全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（5）：981–988 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–01–09；修回日期：2013–03–21
基金项目：国家茶叶产业技术体系项目（CARS-023）；国家自然科学基金项目（30901159；31170624；31100504）；浙江省自然科学基
金项目（Y3090041）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：liangchen@mail.tricaas.com）
茶树TIDH核苷酸多样性及与咖啡碱含量的关联
分析
周晨阳，金基强，马春雷，姚明哲，陈 亮*
（中国农业科学院茶叶研究所，国家茶树改良中心，杭州 310008）
摘 要：咖啡碱是嘌呤碱中最重要的一种，对茶叶的滋味等品质起重要的作用，对于咖啡碱代谢途
径的研究有重要意义。根据 NCBI 登录的 TIDH 基因（编码咖啡碱合成途径的一个关键酶——次黄嘌呤核
苷酸脱氢酶）cDNA 设计引物，克隆获得了一条基因组 DNA 的中间片段，长 4 172 bp（TIDH3）。从中国
茶树资源核心种质中选取咖啡碱含量有代表性的95份资源进行了两个年度、春秋两季的咖啡碱含量HPLC
测定，大部分材料的咖啡碱含量在 2.50% ~ 4.50%，4 次重复的平均值为 3.50%，变异系数在 15.52% ~
19.25%，表明茶叶咖啡碱含量在不同年份与季节都是相对稳定的。经 PCR 扩增、测序和序列多态性分析，
TIDH3 中的一个 759 bp 片段的总核苷酸多样性指数 πT 和 θW 分别为 0.006 和 0.012，同义突变多样性 πsyn =
0.009大于非同义突变多样性 πnonsyn = 0.006。Ka/Ks = 0. 600 < 1，认为TIDH3基因受到负向选择作用。TIDH3
基因连锁不平衡分析表明，基因内的连锁不平衡衰减速度较快，在约 300 bp 范围内 r2 值降低到了 0.2。通
过关联分析，获得两个与咖啡碱含量显著相关的 SNP 位点，遗传贡献率分别为 10.43%和 5.68%。
关键词：茶树；咖啡碱；次黄嘌呤核苷酸脱氢酶；TIDH；基因克隆；关联分析
中图分类号：S 571.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）05-0981-08

Nucleotide Acid Diversity of Inosine-5’-monophosphate Dehydrogenase
Gene and Association Analysis of the Gene with Caffeine Content in Tea
Plant
ZHOU Chen-yang，JIN Ji-qiang，MA Chun-lei，YAO Ming-zhe，and CHEN Liang *
（Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Center for Tea Improvement，
Hangzhou 310008，China）
Abstract：Caffeine is one of the most important purine alkaloids，as it plays an important role in
flavor of tea. It’s of great importance to study the caffeine biosynthesis pathway of tea plant. The primers
were designed based on TIDH（which codes for inosine-5’-monophosphate dehydrogenase，a key gene in
the caffeine biosynthesis pathway of tea plant）cDNA from the NCBI. One internal fragment of TIDH
genomic DNA was cloned（4 172 bp，TIDH3）. A set of 95 accessions which are typical in caffeine content
was selected from the core collection of Chinese tea germplasm previously established. The caffeine
content of two seasons of spring and autumn in two years was tested by HPLC. The result showed the
caffeine content of most germplasms was 2.50%–4.50%，the average content was 3.50%. The coefficient

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of variation is 15.52%–19.25%，which means that the caffeine content of tea is stable between different
years or seasons. A 759 bp genomic DNA fragment of TIDH3 was cloned，sequenced and analyzed. The
average nucleotide diversity for the sequenced region was calculated to be πT = 0.06 and θW = 0.012. The
diversity at synonymous sites，πsyn = 0.009，was higher than diversity at non-synonymous sites，πnonsyn =
0.006. The ratio of Ka/Ks was 0.600（lower than 1.0），indicating the action of purifying selection. The
linkage disequilibrium（LD）of SNPs in TIDH3 was detected and the result showed that LD declined
rapidly within the gene region（the value of r2 reduced to 0.2 in 300 bp）. By means of association analysis，
two SNPs were found to be significantly correlated with caffeine content，their genetic effect values were
10.43% and 5.68%，respectively.
Key words：tea plant；caffeine；TIDH；gene cloning；association analysis

在含嘌呤生物碱的植物中，次黄嘌呤核苷酸是腺嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸及咖啡碱合成的前
体物质（Nishimura & Ashihara，1993），对于咖啡碱的合成具有重要的意义。在茶树咖啡碱代谢途
径中，分为核心途径和供体途径（Ashihara & Suzuki，2004）。在供体途径中，有 4 种来源合成黄嘌
呤核苷，继而进入核心途径合成咖啡碱，次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（ inosine 5’-monophosphate
dehydrogenase）参与了其中 3 种供体途径。茶树次黄嘌呤核苷酸脱氢酶催化次黄嘌呤核苷酸合成黄
嘌呤核苷酸，其 cDNA 全长序列被克隆，命名为 TIDH（Keya et al.，2003），对其在不同组织器官中
的表达也有初步研究（李叶云和芦原坦，2009）。Koshiishi 等（2001）提出可以通过抑制次黄嘌呤
核苷酸脱氢酶活性并增加次黄嘌呤核苷酸的量来培育低咖啡碱茶叶。
关联分析（association analysis）是利用不同基因座等位变异间的连锁不平衡关系进行标记与性
状的相关性分析，以达到鉴定特定目标性状基因（或染色体区段）的目的（Gupta et al.，2005）。
相比传统 QTL（quantitative trait locus）作图方法，关联分析具有一系列优势：以自然群体为研究对
象，避免了因构建作图群体而耗费大量时间；可同时检测同一座位的多个等位基因；分辨率较高
（Flint-Garcia et al.，2005）；能够直接对基因型变异和表型变异进行分析；可以明确不同种质资源
中所携带的等位基因及其对目标性状的贡献（王荣焕 等，2007）等。关联分析的策略主要包含两种，
全基因组扫描策略和候选基因策略。全基因组扫描策略需要检测大量位于基因组的遗传标记，分析
其与目标性状的连锁程度，更适合用于分析具有高度连锁不平衡水平的群体（王荣焕 等，2007）。
候选基因策略是基于序列水平，通过检测序列中的等位位点与目标性状的关联，挑选出对目标性状
有贡献的基因。玉米的基因组由于核苷酸多态性高，连锁不平衡耗散快，重组率高等特点（Remington
et al.，2001），被认为是进行关联分析的模式植物。Thornsberry 等（2001）利用 92 个自交系材料对
控制玉米株高的 Dwarf8 与开花时间进行关联分析，发现有几个多态性位点与开花期的变异显著相
关。Guillet-Claude 等（2004）研究了 34 个玉米自交系中 3 个与木质素合成有关的基因多态性和细
胞壁消化能力性状的相关性，发现一段长 18 bp 的插入缺失与细胞壁消化能力显著相关。
本研究中对茶树 TIDH DNA 序列进行了克隆，在检测 95 份茶树核心种质资源的 TIDH 核苷酸
多态性及咖啡碱含量后进行关联分析，寻找与咖啡碱含量相关的单核苷酸多态性（single nucleotide
polymorphism，SNP）位点，这对了解茶树 TIDH 基因及其与咖啡碱含量的关系具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2010—2011 年进行。TIDH 基因克隆以‘白叶一号’一芽二叶新梢的基因组 DNA 为
5 期 周晨阳等：茶树 TIDH 的核苷酸多样性及与咖啡碱含量的关联分析 983

模板。用于咖啡碱含量测定、TIDH 核苷酸多样性分析和关联分析的 95 份茶树资源（表 1）一芽二
叶新梢均采于中国农业科学院茶叶研究所国家种质杭州茶树圃。
1.2 扩增目的基因
采用 CTAB 法（Porebski et al.，1997）提取基因组 DNA，用微量紫外分光光度计测量 DNA 的
浓度和纯度，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量。根据 NCBI 中登录的 TIDH（EU106658）
基因 cDNA 序列设计引物，TIDH97F：5′ GAA TAG AAG AAG ATG GAT ATC CGG C 3′，TIDH97R：
5′ GCA TTT CCT AGT GAG CTT TTT AAG G 3′。PCR 反应体系：以 1 μL 基因组 DNA 为模板，加
入 2 μL 10 × PCR buffer，1.6 μL 25 mmol · L-1 MgSO4，2 μL 2 mmol · L-1 dNTP，0.5 U KOD-PLus-Neo
酶，10 μmol · L-1 的正反向引物各 0.6 μL，加 12 μL ddH2O 至 20 μL。于 94 ℃预变性 2 min；94 ℃
变性 30 s，59 ℃退火 30 s，68 ℃延伸 2 min 30 s，32 个循环；68 ℃延伸 10 min。PCR 产物经试
剂盒回收纯化后，与线性化载体用 TaKaRa 的“In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit”试剂盒连
接。PCR 产物连接载体后，转化 TG1 感受态细胞，经菌落 PCR 验证，初步得到阳性克隆，选
择 5 个送至生物公司测序。
1.3 TIDH 核苷酸多样性及其与咖啡碱含量的关联分析
1.3.1 咖啡碱含量的测定
春季和秋季第一轮新梢长到一芽二叶时采摘一芽二叶，用微型烘干机 120 ℃热风固样 5 min，
75 ℃烘至足干，密封避光贮藏备用（陈亮 等，2005）。参考 GB/T 8313-2008 第一法高效液相色谱
法（周卫龙 等，2008）测定样品咖啡碱含量。
1.3.2 核苷酸多样性分析
根据已获得的基因序列，对基因组 TIDH 设计测序引物 TIDH3，目的片段长度为 759 bp。引物
TIDH3F：CTC CGC TAA GTC TCA CCG CT；TIDH3R：CTT TCT TGC ATG CTC CCC TC。
利用引物 TIDH3 对 95 份茶树资源的基因组 DNA 进行扩增，反应体系：以 1 μL（50 ng · μL-1）
基因组 DNA 为模板，加入 5 μL 10 × PCR buffer，5 μL dNTP，4 μL MgSO4，1.25 U 的 KOD-Plus-Neo
酶，正、反向引物各 1.5 μL，加 ddH2O 30 μL。94 ℃变性 15 s，68 ℃延伸 80 s，10 个循环；94 ℃
变性 15 s，65 ℃延伸 25 s，68 ℃延伸 60 s，26 个循环。
PCR 产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳后切割目标片段，用北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司胶回
收试剂盒回收，送至上海华津生物科技有限公司测序，获得 95 份资源的基因序列，根据峰图文件去
掉质量不好的序列，最终得到的序列用于分析多态性。利用 DnaSP v. 5.1 软件（http：// www. bio-soft.
net/dna/dnasp.htm）分析序列多态性（刘希华，2010）。核苷酸多样性水平分别用参数π（Tajima，
1983）和 Watterson 参数 θw（Watterson，1975）表示。π的估算以分离位点的数量为基础，估算包
括总核苷酸多样性（πT）、同义突变多样性（πsyn）和非同义突变多样性（πnonsyn）等。θW 的估
算以序列间每位点差异核苷酸的平均数量为基础。Ka 和 Ks 是表示非同义替换和同义替换的参数，
二者之间的比例关系则可用于判断是否有选择压力作用于相应基因。当 Ka/Ks ＞ 1 时，表明该基因受
到正选择作用；当比值为 1 时，说明受到中性选择，即群体不受选择压力影响；当比值小于 1 时，说
明存在负向选择作用。单倍型数量 h 和单倍型多样性水平 Hd采用 Nei（1987）的方法进行，采用 Hudson
和 Kaplan（1985）的四配子检验法，计算物种内发生的最小历史重组事件数（Rm）。
1.3.3 连锁不平衡分析
通常使用的连锁不平衡的参数有两种：一种是 D’，与实验样本量的大小有关；另一种是 r2，代
表等位基因频率相关系数的平方，由群体大小和重组值决定（Hill & Robertson，1968）。本试验中使
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用 r2 为连锁不平衡的度量。每两个 SNP 位点间的 r2 值及显著性检验利用软件 Tassel 3.0（http：//www.
maizegenetics. net/tassel）进行分析。对计算所得的 r2 值随物理距离的变化作散点图，并采用非线性
回归方法分析 r2 值随物理距离的变化趋势。
1.3.4 TIDH 核苷酸多样性与咖啡碱含量的关联分析
采用 SPSS 13.0 软件（SPSS Inc. USA）进行单因素方差分析（ANOVA），比较 95 份茶树资源中
TIDH3 各 SNP 不同基因型间咖啡碱的含量，找到与咖啡碱含量呈显著相关的 SNP。
2 结果与分析
2.1 TIDH 目的基因的克隆
PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的条带切胶回收、转化后测序，最终得到长度为
4 172 bp（尾端未测通）的 TIDH 基因组 DNA，将其命名为 TIDH3，GenBank 序列登录号为 JX647698。
2.2 咖啡碱含量测定结果
2010—2011 年 2 年春秋共 4 次重复鉴定结果表明，咖啡碱含量的平均值均在 3.50%左右，而变
异系数在 15.52% ~ 19.25%，基本符合正态分布，表明茶叶咖啡碱含量总体比较稳定，受年度与季节
的影响较小（表 1 和表 2）。

表 1 供试材料的咖啡碱含量
Table 1 The caffeine content of the tested tea germplasms %
编号
No.
来源地
Source
资源名称
Name
2010 年春
Spring
2011 年春
Spring
2010 年秋
Autumn
2011 年秋
Autumn
平均
Average
1 安徽金寨 Jinzhai，Anhui 齐山云雾茶 Qishan Yunwucha 2.77 2.83 3.21 3.74 3.13
2 安徽祁门 Qimen，Anhui 安徽 3 号 Anhui 3 3.30 3.26 4.03 3.35 3.48
3 安徽祁门 Qimen Anhui 安徽 7 号 Anhui 7 2.99 4.18 3.68 3.40 3.56
4 安徽舒城 Shucheng，Anhui 舒茶早 Shuchazao 3.35 3.68 3.83 3.57 3.61
5 安徽祁门 Qimen，Anhui 凫早 2 号 Fuzao 2 3.53 3.75 4.09 3.97 3.83
6 日本鹿儿岛 Kagoshima，Japan 枕 CM22 Makurazaki CM22 1.87 1.99 2.02 1.72 1.90
7 重庆酉阳 Youyang，Chongqing 大阳茶 Dayangcha 3.37 3.38 3.34 3.10 3.30
8 湖北巫溪 Wuxi，Hubei 巫溪 9 号 Wuxi 9 3.42 3.74 2.37 3.18 3.18
9 重庆永川 Yongchuang，Chongqing 蜀永 701 Shuyong 701 3.72 3.69 4.05 3.30 3.69
10 福建安溪 Anxi，Fujian 赤叶 Cheye 3.95 3.53 3.54 3.42 3.61
11 福建永春 Yongchun，Fujian 绿芽佛手 Lüya Foshou 3.68 3.57 3.36 3.16 3.44
12 福建安溪 Anxi，Fujian 青心奇兰 Qingxin Qilan 4.49 3.97 3.38 3.40 3.81
13 福建武夷山 Wuyishan，Fujian 御茶 Yucha 2.61 2.64 2.84 2.66 2.69
14 福建安溪 Anxi，Fujian 竹叶奇兰 Zhuye Qilan 4.13 3.71 3.36 3.78 3.75
15 福建福鼎 Fuding，Fujian 吴山半清明 Wushan Banqingming 3.94 3.40 3.49 3.09 3.48
16 福建政和 Zhenghe，Fujian 政和大白茶 Zhenghe Dabaicha 3.57 3.34 3.43 3.44 3.44
17 福建福鼎 Fuding，Fujian 福鼎大白茶 Fuding Dabaicha 3.59 3.47 3.35 3.69 3.53
18 福建建瓯 Jianou，Fujian 高脚乌龙 Gaojiao Wulong 4.18 3.95 3.76 3.83 3.93
19 广东乐昌 Lechang，Guangdong 沿溪山白毛茶 Yanxishan Baimaocha 3.52 4.19 4.44 4.18 4.08
20 广东乐昌 Lechang，Guangdong 乐昌大叶黄茶 Lechang Daye Huangcha 4.00 4.56 3.71 3.97 4.06
21 广东乐昌 Lechang Guangdong 郎田苦茶 1 号 Langtian Kucha 1 3.74 3.56 3.45 3.58 3.58
22 广东广州 Guangzhou，Guangdong 广州小叶青心 Guangzhou Xiaoye Qingxin 2.77 2.94 2.57 2.62 2.72
23 广东广宁 Guangning，Guangdong 广宁大叶青心 Guangning Daye Qingxin 3.36 3.39 3.45 3.45 3.41
24 广东乳源 Ruyuan，Guangdong 半山园茶 Banshan Yuancha 3.47 3.17 3.14 3.47 3.31
25 广东乳源 Ruyuan，Guangdong 乳源柳坑 1 号 Ruyuan Liukeng 1 1.73 1.38 1.11 1.04 1.31
26 广东普安 Pu’an，Guangdong 普安小叶种 Pu’an Xiaoyezhong 3.46 3.63 2.95 3.28 3.33
27 广东英德 Yingde，Guangdong 英红 1 号 Yinghong 1 4.05 3.97 3.37 4.03 3.86
28 广东英德 Yingde，Guangdong 英红 9 号 Yinghong 9 4.12 3.95 3.71 4.57 4.09
29 广西昭平 Zhaoping，Guangxi 象棋茶 Xiangqicha 3.94 3.75 3.63 3.20 3.63
30 广西兴安 Xing’an，Guangxi 六洞大叶 Liudong Daye 4.13 4.67 4.51 4.28 4.40
5 期 周晨阳等：茶树 TIDH 的核苷酸多样性及与咖啡碱含量的关联分析 985

续表 1
编号
No.
来源地
Source
资源名称
Name
2010 年春
Spring
2011 年春
Spring
2010 年秋
Autumn
2011 年秋
Autumn
平均
Average
31 广西龙胜 Longsheng，Guangxi 崩坡大茶树 Bengpo Dachashu 3.40 3.67 3.64 3.96 3.67
32 广西防城 Fangcheng，Guangxi 冲锋茶 Chongfengcha 3.16 3.60 3.41 3.29 3.36
33 广西防城 Fangcheng，Guangxi 河洲茶 Hezhoucha 3.64 4.01 3.82 4.42 3.97
34 广西防城 Fangcheng，Guangxi 田廖茶 Tianliaocha 3.61 4.13 3.67 3.68 3.77
35 广西贺县 Hexian，Guangxi 贺县种 Hexianzhong 3.08 3.39 4.27 4.26 3.75
36 广西宁明 Ningming，Guangxi 琴清黄叶 Qinqing Huangye 3.26 3.84 3.86 3.30 3.57
37 广西金秀 Jinxiu，Guangxi 古兰茶 1 Gulancha 1 3.18 3.25 3.53 3.37 3.33
38 广西金秀 Jinxiu，Guangxi 金田种 Jintianzhong 2.79 2.89 2.82 2.42 2.73
39 广西上林 Shanglin，Guangxi 上林 6 号 Shanglin 6 4.19 3.81 4.11 3.68 3.95
40 广西资源 Ziyuan，Guangxi 资源云雾 Ziyuan Yunwu 3.39 3.63 2.89 3.23 3.29
41 广西资源 Ziyuan，Guangxi 资源大叶 Ziyuan Daye 3.85 3.89 3.37 3.30 3.60
42 广西资源 Ziyuan，Guangxi 边洪种 Bianhongzhong 3.90 3.93 3.53 3.06 3.61
43 广西资源 Ziyuan，Guangxi 资源 28 号 Ziyuan 28 4.03 3.71 4.12 4.05 3.98
44 贵州湄潭 Meitan，Guizhou 黔湄 502 Meitan 502 3.06 3.52 3.17 2.81 3.14
45 贵州金沙 Jinsha,Guizhou 贵州大牛皮 Guizhou Daniupi 3.57 3.53 3.47 3.37 3.48
46 贵州 Guizhou 贵州大茶树 Guizhou Dachashu 3.08 3.64 3.63 3.02 3.34
47 湖北恩施 Enshi，Hubei 屯堡沙龙群体 Tunbao Shalong Qunti 3.42 4.08 3.63 3.30 3.61
48 湖北宣恩 Xuan’en，Hubei 宣恩 64 号 Xuan’en 64 3.87 3.97 3.99 3.70 3.88
49 湖北利川 Lichuan，Hubei 利川忠路茶 Lichuan Zhonglucha 3.69 3.67 4.20 4.12 3.92
50 湖北建始 Jianshi，Hubei 建始煤炭沟群体 Jianshi Meitangou Qunti 3.34 3.49 3.92 3.85 3.65
51 河南信阳 Xinyang，Henan 信阳群体 Xinyang Qunti 4.18 3.95 3.52 3.75 3.85
52 河南信阳 Xinyang，Henan 信阳长叶 Xinyang Changye 2.19 2.17 3.08 2.79 2.56
53 湖南长沙 Changsha，Hunan 高芽齐 Gaoyaqi 3.89 3.92 4.01 4.07 3.97
54 湖南江华 Jianghua，Hunan 江华甜茶 Jianghua Tiancha 3.26 3.98 4.57 4.37 4.05
55 湖南涟源 Lianyuan，Hunan 涟源奇曲 Lianyuan，Qiqu 4.19 4.30 3.64 3.40 3.88
56 湖南城步 Chengbu，Hunan 城步峒茶 Chengbu Dongcha 4.13 4.23 3.65 4.21 4.06
57 江苏吴县 Wuxian，Jiangsu 碧螺春 Biluochun 3.05 3.06 2.89 3.00 3.00
58 江苏无锡 Wuxi，Jiangsu 锡茶 8 Xicha 8 3.08 3.42 3.55 3.85 3.48
59 江苏无锡 Wuxi，Jiangsu 锡茶 10 Xicha 10 3.69 3.64 4.17 3.97 3.87
60 江苏无锡 Wuxi，Jiangsu 锡茶 50 Xicha 50 3.88 4.54 3.31 3.23 3.74
61 江西婺源 Wuyuan，Jiangxi 婺早茶 Wuzaocha 4.14 3.82 3.74 3.64 3.83
62 江西修水 Xiushui，Jiangxi 金春 Jinchun 4.00 3.55 3.93 3.61 3.77
63 日本静冈 Shizuoka，Japan 薮北 Yabukita 2.76 2.97 2.88 2.45 2.76
64 四川广元 Guangyuan，Sichuan 广元 3 号 Guangyuan 3 3.64 3.22 3.12 3.59 3.39
65 四川旺苍 Wangcang，Sichuan 旺苍 10 号 Wangcang 10 3.60 3.28 2.99 3.26 3.28
66 四川城口 Chengkou，Sichuan 高观群体 Gaoguan Qunti 3.80 3.31 3.45 3.63 3.55
67 四川城口 Chengkou，Sichuan 明通群体 Mingtong Qunti 3.53 3.70 2.86 3.57 3.42
68 四川城口 Chengkou，Sichuan 咸宜茶场群体 Xianyi Chachang Qunti 3.60 4.12 3.34 3.80 3.71
69 四川通江 Tongjiang，Sichuan 罗村 1 号 Luocun 1 3.71 3.83 3.44 3.66 3.66
70 四川万源 Wanyuan，Sichuan 万源 4 号 Wanyuan 4 3.18 3.40 2.53 2.59 2.92
71 四川城口 Chengkou，Sichuan 咸宜 1 号群体 Xianyi 1 Qunti 3.37 3.66 3.64 3.88 3.63
72 云南楚雄 Chuxiong，Yunnan 楚雄保甸群体 Chuxiong Baodian Qunti 3.71 3.93 4.18 3.64 3.86
73 云南丽江 Lijiang，Yunnan 丽江 2 号 Lijiang 2 3.61 4.17 3.64 3.81 3.81
74 云南南华 Nanhua，Yunnan 南华 12-2 Nanhua 12-2 4.50 4.82 5.69 5.00 5.00
75 云南宜良 Yiliang，Yunnan 宜良 1 号 Yiliang 1 3.80 3.73 4.48 3.93 3.98
76 云南龙陵 Longling，Yunnan 龙陵 19 号 Longling 19 3.65 3.59 3.92 5.03 4.05
77 云南陇川 Longchuan，Yunnan 陇川 2 号 Longchuan 2 1.71 2.28 3.02 2.52 2.38
78 云南镇沅 Zhenyuan，Yunnan 镇沅 2 号 Zhenyuan 2 3.25 3.29 3.31 4.06 3.48
79 云南景谷 Jinggu，Yunnan 景谷老仓群体 Jingu Laocang Qunti 3.30 3.59 4.44 4.58 3.98
80 云南麻栗坡 Malipo，Yunnan 麻栗坡 8 号 Malipo 8 3.31 3.92 3.11 3.74 3.52
81 云南永德 Yongde，Yunnan 永德 9 号 Yongde 9 3.07 3.79 4.19 4.12 3.79
82 云南元阳 Yuanyang，Yunnan 元阳 4 号 Yuanyang 4 4.06 3.86 3.84 4.10 3.97
83 浙江永嘉 Yongjia，Zhejiang 乌牛早 Wuniuzao 3.38 3.11 3.43 3.31 3.31
84 浙江长兴 Changxing，Zhejiang 紫笋群体 Zisun Qunti 3.11 3.34 2.61 2.50 2.89
85 浙江天台 Tiantai，Zhejiang 天台群体 Tiantai Qunti 3.28 3.49 2.83 2.73 3.08
86 浙江余姚 Yuyao，Zhejiang 余姚种 Yuyaozhong 2.96 3.08 2.52 3.37 2.98
87 浙江嵊州 Shengzhou，Zhejiang 嵊县种 Shengxianzhong 3.27 3.13 3.73 3.38 3.38
986 园 艺 学 报 40 卷
图 1 TIDH3 中连锁不平衡随碱基对衰减情况
Fig. 1 Decay of LD with distance in base between sites in TIDH3
续表 1
编号
No.
来源地
Source
资源名称
Name
2010 年春
Spring
2011 年春
Spring
2010 年秋
Autumn
2011 年秋
Autumn
平均
Average
88 浙江杭州 Hangzhou，Zhejiang 江苦 2 号 Jiangku 2 3.64 3.57 3.42 3.61 3.56
89 浙江平阳 Pingyang，Zhejiang 平阳种 Pingyangzhong 3.44 3.22 3.16 3.35 3.29
90 浙江临海 Linhai，Zhejiang 大叶乌皮 Daye Wupi 2.89 3.02 3.49 2.97 3.09
91 浙江景宁 Jingning，Zhejiang 惠明茶 Huimingcha 3.70 3.52 3.41 3.43 3.51
92 浙江杭州 Hangzhou，Zhejiang 狗牿脑 F1-2 Gougunao F1-2 4.07 3.68 3.35 2.68 3.45
93 浙江安吉 Anji，Zhejiang 安吉白茶 Anji Baicha 2.85 2.70 2.83 2.97 2.84
94 浙江德清 Deqing，Zhejiang 洛舍 Luoshe 3.81 3.20 3.56 3.53 3.53
95 浙江安吉 Anji，Zhejiang 报福 1 号 Baofu 1 2.86 2.57 3.20 3.23 2.97

表 2 所选材料不同时间的咖啡碱含量（%）变异和分布情况
Table 2 The variation and distribution of caffeine content（%）in different time
鉴定时间
Time
最小值
Min
最大值
Max
平均值
Mean
中位数
Median
标准差
Std. Deviation
变异系数⁄%
CV
峰度
Kurtosis
偏度
Skewness
2010 年春 Spring 1.71 4.50 3.48 3.53 0.54 15.52 1.79 –0.97
2011 年春 Spring 1.38 4.82 3.56 3.59 0.56 15.73 2.63 –0.89
2010 年秋 Autumn 1.11 5.69 3.49 3.48 0.61 17.48 3.31 –0.19
2011 年秋 Autumn 1.04 5.03 3.48 3.45 0.67 19.25 1.78 –0.48
2.3 TIDH3 核苷酸多样性分析
2.3.1 TIDH3 的 SNP 统计
经过基因重测序和统计分析发现，759 bp TIDH3 基因组片段在 95 份茶树资源中共出现 48 个
SNP，包括转换类型 28 个，其中有 A-G 15 个和 C-T 13 个；颠换类型 20 个，其中有 A-C 7 个、A-T
3 个、C-G 6 个和 T-G 4 个。平均每 15.8 bp 就出现 1 个 SNP，SNP 出现频率高。其中翻译区有 46
个，非翻译区 2 个；静默 SNP 17 个，非同义 SNP 31 个。
2.3.2 核苷酸多样性
将 95 份茶树资源的 759 bp TIDH3 序列文件导入 DnaSP v. 5.1，计算结果显示总多态性指数 πT
和 Watterson 参数 θW分别为 0.006 和 0.012。进行同义与非同义替换估算，结果显示：同义位点数为
160，突变数为 16；非同义位点数为 503，突变数为 30，同义突变多样性 πsyn = 0.009 大于非同义突
变多样性 πnonsyn = 0.006，说明 TIDH3 的同义突变的遗传变异程度大于非同义突变。95 份材料中共存
在 36 种单倍型，单倍型多样性水平高（0.951）。根据同义与非同义替换的计算结果，Ka = 0.060，
Ks = 0.100，Ka/Ks = 0.600 < 1，表明 TIDH3 基因受到负向选择作用。历史重组事件最小数 Rm = 5。
2.3.3 连锁不平衡分析
LD 作图的方法主要分为两类：一种是基
于候选基因的 LD 作图，另一种是基于全基因
组范围内的 LD 作图，连锁不平衡在目标物种
中延伸的长度决定了采用哪种方法作图。把 95
份茶树资源的 759 bp TIDH3 序列用 Tassel 3.0
软件分析后，共获得 SNP 位点间的 r2 值 120
个。当显著性值 P < 0.05 时，有 20.8%（25 个）
的位点间存在显著的连锁不平衡。
TIDH3 的 LD 估算结果见图 1，TIDH3 基
因内的连锁不平衡衰减速度较快，在 300 bp 左
5 期 周晨阳等：茶树 TIDH 的核苷酸多样性及与咖啡碱含量的关联分析 987

右时，r2 值降低到了 0.2，说明适合开展基于候选基因的 LD 作图。
2.4 TIDH3 核苷酸多态性与咖啡碱含量的关联分析
采用方差分析分别对 48 个 SNP 的不同基因型与各资源咖啡碱的平均含量进行了关联分析，有
2 个 SNP 在 P < 0.05 水平与咖啡碱含量呈显著相关（表 3），分别将其命名为 SNP1 和 SNP2。其中
SNP1 为同义突变，SNP2 为非同义突变，基因型频率见表 3。SNP1 的 3 种基因型 AA，AG，GG 的
咖啡碱含量分别是 3.46% ± 0.52%，3.74% ± 0.25%和 3.91% ± 0.39%，方差分析 P 值为 0.013，基因
型 AA 和 GG 间有差异显著，其遗传贡献率为 10.43%。SNP2 只有 GG 和 GC 两种基因型，咖啡碱
含量分别是 3.48% ± 0.49%和 4.00% ± 0.54%，方差分析 P 值为 0.020，其遗传贡献率为 5.68%。

表 3 与咖啡碱含量显著相关的 SNP 位点的相关信息
Table 3 Information of SNP sites which are significantly correlated with caffeine content
标记
Maker
P 值
P value
SNP 邻近序列
Neighbouring sequence of SNP
定位
Location
样本数
Sample size
基因型频率
Genotype frequency
SNP1 0.013 （A/G）GCAAAG Exon 1 95 AA 0.80（76） AG 0.08（8） GG 0.12（11）
SNP2 0.020 （G/C）AGGATT Exon 1 95 GG 0.94（89） GC 0.06（6）
3 讨论
TIDH3 基因具有中等的核苷酸多样性，其 πT 和 θW值分别为 0.006 和 0.012，与欧洲黑杨（Chu et
al.，2009）相当。TIDH3 的单倍型多样性为 0.951 也与欧洲黑杨（0.894）相近，且二者的值都较高。
Ka/Ks = 0.596 < 1，认为 TIDH3 受到负向选择作用。
茶树 TIDH3 的 r2 值在 300 bp 左右时就降低到了 0.2，表明连锁不平衡在基因内部就已消失，LD
水平较人类和拟南芥消减得快。如 LD 在人类中可从 5 kb 延伸到 500 kb（Reich et al.，2001），在自
交物种拟南芥中可延伸至 250 kb（Nordborg et al.，2002）。茶树的 LD 水平与异交物种小叶杨相似，
如卫尊征等（2009）报道小叶杨的 GA20 氧化酶基因 PsGA20Ox 的 LD 在约 1 000 bp 内就降低到了
0.2。表明同林木一样，茶树也具有很低的 LD 水平，在基因内部就衰减至很低水平，适合开展基于
候选基因的关联分析，且关联分析的分辨率高，可达到单基因水平。
目前，关联分析在茶树中的应用还较少，而在玉米、杨树等植物中已经有广泛的应用。本研究
通过关联分析的方法，找到了 2 个与咖啡碱含量显著相关的 SNP，遗传贡献率分别为 10.43%和
5.68%，不同基因型间咖啡碱含量差异显著。今后可把这 2 个 SNP 转化为用琼脂糖电泳检测的 CAPS
（cleaved amplified polymorphic sequence）标记，再利用分离群体进行验证，进而开发成为功能标记
可能应用于咖啡碱分子标记辅助育种。

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