全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（11）：2265–2270 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–08–01；修回日期：2012–10–23
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项项目（200903018）；国家科技支撑计划项目（2012BAD02B04）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xukun@sdau.edu.cn；wutta2006@yahoo.com.cn）
离体雌核发育诱导洋葱单倍体与植株再生
刘冰江 1,2，缪 军 2，霍雨猛 2，杨妍妍 2，徐 坤 1,*，吴 雄 2,*
（1 山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018；2 山东省农业科学院蔬菜研究所，山东省设施蔬菜生物
学重点实验室，国家蔬菜改良中心山东分中心，济南 250100）
摘 要：以来自日本的 3 个中日照型洋葱（Allium cepa L.）杂交种的未开放花蕾为外植体材料，研究
了 2,4-D 和 6-BA 浓度及配比对单倍体诱导培养的影响，以建立洋葱单倍体诱导技术体系。研究结果表明，
含有 1.5 mg · L-1 2,4-D + 1.5 mg · L-1 6-BA 和 2.0 mg · L-1 2,4-D + 2.0 mg · L-1 6-BA 的 B5 培养基适于洋葱单
倍体的诱导，诱导率最高达到 4.00%。共获得了 43 枚雌核发育胚，雌核发育胚转移至不含激素的 B5 基
本培养基中即可发育成完整植株，再生植株驯化移栽成活率达到 100%。利用根尖染色体计数和流式细胞
仪鉴定有 42 株是单倍体。
关键词：洋葱；雌核发育；单倍体；流式细胞仪
中图分类号：S 633.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2012）11-2265-06

Haploid Plant Induction via in Vitro Gynogenesis and Plant Regeneration
in Onion（Allium cepa L.）
LIU Bing-jiang1,2，MIAO Jun2，HUO Yu-meng2，YANG Yan-yan2，XU Kun1,*，and WU Xiong2,*
（1College of Horticultural Sciences and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China；
2Vegetable Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory for Biology of Greenhouse
Vegetable of Shandong Province，National Improvement Center for Vegetable，Shandong Branch，Ji’nan 250100，China）
Abstract：The flower buds of three intermediate-day hybrid cultivars of onion（Allium cepa L.）from
Japanese seed company were cultured in vitro using B5 medium which supplied with 100 g · L-1 sucrose
and 2,4-D and 6-BA. The suitable media for haploid induction of onion were B5 medium with 1.5 mg · L-1
2,4-D + 1.5 mg · L-1 6-BA and B5 medium with 2.0 mg · L-1 2,4-D + 2.0 mg · L-1 6-BA. The highest
induction rate was 4.00%. Forty-three gynogenic embryos were obtained and each of them developed into
the whole plant on the B5 medium with no any plant growth regulators. The regenerated plantlets were
domesticated and transplanted in greenhouse. The survival rate was 100%. Ploidy analysis of the
regenerants with chromosome counts of root tip cells and flow cytometry analysis of leaf tissue revealed
that 42 of them are haploid.
Key words：onion；Allium cepa L.；gynogenesis；haploid；flow cytometry

洋葱（Allium cepa L.）起源于中亚，在中国种植历史较短，种质资源严重匮乏。洋葱是典型的
异花授粉作物，由于长期异交，不利的隐性基因被保存下来，一旦自交，隐性不利基因就容易表现

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出来，使自交后代生长势变弱，衰退严重。洋葱通常只能自交 2 ~ 3 代，很难获得基因型和表现型
完全一致的自交系。由于洋葱是二年生植物，育成优良的自交系至少需要 6 ~ 10 年的时间。而通过
单倍体途径在较短时间内就可以选育出整齐一致的纯系，同时由于不存在等位基因位点的显隐性作
用，一些由隐性基因决定的性状便可以得到充分表现，在筛选育种材料时能大大降低误选频率，明
显提高选择效果。此外，利用单倍体培养可以快速获得双单倍体群体，由于双单倍体群体中的每个
个体都是完全纯合同质的，可作为重要性状的遗传分析、分子标记及数量性状研究的理想材料。
20 世纪 80 年代末至 90 年代初，3 个研究小组（Muren，1989；Campion & Alloni，1990；Keller，
1990）几乎同时报道通过雌核发育途径诱导洋葱单倍体取得了成功，但是获得的单倍体植株再生率
相对较低，而且方法相对繁琐。后来，通过改变培养基组成，改善培养条件等（Martinez et al.，2000；
Hassandokht & Campion，2002；Musial et al.，2005；Ponce et al.，2006），使得培养程序简化，诱导
效率得到了一定提高。但是所选用的洋葱材料以长日照型的常规种和自交系为主，以中日照型洋葱
杂交种为材料的不多。而且中国目前未见到任何有关洋葱单倍体培养的研究报道。
本研究中以引自日本的 3 个优良中日照型洋葱杂交种为材料，通过离体雌核发育途径诱导培养
未授粉花蕾，首次获得了洋葱单倍体植株，为建立稳定高效的洋葱双单倍体育种技术体系提供技术
支撑，为洋葱杂交种选育、分子标记研究、遗传图谱构建等奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及其培养方法
引自日本的 3 个优良中日照型洋葱杂交种‘阿盾’（ATON，Takii Seed）、‘地球’（EARTH，Takii
Seed）、‘塔展’（TASAN，Shippo Seed），种植于山东省农业科学院蔬菜研究所试验基地。鳞茎收获
后在通风良好的条件下贮存。2010 年 10 月初将鳞茎定植于 30 目的隔离网室中，次年 5 月中旬抽薹
花苞开放后取材。选取直径 2.5 ~ 3.5 mm 的未开放花蕾，剪去花柄（图 1，a），在超净工作台上用
70%乙醇溶液表面消毒处理 30 s，然后在含有 2%有效氯的次氯酸钠溶液中消毒 15 min，无菌水冲洗
3 ~ 5 次，用灭菌滤纸吸干表面水分，接种在加有不同浓度及配比的 6-BA（6–苄基腺嘌呤）和 2,4-D
（2,4–二氯苯氧乙酸）的 B5 培养基中。培养条件：温度（25 ± 2）℃，光照 30 μmol · m-2 · s-1，16 h · d-1。
所有诱导培养基均添加 100 g · L-1 蔗糖和 7 g · L-1 琼脂，用 NaOH 溶液调至 pH 5.8，并于高压自动灭
菌锅 121 ℃灭菌 20 min。培养基用直径 90 mm 的培养皿分装，每皿约 30 mL，Parafilm 膜封口。每
皿接种花蕾 25 个（图 1，b）。
1.2 植株再生及其倍性鉴定
花蕾在单倍体诱导培养基中培养诱导胚状体发生。将胚状体转移到无植物生长调节剂含有 30
g · L-1 蔗糖的 B5 培养基中即可发育成完整植株。植株生长至两叶一心后，在组培室内打开瓶盖驯化
培养 3 d，然后小心地将幼苗用镊子取出，自来水冲洗干净根基部的培养基，移栽到装满经高温灭
菌的蛭石的营养钵中，定期浇营养液，在温室中培养。
染色体计数法：每株取 3 ~ 5 条 2 ~ 3 mm 长的新生幼嫩根尖进行染色体鉴定。经卡诺液固定过
夜后，用 70%的酒精保存在 4 ℃冰箱中备用。减数分裂染色体制片时用手术刀片切取根尖，用 1%
的醋酸洋红染色，盖片，用带橡皮的铅笔垂直轻轻敲片，使染色体散开。在 OLYMPUS（BX-51）
显微镜下观察，选取染色体分散好的细胞拍照，统计染色体数。
流式细胞仪法：取 10 mg 离体新鲜叶片，加 0.5 mL 的 Partec HR-A 溶液（分离细胞核的柠檬酸
11 期 刘冰江等：离体雌核发育诱导洋葱单倍体与植株再生 2267

缓冲液）研磨。将样品通过 30 μmol · L-1 PartecCelltricsTM 微孔膜过滤到测试管中，加 0.5 mL Partec
HR-B 溶液（DAPI 溶液）于样品中，将样品上样于德国 Partec PA 流式细胞仪测定植株细胞 DNA
的相对含量。测定结果由仪器直接绘出 DNA 曲线图。
2 结果与分析
2.1 花蕾在诱导培养基中的发育过程
利用未授粉花蕾在添加不同浓度 2,4-D 和 6-BA 的 B5 培养基上进行洋葱的单倍体诱导，经过 2 d
的培养后花蕾开放，5 ~ 6 d 后花药败育，子房逐渐膨大。经过两个月的培养，在适宜的培养基中雌
核发育的胚开始逐渐从子房中长出，并且具有完整的植株结构（图 1，c、d）。3 ~ 4 个月后胚达到最
多，5 个月以后很少出现。




















图 1 洋葱花蕾的离体雌核发育情况
a：直径 2.5 ~ 3.5 mm 的未开放花蕾；b：接种在培养基中的花蕾；c：‘阿盾’在 B5 + 2.0 mg · L-1 2,4-D + 2.0 mg · L-1 6-BA 培养基上
雌核发育胚出现；d：雌核发育胚的放大；e：‘阿盾’的雌核发育胚在无激素的 B5 培养基上发育成试管苗；f：试管苗的驯化；
g：二倍体对照‘地球’的根尖染色体（2n = 16）；h：单倍体再生植株（来源于‘阿盾’）的根尖染色体（n = 8）。
Fig. 1 The development of onion flower buds in vitro and induction of gynogenesis
a：Unopened flower buds（2.5–3.5 mm in diameter）；b：Flower buds inoculated on the media；c：Emergence of gynogenic embryo from‘ATON’
on B5 medium with 2.0 mg · L-1 2,4-D + 2.0 mg · L-1 6-BA；d：The enlargement of gynogenic embryo；e：Tube plantlets of‘ATON’from gynogenic
embryo on the hormone-free B5 medium；f：Acclimatization of tube plantlet；g：Chromosomes in root tip cells of a diploid plant from
‘EARTH’（2n = 16）；h：Chromosomes in root tip cells of a haploid regenerated plant from‘ATON’（n = 8）.
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2.2 培养基中 2,4-D 和 6-BA 组成对花蕾诱导培养的影响
不同品种在 2,4-D 和 6-BA 不同配比处理下外植体形成雌核发育胚的结果见表 1。
‘塔展’品种的诱导率非常低，在几种培养基配比中只有一种诱导产生了 1 枚雌核发育胚，诱
导率仅为 0.5%。
‘阿盾’品种在培养基 B5 + 2.0 mg · L-1 2,4-D + 2.0 mg · L-1 6-BA 中产生了最多的 8 枚胚，在培
养基 B5 + 1.5 mg · L-1 2,4-D + 1.5 mg · L-1 6-BA 中产生了 6 枚胚。
‘地球’品种在 B5 + 1.5 mg · L-1 2,4-D + 1.5 mg · L-1 6-BA 和 B5 + 2.0 mg · L-1 2,4-D + 2.0 mg · L-1
6-BA 两种培养基中产生的胚最多（6 枚）。
表明这两种培养基可初步用来进行洋葱雌核发育胚诱导，而其余培养基诱导洋葱产生雌核发育
胚的数量较低，不适用于洋葱雌核发育的诱导。较高浓度的 2,4-D 和 6-BA 有利于雌核发育胚的诱
导发生，‘阿盾’和‘地球’都是雌核发育能力较强的品种，而‘塔展’则是离体诱导雌核发育能力
弱的品种。

表 1 B5 培养基中 2,4-D 和 6-BA 组成对洋葱雌核胚发育的影响
Table 1 Effects of different combinations of 2,4-D and 6-BA in B5 medium on the development
of onion gynogenic embryo
激素组成/（mg · L-1）
Hormone combinations
阿盾 ATON 地球 EARTH 塔展 TASAN
2,4-D 6-BA
成胚数
Embryo number
成胚率/%
Embryo rate
成胚数
Embryo number
成胚率/%
Embryo rate
成胚数
Embryo umber
成胚率/%
Embryo rate
1.0 1.0 0 0 0 0 0 0
1.0 1.5 1 0.50 0 0 0 0
1.0 2.0 3 1.50 2 1.00 0 0
1.5 1.0 0 0 2 1.00 0 0
1.5 1.5 6 3.00 6 3.00 1 0.50
1.5 2.0 2 1.00 1 0.50 0 0
2.0 1.0 0 0 0 0 0 0
2.0 1.5 1 0.50 4 2.00 0 0
2.0 2.0 8 4.00 6 3.00 0 0
注：每个品种及处理接种 200 个花蕾。
Note：200 flower buds were inoculated for each cultivar and treatment.

2.3 植株再生及倍性鉴定
将所获得的雌核发育胚转移至无激素的含有 30 g · L-1 蔗糖的 B5 培养基中，5 d 后即可发育成正
常植株，获得的所有雌核发育胚均发育成完整植株（图 1，e、f），再生率达到 100%。
以正常二倍体（2n = 2x = 16，图 1，g）洋葱为对照，对所获得的再生植株进行根尖染色体数分
析，发现除了 1 株源自品种‘阿盾’的根尖中有含 2n = 2x = 16 条染色体（流式细胞仪分析为二倍
体）外，其余植株的根尖染色体细胞均含有 8 条染色体（n = x = 8，图 1，h），诱导再生的植株绝大
多数为单倍体，单倍体率达 95.24%（表 2）。

表 2 再生植株的单倍体率
Table 2 Haploid percentage of regenerated plants
供试品种
Cultivars
再生植株数
Regenerated plants
n = 8 株数
Number of plant（n = 8）
流式细胞仪检测单倍体株数
Haploid plants identified by flow cytometry
单倍体率/%
Haploid percentage
阿盾 ATON 21 20 20 95.24
地球 EARTH 21 21 21 100.00
塔展 TASAN 1 1 1 100.00
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流式细胞仪通过检测 G2 期 DNA 含量来鉴定植物叶片细胞的倍性。以正常二倍体叶片为对照，
利用流式细胞仪对所获得的再生植株进行了倍性鉴定。将洋葱正常二倍体对照和待测试样品的细胞
悬浮液分别在流式细胞仪上进行测试分析，二倍体的分离峰出现在荧光强度 140 时（图 2，a），据
此断定分离峰出现在荧光强度 70 的为单倍体材料（图 2，b）。所得结果与染色体计数法（表 2）完
全吻合。



图 2 洋葱二倍体和单倍体植株的 DNA 含量分布图
a：二倍体植株；b：单倍体植株。
Fig. 2 The DNA distribution of diploid and haploid plants in onion
a：Diploid；b：Haploid.
3 讨论
中国洋葱的研究历史较短，特别是对遗传育种方面的研究则更少（王建军 等，2003；吴海涛 等，
2009）。洋葱品种材料遗传背景较其它蔬菜作物狭窄，种质资源严重缺乏（崔成日 等，2006；陈沁
滨 等，2008）。为了丰富我国洋葱种质资源，选育具有优良农艺性状的核心骨干亲本，本研究中选
用了中国生产中广泛使用的来自日本的 3 个优良洋葱杂交种作为试验材料，通过离体雌核发育途径
诱导获得了 43 株再生植株，其中 42 株经鉴定为单倍体，仅有 1 株为二倍体，说明此方法是切实可
行的，对洋葱遗传育种研究具有重要意义。所获得的 1 株二倍体是自然加倍形成的双单倍体还是源
自体细胞的二倍体，尚需进一步研究证实。
洋葱子房中只有 6 枚胚珠，从子房中剥离胚珠比较困难，不适合大量培养。以洋葱花蕾为材料
来源，可以直接从花序中切取未开放花蕾进行接种，省工省力。本研究证实洋葱整个花蕾可直接作
为单倍体诱导的外植体。
本研究中发现较高质量浓度的 2,4-D 和 6-BA 更有利于洋葱雌核发育胚的诱导，这可能是由于
较高浓度条件下抑制了子房壁、花蕾基部、花托等体细胞愈伤组织的增长，促进胚囊内的雌核发
育。
Bohanec 和 Jakŝe（1999）报道源自欧洲的长日照型洋葱品种的雌核反应能力是源自北美和日本
的 5 ~ 9 倍，培养的 9 个来自日本的长日照型洋葱材料中，有 2 个未诱导出单倍体。在本研究中培
养的 3 个洋葱基因型均为中日照型洋葱杂交种，有 1 个基因型（‘塔展’）只获得了 1 株单倍体再生
植株，单倍体诱导率最高的为‘阿盾’（4%）。表明不同基因型洋葱可能对雌核发育的诱导反应不同，

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存在着一定的基因型依赖性。因此在以后的研究中应该针对不同的洋葱品种研究其合适的诱导培养
基。对单倍体诱导率高的洋葱基因型可设计更加适宜的激素组合、浓度配比的培养基，从而建立更
加快速、高效的洋葱单倍体诱导技术体系。
可以预见，随着相关基础研究工作的深入，有可能大大减少基因型对洋葱单倍体培养的限制，
并促使此项技术应用于遗传育种、分子生物学等研究中。

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