全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（4）：743–748 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–12–06；修回日期：2012–03–22
基金项目：国家自然科学基金项目（31171932）；国家重点基础研究发展计划项目（2011CB100606）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chenxs@sdau.edu.cn；Tel：0538-8249338）
苹果光敏色素作用因子基因 PIF 的克隆和分析
宋 杨，张艳敏，王传增，刘美艳，刘 金，王延玲，陈学森*
（山东农业大学作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）
摘 要：以短枝型苹果（Malus domestica Borkh.）为试材，采用 RT-PCR 结合 RACE 技术，克隆获得
一个光敏色素作用因子（PIF）基因，命名为 MdPIF。该基因编码区共 2 142 bp，推测其编码 713 个氨基
酸。氨基酸序列分析显示，在其 C 端具有保守氨基酸结构域 bHLH，N 端具有光敏色素结合域 APB，与
其它植物光敏色素结合因子有很高的同源性。实时荧光定量 PCR 分析表明，在花后 20 ~ 110 d，MdPIF
在短枝型和非短枝型苹果枝条均能表达，同一生长时期，短枝型苹果枝条的表达量显著低于非短枝型，
说明苹果短枝性状可能与 MdPIF 的差异表达有关。MdPIF 在叶片、枝条、花瓣、果实和芽中均能表达，
在不同器官中的表达量存在明显差异，在枝条中相对表达量最高，推测其可能主要调控苹果枝条的伸长。
关键词：苹果；短枝型；光敏色素作用因子；基因；克隆；表达
中图分类号：S 661.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）04-0743-06

Clone and Expression Analyzing of Phytochrome-interacting Factor Gene
PIF of Spur Type Apple
SONG Yang，ZHANG Yan-min，WANG Chuan-zeng，LIU Mei-yan，LIU Jin，WANG Yan-ling，and
CHEN Xue-sen*
（State Key Laboratory of Crop Biology，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract：A phytochrome-interacting factor（PIF）gene was isolate from the spur type apple（Malus
domestica Borkh.）by using RT-PCR and RACE method，the gene was named MdPIF，containing an open
reading frame（2 142 bp）and encoding a protein of 713 amino acid. Sequence analysis indicated that
MdPIF shared highly homology with bHLH family protein and the APB domain of phytochrome-
interacting. The real-time quantitative PCR analysis showed that MdPIF gene expressed in stem of spur
type apple trees during the 20–110 days after flowering. In the same development stage，the MdPIF was
lower expression in spur type apple stem than in non-spur type apple. The MdPIF gene was expressed in
leaf，stem，flower，fruit and bud of the spur type apple. However，the expression of the gene was different.
The relative expression level of MdPIF gene was up to the maximum value in the stem. The research
results suggested that the MdPIF gene play an important role during the stem developing of apple.
Key words：apple；spur-type；phytochrome-interacting factor；gene；cloning；expression

芽变选种是果树品种改良的重要途径之一，短枝型芽变品种的选择推动了世界苹果栽培模式的

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改革，使乔砧密植集约化栽培成为可能。
植物激素能够调控植物的许多生长发育过程（Richards et al.，2001；Olszewski et al.，2002），
与植物的短枝和矮化现象密切相关。光敏色素结合因子（PIF）是一类转录因子，具有 bHLH 结构域
和一个光敏色素结合域（APB），其中 15 个氨基酸能够结合 DNA，60 个氨基酸区域（HLH）用于
形成二聚体（Martínez-García et al.，2000；Quail，2000；Huq et al.，2004；Khanna et al.，2004）。
PIF 能够参与植物的光形态建成和赤霉素信号传导途径（Feng et al.，2008）。在光照条件下，低水平
的 PIF3 能够诱导光敏色素 B 的降解，降低植物对光的响应，从而调节拟南芥下胚轴的生长（Al-Sady
et al.，2008）。在拟南芥上，PIF3 基因能够与 DELLA 蛋白相互作用，共同调节拟南芥下胚轴的伸
长（Lucas et al.，2008）。DELLA 蛋白是植物茎伸长的负调控因子（Peng et al.，1999；Dill et al.，
2001），它能够与赤霉素相互作用，从而对植物生长起抑制作用（Dai & Xue，2010）。PIF 能够激活
拟南芥的 DELLA 蛋白基因 RGA（REPRESSOR of ga1-3），从而调节植物生长发育（Oh et al.，2007；
Josse et al.，2011）。PIF 是红光下光形态建成的调控因子（Huq & Quail，2002），既能够与光敏色素
相结合（Ni et al.，1998；Halliday et al.，1999；Kim et al.，2003；Bauer et al.，2004），又能够与植
物赤霉素信号传导途径中的关键基因相互作用（Feng et al.，2008），表明 PIF 是光合通路和赤霉素
信号传导通路的节点，能够激活其他基因的表达，对植物的生长和发育起非常重要的作用。
苹果短枝型芽变同很多芽变一样，是发生在一个基因位点上的突变，是一种由于体细胞遗传物
质突变而引起的遗传嵌合体基因突变（Meheriuk，1989）。目前，国内外对于苹果短枝型芽变机理的
研究主要集中在生理学（牛自勉和房耀仁，1994）和解剖学（杨佩芳 等，2000）等方面，但在分子
层面未见报道。本研究中克隆 PIF 基因，并进行组织特异性分析，同时对其在短枝型与非短枝型苹
果 4 个生长发育阶段的相对表达量进行分析，以探索其在短枝型苹果中的作用，为探讨苹果短枝型
芽变形成机理提供基本资料。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为‘长富 2 号’苹果（Malus domestica Borkh.）及其短枝型芽变‘龙富短枝’11 年生
树，砧木为八棱海棠。于花后 20、50、80 和 110 d 分别采集‘龙富短枝’及其对照‘长富 2 号’1
年生枝条的新梢部分，于液氮中速冻，–70 ℃冰箱保存备用。
工程菌 Escherichia coli DH5α 购自北京天根公司，克隆载体 pJET1.2/blunt 购自 Fermentas 公司，
Phusion DNA Polymerase 高保真聚合酶购于 New England Biolabs（NEB）公司，反转录试剂盒购自
Invitrogen 和 Fermentas 公司。
1.2 基因克隆和序列分析
参照 Cheng 等（1993）的方法，以花后 50 d‘龙富短枝’1 年生枝条新梢部分为材料提取总 RNA，
参照 Zhang 等（2008）的方法进行反转录和 RACE 扩增。利用 Invitrogen 公司 SuperscriptⅡ reverse
transcriptase 反转录酶合成 cDNA，–20 ℃保存备用。以拟南芥的 PIF3 的 cDNA 序列为信息，比对
苹果 EST 数据库，设计特异性引物 pMdPIF-F 和 pMdPIF-R 进行 PCR 扩增，PCR 反应条件为：98 ℃
预变性 3 min；98 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃延伸 10 min。参照 TaKaRa 凝
胶回收试剂盒回收 PCR 产物，回收产物连接到 pJET1.2/blunt 载体上，转化 E. coli DH5α 感受态细胞，
筛选阳性克隆，送上海生工生物技术有限公司测序。根据所得 cDNA 片段，设计特异性引物 GSP1
和 GSP2，锚定引物 Smart P1 和 Smart P2 进行巢式 PCR 扩增，回收、克隆并测序，序列拼接。再在
4 期 宋 杨等：苹果光敏色素作用因子基因 PIF 的克隆和分析 745

两端设计特异引物 MdPIF-F 和 MdPIF-R（表 1）扩增基因全长序列。利用 NCBI 网站的 BLASTx 程
序进行同源序列比对，DNASTAR 软件分析基因的 ORF 和氨基酸序列；MEGA5 软件进行系统进化
树构建。
1.3 基因组织特异性与表达分析
提取‘龙富短枝’苹果叶片、果实、花瓣、芽和 1 年生枝条新梢部分的总 RNA。根据 Fermentas
公司 RevertAid First strand cDNA synthesis 试剂盒说明书合成 cDNA。依据 MdPIF 的 ORF 全长设计
荧光定量引物 qPCR-MdPIF-F 和 qPCR-MdPIF-R（表 1），选取 MdActin（GenBank accession number
CN938024）为内参基因，采用两步法进行荧光定量 PCR。使用的仪器为 IQ5，所有 PCR 反应都设 3
次重复。PCR 反应体系为：SYBR GreenⅠ Master 10 μL，上、下游引物浓度为 0.5 μmol · L-1，模板
1 μL，加去离子水至 20 μL。PCR 反应程序为：94 ℃预变性 4 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30
s，40 个循环；每次循环第 3 步进行荧光采集，最后退火至 65 ℃，每隔 30 s 上升 0.5 ℃至 95 ℃变
性 1 min。试验结果用 2–ΔΔCT法对数据进行定量分析。荧光定量 PCR 程序和体系下同。
分别以‘龙富短枝’和‘长富 2 号’在花后 20、50、80 和 110 d 的 1 年生枝条新梢部分为材料，
提取总 RNA 并反转录为 cDNA 进行荧光定量 PCR，分析 MdPIF3 的表达情况。
表 1 引物用途及序列
Table 1 Application of primers and sequence
用途 Use 引物名称 Primer name 5′–3′序列 Sequence
扩增 MdPIF 基因中间片段 pMdPIF-F CCATCTTTCAGATCAAGGGTTTCG
Middle fragment amplification pMdPIF-R GTCCAATCTCAGGATGCTGCAACA
扩增 MdPIF 基因 5′端 GSP1 GACTCCTTTGGTGCACTACTGCTTG
5′-end amplification GSP2 CTAGTTGCAGCTGAAAACTTGTCC
Smart P1 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
Smart P2 ATCAACGCAGAGTGGCCATTATG
MdPIF 基因 ORF 扩增 MdPIF-F ATGCCTTTTTCCGAGCTTTATCGG
Complete ORF amplification MdPIF-R TTATCCGTTAGCTCTGTTGTTGTTAACATC
荧光定量 PCR qPCR-MdPIF-F ACCAAAGGAGTCAAATTCACAATG
Fluorescent quantitative PCR qPCR-MdPIF-R CTGAGCAAACAGAAGAAGCAACAA
MdActin-F TGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT
MdActin-R TACTCAGCTTTGGCAATCCACATC
2 结果与分析
2.1 苹果 MdPIF 基因克隆与序列分析
以拟南芥的 PIF3 基因（GenBank accession number NP_172424）cDNA 序列为信息探针，BLAST
搜索 GenBank（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov）的苹果 EST 数据库，对 EST 序列进行反复比对和
拼接，获得一条苹果的同源片段 pMdPIF。经 RT-PCR 验证，其长度为 1 628 bp，该片段包含终止密
码子。以 pMdPIF 为核心片段，利用特异性引物 GSP1、GSP2 和锚定引物 Smart P1、Smart P2 进行
巢式 PCR 扩增，获得一条特异性片段，经测序验证后表明，其精确长度为 1 040 bp，包含起始密码
子部分。最后利用特异性引物 MdPIF-F 和 MdPIF-R 扩增其开放读码框（ORF）全长，测序后其精
确长度为 2 142 bp。BLAST 比对结果表明，获得的 PIF 与其它植物光敏色素结合因子的同源性很高，
如与葡萄的同源性为 99%，与大豆的同源性为 98%，与拟南芥的同源性为 71%。
生物信息学分析表明，由苹果 PIF 的 ORF 区推导其编码的氨基酸序列上包含一个 60 个氨基酸
残基 basic Helix-Loop-Helix 保守区，并在 N 端存在一段光敏色素结合域（APB），推测该基因是 bHLH
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蛋白家族的光敏色素结合因子（图 1）。利用预测的氨基酸序列与 GenBank 上已登录物种的光敏色
素结合因子相应序列进行同源性比对分析，应用软件 MEGA5 构建系统树（图 2）。分析表明，苹果
PIF 与葡萄和大豆的亲缘关系较近，因此命名为 MdPIF，GenBank 登录号为 JN987874。
图 1 MdPIF 与其他植物的 APB 和 bHLH 结构域的相似性比对
红色框表示 APB 结构域的保守氨基酸序列；MdPIF3：苹果 JN987874；VvPIF3：葡萄 XP002276198；
GmPIF3：大豆 XP003536024；AtPIF3：拟南芥 NP172424；AtPIL1：拟南芥 Q8L5W8；AtPIF5：拟南芥 Q84LH8。
Fig. 1 Alignment of APB and bHLH region amino acid sequence of MdPIF with other related plants
The red outlined indicated the conserved amino acid sequencds of APB domain；MdPIF3：Malus domestica JN987874；
VvPIF3：Vitis vinifera XP002276198；GmPIF3：Glycine max XP003536024；AtPIF3：Arabidopsis thaliana NP172424；
AtPIL1：Arabidopsis thaliana Q8L5W8；AtPIF5：Arabidopsis thaliana Q84LH8.

















图 2 MdPIF 的系统进化分析
Fig. 2 Phylogenetic tree of MdPIF sequences with other related plants
4 期 宋 杨等：苹果光敏色素作用因子基因 PIF 的克隆和分析 747

图 3 短枝型苹果‘龙富短枝’不同组织器官中 MdPIF 转录水
平上的表达分析
Fig. 3 Expression analyzing of MdPIF in different tissues of
spur-type apple‘Longfu’at transcript levels
2.2 MdPIF 组织特异性分析
组织特异性分析（图 3）表明，MdPIF 在‘龙富短枝’的叶片、果实、花瓣、芽和一年生枝条
新梢中均能表达，但表达量存在明显差异，在新梢和果实中表达量最高，在芽中表达量次之。暗示
其可能调控苹果枝条的伸长和果实的生长发育。
2.3 苹果‘长富 2 号’及其短枝型芽变‘龙富短枝’枝条 MdPIF 相对表达量
在花后 20、50、80 和 110 d 提取‘龙富短枝’和‘长富 2 号’枝条的 RNA，进行荧光定量表
达分析。由图 4 可以看出，在花后 20 ~ 110 d 中的 4 个时间点，MdPIF 在‘龙富短枝’和‘长富 2
号’中均有表达。在同一生长季节和相同立地条件下，在花后 20 d 和 110 d，短枝型苹果和对照品
种 MdPIF 的差异表达明显，其相对表达量在‘龙富短枝’中显著低于‘长富 2 号’（P < 0.05）。上
述结果暗示了短枝型芽变的株形特性可能与 MdPIF 的表达量有关。

3 讨论
本试验采用同源克隆和 RACE 技术分离出一个 MdPIF 基因，其推测的蛋白质具有完整的 bHLH
蛋白家族的保守结构域和光敏色素结合域，表明它是 bHLH 蛋白家族中的光敏色素结合因子。同源
分析的结果表明，MdPIF 与葡萄、大豆和拟南芥 PIF3 基因具有较高的同源性。
苹果新梢在一年中有两次旺盛生长时期，即春节和秋季，在其它时期新梢的生长相对缓慢。新
梢在旺盛生长期时，如果调控枝条伸长的基因表达在此时发生变化，则会严重影响枝条的正常伸长。
本研究发现，在相同生长季节和栽培条件下，MdPIF 相对表达量在‘龙富短枝’和‘长富 2 号’间
有明显差异（图 4）。花后 20 和 110 d 时，在‘龙富短枝’中的表达量显著低于‘长富 2 号’，推测
在这两个时期，MdPIF 的下调表达导致 DELLA 蛋白的积累，从而抑制了苹果枝条的伸长，导致短
枝型现象的产生。但导致 MdPIF 下调表达的原因有待于进一步研究。

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图 4 短枝型苹果‘龙富短枝’和对照‘长富 2 号’枝条中 MdPIF
基因转录水平上的表达分析
Fig. 4 Expression analyzing of MdPIF in the stem of spur-type
apple‘Longfu’and‘Changfu 2’at transcript levels
P ＜ 0.05.
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