全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（10）：2132–2138 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–05–08；修回日期：2014–08–18
基金项目：国家自然科学基金项目（30972029）；广州市科信局科技攻关项目（2010Z1-E291）；广州市农业财政专项[穗农（2008）44 号]
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zszhang@scau.edu.cn）
不同倍性蝴蝶兰未减数雄配子的发生及其细胞
学机理初探
朱 娇 1，刘译阳 1，曾瑞珍 1，黎扬辉 2，郭和蓉 1，谢 利 1，易懋升 2，
张志胜 1,*
（1 华南农业大学，广东省植物分子育种重点实验室，广州 510642；2 广州花卉研究中心，广州 510360）
摘 要：采用压片法对不同倍性蝴蝶兰品种小孢子母细胞减数分裂及成熟花粉进行观测，并利用流
式细胞仪测定了花粉中的 DNA 含量，发现除了单倍性配子外，均有少数未减数配子发生。不同倍性蝴蝶
兰品种中单倍性、二倍性、三倍性和四倍性花粉平均直径分别为 11.4、17.2、19.1 和 20.3 μm，花粉直径
与倍性呈正相关关系（r = 0.935，P < 0.065）；二倍体、三倍体和四倍体蝴蝶兰品种未减数雄配子的平均
发生率分别为 0.59%、2.39%和 0.67%，三倍体品种发生未减数雄配子的频率明显高于二倍体和四倍体品
种；二倍体、三倍体和四倍体品种均通过二分体和三分体的方式形成未减数雄配子，其中二分体的形成
是由于小孢子母细胞不进行减数分裂Ⅰ，而正常进行减数分裂Ⅱ所致，三分体的形成可能是由于纺锤体
异常定位形成三极纺锤体所致。
关键词：蝴蝶兰；多倍体；未减数雄配子；细胞学机理
中图分类号：S 682.31 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）10-2132-07

Preliminarily Study on Formation and Cytological Mechanism of Unreduced
Male Gametes in Different Ploidy Phalaenopsis
ZHU Jiao1，LIU Yi-yang1，ZENG Rui-zhen1，LI Yang-hui2，GUO He-rong1，XIE Li1，YI Mao-sheng2，
and ZHANG Zhi-sheng1,*
（1Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding，South China Agricultural University，Guangzhou
510642，China；2Guangzhou Flower Research Center，Guangzhou 510360，China）
Abstract：The microsporogenesis and mature pollens in different ploidy Phalaenopsis were observed
using squash method，besides，DNA content of mature pollen was analyzed using flow cytometry. The
results indicated that there were a few unreduced gametes including haploidy gametes in different ploidy
Phalaenopsis. The mean diameter of haploidy，diploidy，triploidy and tetraploidy pollens was 11.4，17.2，
19.1 and 20.3 μm，respectively，which was positively correlated with ploidy level（r = 0.935，P < 0.065）.
The occurrence frequency of unreduced gamete in triploid（2.39%）was obviously higher than those in
diploid（0.59%）and tetraploid（0.67%），suggesting that triploid was prone to producing more unreduced
gametes. The unreduced male gametes in different ploidy Phalaenopsis were formed by way of dyad and


10 期 朱 娇等：不同倍性蝴蝶兰未减数雄配子的发生及其细胞学机理初探 2133

triad. The formation of dyads was due to the absence of meiosisⅠin a few microspore mother cells，while
that of the triads was probably resulted from the formation of tripolar spindle at meiosisⅡ.
Key words：Phalaenopsis；polyploid；unreduced male gamete；cytological mechanism

蝴蝶兰（Phalaenopsis）栽培品种多数为多倍体（庄东红 等，2007；谢利 等，2014），主要是
通过有性杂交的方法选育而成。因此研究蝴蝶兰未减数雄配子发生及其细胞学机理，对通过有性杂
交方法创造多倍体资源，更有效地开展蝴蝶兰育种均具有重要意义。
在兰科植物中未减数配子普遍发生（Teoh，1980，1984；Veilleux，1985）。但在蝴蝶兰中有
关未减数配子的研究报道较少。周建金等（2009）报道，在二倍体与二倍体蝴蝶兰杂交后代中出现
了三倍体和四倍体，二倍体与三倍体的杂交后代中出现了三倍体和五倍体，四倍体与四倍体的杂交
后代中出现了六倍体，表明不同倍性蝴蝶兰均可形成未减数雄配子。Hsu 等（2010）发现蝴蝶兰二
倍体能够产生未减数雄配子，并通过人工诱导的未减数雄配子有效克服了蝴蝶兰多倍体育种障碍。
但迄今有关多倍体蝴蝶兰未减数雄配子发生及其细胞学机理的研究未见报道。
本研究中以不同倍性蝴蝶兰品种为材料，研究其未减数雄配子的发生及其细胞学机理，为更好
地利用蝴蝶兰未减数雄配子克服杂交育种障碍，创建新种质资源及开展多倍体育种提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以蝴蝶兰（Phalaenopsis）二倍体品种 Phal. Timothy Christonpher 和 Dtps. Mini Red Rose，三倍
体品种 Phal. Little Mary 和 Dtps. Taisuco Pixie 以及四倍体品种 Phal. Taisuco Yellow Ball 和 Dtps. King
Shang’s Beaut 为研究材料。这些材料的倍性已采用根尖染色体压片法进行了鉴定（刘芳，2008）。
材料种植于广州花卉研究中心从化基地环控温室中。试验于 2010 年 1 月至 2012 年 3 月在广州花卉
研究中心从化基地和华南农业大学广东省植物分子育种重点实验室进行。
1.2 花粉 DNA 含量测定与花粉直径的测量
参照谷晓峰和罗正荣（2003）的方法，略有改进。取 5 ~ 10 个花粉块置于玻璃平板上，滴加 0.4
mL 的 Partec HR-A 溶液，迅速用刀片切碎，然后加入 1.6 mL Partec HR-B 溶液于样品中，将样品通
过 30 μm 的 Partec CelltricsTM微孔膜过滤到测试管中，2 ~ 5 min 后，将样品上样于 Partec 流式细胞
仪上进行检测。
在 40 倍光学显微镜下用显微测微尺测量不同倍性蝴蝶兰的花粉粒直径，每个倍性测量 200 粒。
单倍性和二倍性的花粉直径分别为所测量的二倍体蝴蝶兰品种的 1x 和 2x 花粉直径的算术平均值，
三倍性和四倍性的花粉直径分别为所测量的三倍体蝴蝶兰品种中的 3x 和四倍体蝴蝶兰品种中的 4x
花粉直径的算术平均值。
1.3 小孢子发生的细胞学观察
参照周建金等（2009）的方法，略有改进。采摘发育时期不同的花蕾，立即放入卡诺固定液（乙
醇︰冰乙酸 = 3︰1）中固定 24 h，然后转入 70%乙醇中 4 ℃条件下保存。小孢子形成和发育的细胞
学观察采用改良石碳酸品红染色压片法，Olympus OX-71 倒置显微镜下观察拍照。统计小孢子减数
分裂异常行为发生比例时，以 100 个小孢子母细胞为 1 次重复，重复 3 次。
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1.4 未减数雄配子发生频率的计算
参照 Xue 等（2011）的方法，略有改进。观察并记录不同倍性蝴蝶兰成熟花粉中二分体和三分
体的个数。未减数雄配子频率（%）=（2D + Tr）/T × 100。其中 D 代表二分体，Tr 代表三分体，T
代表总花粉数。三倍体蝴蝶兰成熟花粉中三分体配子可能是非整倍体配子，因此，在计算三倍体未
减数雄配子发生频率时不包括三分体，即未减数雄配子频率（%）= 2D/T × 100。
数据采用 SPSS 18.0 软件进行显著性和相关性统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同倍性蝴蝶兰未减数雄配子的鉴定
2.1.1 成熟花粉的 DNA 含量
结果（图 1）表明，不同倍性蝴蝶兰品种的花粉 DNA 含量均呈双峰分布。二倍体 Phal. Timothy
Christonpher 和 Dtps. Mini Red Rose 主峰出现在荧光强度为 50 时，第二峰出现在 100 时，说明二倍
体品种除产生单倍性（1x）雄配子外，还存在少量未减数雄配子。三倍体 Dtps. Taisuco Pixie 和 Phal.
Little Mary 主峰出现在荧光强度为 75 时，第二峰在 150 时，说明除产生减数雄配子外，还存在部分
未减数雄配子（3x）。四倍体 Dtps. King Shang’s Beauty 和 Phal. Taisuco Yellow Ball 主峰出现在荧光
强度为 100 时，第二峰在 200 时，说明除存在二倍性（2x）雄配子外，也存在少量未减数雄配子（4x）。

图 1 不同倍性蝴蝶兰成熟花粉的 DNA 含量
Fig. 1 DNA content of mature pollen in different ploidy Phalaenopsis
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2.1.2 花粉粒直径
结果（表 1）显示，单倍性、二倍性、三倍性和四倍性花粉直径分别约为 11.4、17.2、19.1 和
20.3 µm。相关分析结果显示，花粉倍性与花粉直径间呈正相关关系（r = 0.935，P < 0.065）。

表 1 蝴蝶兰不同倍性花粉直径
Table 1 The diameter of different ploidy pollen in Phalaenopsis
品种倍性
Cultivar
ploidy
品种名称
Cultivar name
花粉倍性
Pollen
ploidy
测量的花粉数
Number of pollen
measured
花粉直径分布范围/ μm
Diameter distribution
range of pollen
花粉平均直径/ μm
Average diameter of
pollen
Phal. Timothy Christonpher 1x 195 8.15 ~ 18.0 11.37 ± 0.13
Dtps. Mini Red Rose 1x 197 8.02 ~ 17.43 11.40 ± 0.13
Phal. Timothy Christonpher 2x 30 15.34 ~ 18.33 17.15 ± 0.15
2x
Dtps. Mini Red Rose 2x 23 15.67 ~ 18.41 17.19 ± 0.15
Dtps. Taisuco Pixie 3x 13 18.38 ~ 20.3 19.13 ± 0.19 3x
Phal. Little Mary 3x 20 18.31 ~ 20.10 19.15 ± 0.12
4x Dtps. King Shang’s Beauty 4x 9 19.68 ~ 21.02 20.45 ± 0.17
Phal. Taisuco Yellow Ball 4x 18 19.02 ~ 21.21 20.05 ± 0.15

不同倍性蝴蝶兰品种花粉直径均呈双峰分布（图 2）。二倍体 Phal. Timothy Christonpher 和 Dtps.
Mini Red Rose 的花粉直径范围为 8 ~ 19 μm，主峰在 10 ~ 11 μm，第二峰值在 17 ~ 18 μm，这说明二
倍体蝴蝶兰中除产生单倍性雄配子外，还存在二倍性的未减数雄配子。三倍体 Dtps. Taisuco Pixie 和
Phal. Little Mary 的花粉直径范围为 9 ~ 21 μm，主峰在 13 ~ 14 μm，第二峰值在 18 ~ 19 μm，这说明
三倍体蝴蝶兰中除产生减数的雄配子外，也存在未减数雄配子即三倍性配子（3x）。四倍体 Dtps. King
Shang’s Beauty 和 Phal. Taisuco Yellow Ball 的花粉直径范围为 12 ~ 22 μm，主峰在 15 ~ 16 μm 之间，
第二峰值在 20 ~ 21 μm，这说明四倍体蝴蝶兰中除产生的减数雄配子（2x）外，也存在未减数雄配
子即四倍性（4x）配子。
图 2 不同倍性蝴蝶兰花粉直径频率分布
Fig. 2 The distribution of pollen diameter in different ploidy Phalaenopsis
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2.2 蝴蝶兰未减数雄配子发生的细胞学特征
Phal. Timothy Christonpher（2x）、Dtps. Taisuco Pixie（3x）和 Dtps. King Shang’s Beauty（4x）
未减数雄配子的发生均通过二分体和三分体两种方式（图 3，A ~ E）。二分体的形成是由于小孢子
母细胞未进行减数分裂Ⅰ（图 3，F ~ G），而正常进行减数分裂Ⅱ（图 3，I，J）所致，三分体的形
成可能是由于在减数分裂Ⅱ纺锤体异常定向形成了三极纺锤体（图 3，K ~ M），后期Ⅱ其中的两组
染色体在纺锤丝的牵引下进入同一个细胞（图 3，N ~ P）导致。


图 3 不同倍性蝴蝶兰 2n 雄配子发生的细胞学机理
A ~ E. 减数分裂末期Ⅱ，示二分体（箭）和三分体（箭头）；F ~ H. 示减数第一次分裂不分裂（箭）；
I、J. 示减数第二次分裂正常（箭）；K ~ M. 中期Ⅱ，示三极纺锤体（箭）；
N ~ P. 后期Ⅱ两组染色体被拉向同一极（箭）。
Fig. 3 Cytological mechanism of unreduced male gametes formation in different ploidy Phalaenopasis
A–E. Dyad（arrow）and triad（arrow head）at telophaseⅡ；F–H. Failure of the first meiotic division（arrow）；
I，J. Homologous chromosome separation at second meiotic division（arrow）；
K–M. Tripolar spindles at metaphaseⅡ（arrow）；
N–P. Two sets of chromosomes being pulled to the same poles（arrow）.
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2.3 不同倍性蝴蝶兰未减数雄配子发生的频率
结果（表 2）显示，二倍体、三倍体和四倍体品种中未减数雄配子平均发生频率分别为 0.59%、
2.39%和 0.67%，表明三倍体品种未减数雄配子发生频率显著高于二倍体和四倍体。

表 2 不同倍性蝴蝶兰未减数雄配子的发生频率
Table 2 The frequencies of producing unreduced male gamete in different ploidy Phalaenopsis
品种倍性
Cultivar
ploidy
品种名称
Cultivar name
观察花粉总数
Total number of
pollen observed
二分体比例/%
Percentage of
dyad
三分体比例/%
Percentage of
triad
未减数雄配子发生频率/%
Frequency of unreduced
male gamete
Phal. Timothy Christonpher 1 993 0.60 1.00 0.55 ± 0.07 a 2x
Dtps. Mini Red Rose 1 661 0.72 1.20 0.64 ± 0.14 a
Dtps. Taisuco Pixie 1 595 5.48 3.57 2.84 ± 0.42 b 3x
Phal. Little Mary 2 037 3.63 2.86 1.93 ± 0.56 b
4x Dtps. King Shang’s Beauty 1 474 0.54 1.61 0.67 ± 0.16 a
Phal. Taisuco Yellow Ball 1 888 0.42 1.89 0.67 ± 0.15 a
注：表中同列不同小写字母表示差异显著（P < 0.05）。
Note：Different letters in the column show significant difference at P < 0.05 level.
3 讨论
利用 2n 配子创建多倍体资源和选育新品种是蝴蝶兰多倍体育种的有效方法。本研究中对不同
倍性蝴蝶兰品种未减数雄配子的发生进行了观察，结果发现，不同倍性蝴蝶兰均可以产生未减数雄
配子，三倍体品种 Dtps. Taisuco Pixie 和 Phal. Little Mary 未减数雄配子的发生频率分别为 2.84%和
1.93%，比二倍体和四倍体品种高。这对更好地开展蝴蝶兰多倍体育种具有重要的指导作用。
花粉 DNA 含量和花粉直径是鉴定未减数雄配子常用的方法（Dewitte et al.，2009）。本研究结
果表明，通过流式细胞仪可以快速准确地鉴定蝴蝶兰未减数雄配子的发生；由于不同倍性的雄配子
直径存在重叠，因此通过花粉直径不能准确鉴定蝴蝶兰未减数雄配子。
未减数雄配子发生主要是通过二分体和（或）三分体途径（Ramanna & Jacobsen，2003）。Crespel
等（2006）通过对不同倍性月季减数分裂进行观察，发现二倍体、三倍体和四倍体月季均以二分体
和三分体的形式产生未减数雄配子。Dweikat 和 Lyrene（1988）报道异源三倍体蓝莓未减数雄配子
以一分体、二分体和三分体的形式存在，未减数雄配子发生比率为 0.9% ~ 1.3%。封紫等（2012）报
道异源三倍体百合能够产生单倍性、二倍性、三倍性和非整倍体配子，认为花粉面积在 2 550 µm2
以上为未减数配子。本研究中，二倍体、三倍体和四倍体蝴蝶兰未减数雄配子也是以二分体和三分
体的形式产生，此外还发现三倍体、四倍体蝴蝶兰成熟花粉中存在大量微核配子，这是由于减数分
裂过程中产生染色体桥、染色体碎片和落后染色体所致，这与吴改娥等（2011）在辣椒枣上的研究
结果一致。
减数分裂异常是兰花未减数雄配子发生最主要的原因（Teoh，1980）。Teoh（1984）对鹤顶兰
属、虾脊兰属和苞舌兰属等兰花未减数雄配子及多倍体配子发生的细胞学机理进行了观察，发现减
数分裂前加倍，减数分裂Ⅰ、Ⅱ后期的失调，不进行减数分裂Ⅰ或Ⅱ以及减数分裂Ⅱ纺锤体的异常
导致未减数雄配子和多倍体配子的发生。本研究结果表明，不同倍性蝴蝶兰未减数雄配子发生是由
于小孢子母细胞不进行减数分裂Ⅰ或减数分裂Ⅱ纺锤体异常定向导致。由于本研究中采用的品种数
量比较少，蝴蝶兰中是否存在其它机制有待于进一步研究。

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