组中的 Ciclev10015535m.g 的氨基酸序列相似性为 99.74%，下一步将对这些基因在类黄
酮生物合成中的功能进行分析验证。

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