全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（5）：869–878 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–01–05；修回日期：2012–04–16
基金项目：国家自然科学基金项目（30972032）；国家‘973’项目（2009CB119000）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：axz@sdau.edu.cn；Tel：0538-8246218）
黄瓜 Rubisco 活化酶基因 CsRCA 表达载体构建
与遗传转化
刘培培 1，姜振升 2，王美玲 1，毕焕改 1，艾希珍 1,*
（1 山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018；2 山东金正大生态工程股份
有限公司，山东临沂 276700）
摘 要：核酮糖–1,5–二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）是光合碳循环中的关键酶，为了探明其在植
物体内的活化机制，用农杆菌介导法将 Rubisco 活化酶（RCA）基因 CsRCA 导入黄瓜，分别用 PCR、real-time
PCR 和 Western 杂交法进行分子检测，分析转基因植株的表达量。酶切鉴定结果显示，CsRCA 正向插入
植物表达载体 pCAMBIA1301 的 CaMV 35S 启动子和 NOS 终止子之间，成功构建 CsRCA 的正义表达载体。
将 pCAMBIA1301-CsRCA 导入黄瓜自交系‘08-1’，获得 7 株转基因植株，拷贝数均为 2（非转基因植株
的拷贝数为 1），转化率约为 3.5%。表达分析结果表明，7 株 T0 代转基因植株叶片的 CsRCA mRNA 表达
量为野生型（WT）的 1 ~ 1.98 倍，在蛋白水平的表达信号显著强于 WT。T1 代转基因植株的叶片叶绿素
和类胡萝卜素含量、光合速率（Pn）及可溶性糖和淀粉含量均显著高于 WT。研究结果表明，利用农杆菌
介导法获得了稳定遗传的黄瓜 CsRCA 转基因植株，CsRCA 过量表达能显著提高黄瓜叶片的 Pn，增加干物
质积累。
关键词：黄瓜；核酮糖–1,5–二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）；Rubisco 活化酶（RCA）；遗传转化；
过量表达
中图分类号：S 642.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）05-0869-10

Expression Vector Construction of Rubisco Activase Gene CsRCA and
Genetic Transformation to Cucumber
LIU Pei-pei1，JIANG Zhen-sheng2，WANG Mei-ling1，BI Huan-gai1，and AI Xi-zhen1,*
（1College of Horticulture Science and Engineering，State Key Laboratory of Crop Biology，Shandong Agricultural
University，Tai’an，Shandong 271018，China；2Shandong Kingenta Ecological Engineering Incorporated Company，Linyi，
Shandong 276700，China）
Abstract：Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/xygenase（Rubisco）is a key enzyme in the
photosynthetic carbon cycle. In order to elucidate the activating mechanism of Rubisco in plants，the
Rubisco activase gene CsRCA was introduced into inbred line of cucumber with the Agrobacterium-mediated
method. The transgenic plants were screened by PCR，and their expression in mRNA and protein level
were analysed by real-time PCR and western blot respectively. The restriction enzyme result showed that
the CsRCA was inserted into the binary vector pCAMBIA1301，a sense expression vector containing

870 园 艺 学 报 39 卷
CsRCA gene was constructed. The resulting plasmid was introduced into cucumber inbred lines‘08-1’，and
seven transgenic plants which contain two CsRCA copies were obtained（The wild type plants contain one
CsRCA copy）. The transformation rate was about 3.5%. The seven T0 transgenic cucumber plants showed
1–1.98 folds in CsRCA mRNA abundance and a significant increase in expression of protein level
compared with the wild type（WT）plants. CsRCA over expression led to significant increase in the pigment
content，photosynthetic rate（Pn），soluble sugar and starch contents in T1 transgenic plant leaves. These data
indicated that stable genetic CsRCA transgenic cucumber plants were obtained with Agrobacterium-mediated
method. CsRCA over expression increased the Pn and carbohydrate significantly in cucumber leaves．
Key words：cucumber；Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase（Rubisco）；Rubisco
activase（RCA）；genetic transformation；over expression

核酮糖–1,5–二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是光合作用中催化光合碳循环和光呼吸的第一
个酶，也是光合作用的限速酶，而 Rubisco 在植物体内的活性受 Rubisco 活化酶（RCA）的调节和
控制。因此，克隆 RCA 基因并进行遗传转化，对从分子水平上探明 RCA 基因过量表达对黄瓜生长
发育及光合作用等的促进效应具有重要意义。自从 1985 年 RCA 被发现以来（Salvucci et al.，1985），
人们对 RCA 的酶学特性、体内活化的作用和自身活性调节机制等进行了广泛研究（张国 等，2004；
Portis et al.，2008；李海霞 等，2010）。现已明确 RCA 是一种核基因编码的可溶性叶绿体蛋白，它
利用光合磷酸化生成的 ATP 使 Rubisco 迅速与生理浓度的 CO2、Mg2+结合形成 ECM（酶–CO2–
Mg）而达到最大活化程度。然而在多变的温光环境条件下，RCA 与 Rubisco 在植物体内的协同机制
还不够清楚。随着生物技术的发展，许多植物的 RCA 基因被克隆（Werneke et al.，1989；Rundle &
Zielinski，1991；To et al.，1999；Salvucci et al.，2003），人们试图通过分子生物学手段进一步认识
RCA 与 Rubisco 的互作关系及其在调节光合作用中的作用，验证能否通过改变 RCA 的催化能力来
提高 Rubisco 活力。Zhang 等（2002）利用农杆菌介导的真空渗透方法分别获得了转大亚基和小亚
基 cDNA 的正义拟南芥，发现仅表达大亚基的转基因拟南芥的表型与野生型拟南芥差不多，光合作
用也无明显差异；仅表达小亚基的转基因拟南芥的株高明显高于野生型拟南芥，尽管在饱和光强下
Rubisco 活力、含量和野生型差不多，但在低光强下 Rubisco 活力和 RuBP 含量不会下降。Sharma
和 Komatsu（2002）获得了转大亚基和小亚基 cDNA 的正义水稻，发现转小亚基的水稻长势明显比
转大亚基的和野生型水稻强。Wu 等（2007）也获得了转大亚基 cDNA 的正义水稻，发现其 Rubisco
活性、净光合速率、表观量子效率、电子传递速率等均显著提高，籽粒明显增大。黄瓜是我国日光
温室栽培的主要蔬菜，虽然其 RCA 基因早在 1992 年已被克隆（Preisig-Muller & Kindl，1992），但
由于其转化技术难度大，转化率低，遗传转化和表达特性的研究至今未见报道。本研究中构建了黄
瓜 RCA 基因正义表达载体，并通过农杆菌介导法对黄瓜进行遗传转化，获得了 RCA 基因过量表达
的转基因植株，为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料和 RCA 基因表达载体的构建
遗传转化用黄瓜自交系‘08-1’由山东农业大学园艺科学与工程学院曹辰兴老师惠赠。黄瓜叶
片 RCA 基因（CsRCA）由山东农业大学园艺科学与工程学院蔬菜光合生理实验室克隆。大肠杆菌
E. coli DH5α 和 BL21（DE3）PlysS 购自北京全式金生物技术有限公司。克隆载体 pMD18-T Vector
5 期 刘培培等：黄瓜 Rubisco 活化酶基因 CsRCA 表达载体构建与遗传转化 871

购自宝生物工程（大连）有限公司。植物表达载体 pCAMBIA1301、原核表达载体 pET-30a（+）和
农杆菌 LBA4404 由本实验室保存。Trizol 试剂盒、限制性内切酶、Taq 酶、T4 DNA 连接酶、DNA Maker
（DL 2000）和 ProteinRuler 等购自宝生物工程（大连）有限公司。凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂
盒购自北京天根（TIANGEN）生化科技有限公司。
根据 CsRCA 序列和载体序列设计带酶切位点的正义扩增引物（包含全部的编码区）。上游引物
RCAqc-1：CTGAGATCTTGGTTCAGACCCTCCTT（5′ 端含 BglⅡ酶切位点），下游引物 RCAqc-2：
CTAGGTCACCCATTACTGGAGGCAAAGC （ 5′ 端含 Bstp Ⅰ酶切位点）。用碱裂解法提取
pMD18T-CsRCA 和 pCAMBIA1301 质粒，分别用 BglⅡ和 BstpⅠ进行双酶切，电泳并回收目的基因
和 pCAMBIA1301 片段。用 T4 连接酶将目的基因与载体连接，转入大肠杆菌中，经 PCR 与酶切鉴
定筛选出重组子，构建正义表达载体 pCAM1301-CsRCA。将该表达载体用电激法转化农杆菌
LBA4404，经 Rif、Kan 筛选和 PCR 检测后用于黄瓜的遗传转化。
1.2 黄瓜的遗传转化
将黄瓜种子用水浸泡 4 ~ 6 h，在超净工作台上用 70%乙醇消毒 30 s，2%次氯酸钠（NaClO）溶
液消毒 15 min，无菌水冲洗 5 ~ 6 次后播种在 MS 培养基上，暗培养 48 h 后移至 28 ℃，50 ~ 60
μmol · m-2 · s-1 光下（16 h · d-1）培养 2 ~ 3 d，子叶脱离种壳后转化。
从含有 pCAM1301-CsRCA 的农杆菌平板上挑取单菌落于 20 mL YEP 液体培养基中（含 50
mg · L-1 Kan，50 mg · L-1 Rif），振荡培养 24 h（28 ℃，200 r · min-1）活化菌株。取 200 μL 菌液接种
至 YEP 液体培养基中，振荡 20 h 至对数生长期（OD600 为 0.6 ~ 0.8），离心（4 000 r · min-1，5 min），
收集菌体，并用 MS 液体培养基将其稀释至 OD600 为 0.2 左右。
切取黄瓜子叶节插入MS1培养基（MS + 6-BA 2.5 mg · L-1 + ABA 0.5 mg · L-1 + AgNO3 2 mg · L-1，
pH 5.7 ~ 5.8），光下预培养 1 d。将预培养的子叶节浸入农杆菌悬浮液中，15 min 后用无菌滤纸吸去
外植体表面多余的菌液，将其转入 MS2 培养基（MS1 + 100 μmol · L-1 AS），黑暗下共培养 2 d 后转
入 MS3 培养基（MS1 + Cef 200 mg · L-1），光下培养 3 d。最后将外植体转入含有潮霉素（Hyg）的
MS4 分化培养基（MS3 + Hyg 5 ~ 10 mg · L-1）中筛选抗性芽，7 ~ 10 d 更换一次培养基。待小芽长
至 1 ~ 1.5 cm 时，将其切下转入伸长生根培养基 MS5（MS + KT 0.2 mg · L-1 + IAA 0.5 mg · L-1，pH 5.7
~ 5.8）中诱导生根，10 ~ 15 d 继代一次。幼苗长至 5 ~ 6 cm 时移入灭菌基质中炼苗，5 ~ 7 d 后移至
日光温室中常规管理。
1.3 转基因植株的 PCR 鉴定
转基因植株长至 3 ~ 4 片真叶时用 CTAB 法提取基因组 DNA，以含目的基因的重组质粒为阳性
对照，非转基因植株为阴性对照，用 RCA 基因设计的引物 RCAqc-1 和 NOS（5′-GACCGGCAAC
AGGATTCAAT-3′）进行 PCR 检测。PCR 反应体系为：上下游引物各 1 μL，2 mmol · L-1 10 × PCR buffer
2.5 μL，2.0 mmol · L-1 MgCl2 2 μL，2.5 mmol · L-1 dNTPs 2 μL，Taq 聚合酶 0.25 μL，ddH2O 16.25 μL。
反应程序为 94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，30 个循环；
72 ℃延伸 10 min。取 10 μL PCR 产物，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测有无目的条带。
1.4 转基因植株 CsRCA 拷贝数检测
用 CTAB 法提取黄瓜基因组 DNA，用碱裂解法提取质粒 DNA。基因拷贝数检测参照李淑洁和
张正英（2010）的实时荧光定量 PCR（real-time PCR）法，做如下修改：选用未转基因的黄瓜基因
组 DNA 为内参基因标样，浓度 9 × 10-3 μg · μL-1，采用 5 倍比稀释，稀释倍数分别为 50、51、52、
872 园 艺 学 报 39 卷
53、54。外源基因以含 RCA 基因的质粒 DNA 为标样，浓度 1.8 × 10-2 μg · μL-1，采用 10 倍比稀释，
稀释倍数分别为 100、101、102、103、104。利用 SYBR GreenⅠreal-time PCR 同时对标样和转基因植
株进行扩增，根据得到的 Ct 值获得标准曲线。然后将每一样本中目的基因和内参基因的 Ct 值分别
代入标准曲线计算目的基因和内参基因的起始模板数，二者的比值即为目的基因在该转基因植株中
的拷贝数。
1.5 转基因黄瓜 CsRCA 的 mRNA 表达量测定
用 real-time PCR 法检测转基因黄瓜叶片中 CsRCA 在 mRNA 水平上的表达。用 Trizol 试剂盒提
取黄瓜叶片 RNA，并以 RNA 为模板，用 TIANScript RT Kit 获得 cDNA。根据 CsRCA 序列及内参
基因 actin，分别设计引物 RCA1（5′-AAAGTGGGCTGTAGGCGTTG-3′）、RCA2（5′-CTTTTCTATTG
TCATCTTCGGTTGG-3′），aF（5′-CCACGAAACTACTTACAACTCCATC-3′）、aR（5′-GGGCTGTGA
TTTCCTTGCTC-3′）。用 TaKaRa 公司的 SYBR® Primix Ex Taq™（Tli RNaseH Plus）试剂盒，Bio-Rad
公司的 iCycler iQ5 real-time PCR 仪检测 CsRCA 的 mRNA 表达。检测方法参照试剂盒说明书。
1.6 转基因黄瓜 CsRCA 的蛋白水平表达量检测
用 Western blot 法（Stewart et al.，2005）检测转基因黄瓜 CsRCA 在蛋白水平的表达量。根据
RCA 基因的编码区序列设计上游引物 YH1（5′-GATAGATCTGATGGCTGCCACGGTTTCAAC-3′）
和下游引物 YH2（5′-GCGAATTCCACTCATCATAATAGGGTTG-3′），将 PCR 产物与原核表达载体
pET-30a（+）分别用 BglⅡ和 EcoRⅠ进行双酶切。连接酶切产物，转化大肠杆菌 DH5α，经 PCR 和
酶切鉴定筛选阳性克隆 pET-CsRCA。然后将 pET-CsRCA 质粒转入 BL21 中，表达融合蛋白，利用
10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离目的蛋白，并将目的条带切下溶于 PBS 获得抗原，免
疫小白鼠后获得抗体并测定其效价。
用缓冲液[100 mmol · L-1 Tris-HCl（pH 8.0），0.1 mmol · L-1 EDTA-Na2，1% PVP，10 mmol · L-1
β-ME，0.2 mol · L-1 蔗糖]研磨叶片，提取植物总蛋白。将 2 × SDS 上样缓冲液与蛋白提取液等量混
合，煮沸 5 min，10 000 r · min-1 离心 30 s 后进行 SDS-PAGE。用湿转（PVDF 膜）法制备印迹膜，
将膜在超纯水中洗 1 ~ 2 min 后，放入封闭液中 4 ℃过夜，然后放入一抗溶液 37 ℃振摇 1 h。PBST
溶液漂洗 10 min，重复 3 次，再将印迹膜放入二抗溶液振摇 1 h，PBST 漂洗 3 次后，将印迹膜放入
洁净容器中，加入足量显色液完全覆盖膜表面，保温 10 min。用超纯水漂洗印迹膜，终止反应。100%
甲醇浸泡 10 s，从甲醇中取出放在滤纸上，直至干燥。观察结果并拍照。
1.7 转基因黄瓜生理指标的测定
用英国 PP-Systems公司生产的便携式光合仪Ciras-1测定日光温室条件（PFD 400 μmol · m-2 · s-1，
CO2 浓度 350 ~ 360 μL · L-1，叶温 25 ℃ ± 1 ℃）下黄瓜最佳功能叶（上数第 4 ~ 6 叶）的 Pn。PFD、
CO2 浓度、叶温分别由仪器的可调光源、内置式 CO2 供气系统和温度监控装置控制；用丙酮法（赵
世杰 等，2002）测定叶绿素 a、叶绿素 b 和类胡萝卜素含量；用蒽酮比色法（高俊凤，2006）测定
叶片可溶性糖和淀粉含量。
2 结果与分析
2.1 黄瓜 RCA 基因表达载体构建
用 BglⅡ和 BstpⅠ对重组质粒 pCAM1301-CsRCA 进行双酶切，经 1%琼脂糖凝胶电泳分析，得
5 期 刘培培等：黄瓜 Rubisco 活化酶基因 CsRCA 表达载体构建与遗传转化 873

到 2 031 bp 的目的条带（图 1，A），证明成功构建了 CsRCA 正义表达载体。将重组子通过电激法转
化农杆菌 LBA4404，菌液 PCR 检测结果显示，重组载体已成功转化到农杆菌中，可用于下一步黄
瓜的遗传转化（图 1，B）。

图 1 黄瓜 CsRCA 表达载体酶切鉴定（A）和农杆菌中重组质粒的 PCR 检测（B）
M：分子量标记。
Fig. 1 Restriction enzyme analysis of CsRCA expressing vector（A）and PCR detection of recombinant
plasmid from transformed LBA4404（B）
M：DNA marker（DL2000）.

2.2 黄瓜 CsRCA 原核表达载体构建与 SDS-PAGE 分析
将 562 bp 的 CsRCA 中间片段正向插入到 pET-30a（+）的 T7 启动子和 T7 终止子之间，构建
pET-CsRCA 表达载体。载体中含有 Kan 编码序列，因此该质粒的大肠杆菌具有卡那抗性。T7 启动
子下游有 lac 操纵子，受 IPTG 诱导，在 T7 启动子和 T7 终止子之间还有组氨酸标签，因此表达的
蛋白是含有组氨酸标签的融合蛋白。将重组质粒 pET-CsRCA 载体转入大肠杆菌 DH5α，筛选阳性克
隆。然后再通过 PCR 及 BglⅡ和 EcoRⅠ双酶切鉴定。结果显示，含该质粒的菌株扩增出和酶切出
562 bp 左右的目的条带（图 2）。将重组质粒 pET-CsRCA 测序，进一步证明 RCA 基因片段已正向插
入 pET-30a（+）T7 启动子和终止子之间。

图 2 pET-CsRCA 的 PCR（A）和酶切鉴定（B）
M：分子量标记。
Fig. 2 PCR（A）and restriction enzyme（B）analysis of pET-CsRCA
M：DNA marker（DL2000）.

将 pET-CsRCA 转入大肠杆菌 BL21 中，用 0.5 mmol · L-1 IPTG 37℃诱导 1、2、3 和 4 h，提取总
蛋白进行 SDS-PAGE 分析。结果显示（图 3），转基因的大肠杆菌有约 30 kD 的特异蛋白带（目的蛋
白 27.15 kD 加上两个组氨酸标签和一个硫标签），而 pET-30a（+）空载体没有此带。将该蛋白注射
Balb/c 纯系小白鼠 4 次，提取血清，获得效价为 1︰100 的一抗，可用于黄瓜中 RCA 蛋白的免疫分
析。
874 园 艺 学 报 39 卷


图 3 pET-CsRCA 原核表达 SDS-PAGE 分析
CK：pET-30a 经 IPTG 诱导 4 h；1 ~ 4：pET-CsRCA 经 IPTG 诱导 1、2、3 和 4 h；M：蛋白 Marker。
Fig. 3 SDS-PAGE analysis of pET-CsRCA expression in E. coli
CK：pET-30a induced by IPTG for 4 h；1–4：pET-CsRCA induced by IPTG for 1，2，3 and 4 h，respectively；M：Protein marker.

2.3 黄瓜的遗传转化与分子检测
将构建好的正义重组质粒经电激法转入农
杆菌 LBA4404 中。随机挑取抗 Kan 的单菌落，
PCR 筛选阳性克隆，通过农杆菌介导的叶盘法
转化黄瓜。对得到的抗性植株进行 PCR 检测，
有 7 株扩增出目的条带，而未转基因植株则无
特异性扩增条带，初步证明 RCA 基因已整合到
黄瓜染色体上，获得了具有 Hyg 抗性的 T0 代转
基因植株（图 4）。
对获得的转基因株系进行拷贝数分析（表
1），以内参基因标样，外源基因标样和转基因
植株的 DNA 为模板进行 real-time PCR 反应，
每个样品重复 3 次，得到各自的 Ct 值。以 Ct 值为 X 轴，起始模板拷贝数的对数为 Y 轴，分别建立
内参基因标准曲线 y =–0.2935x + 2.1317，R2 = 0.9965，PCR 扩增效率为 96.5%；外源基因的标准曲
线 y =–0.2743x + 0.0021，R2 = 0.9984，PCR 扩增效率为 88.1%。可见，模板 Ct 值与该模板拷贝数
的对数为线性关系，符合转基因植株拷贝数分析要求。根据标准曲线，分别得出样本中目的基因和
内参基因的起始模板量，通过比较发现，CsRCA 在非转基因植株中的拷贝数为 1，在 7 个转基因株
系中的拷贝数均为 2，进一步说明目的基因已成功插入黄瓜基因组中，插入拷贝数为 1，转化率为
3.5%。
表 1 转基因黄瓜 CsRCA 拷贝数
Table 1 Copies of CsRCA in transgenic cucumber lines
株系
Lines
Actin 起始模板数
Initial template copy of Actin
CsRCA 起始模板数
Initial template copy of CsRCA
CsRCA / Actin CsRCA 拷贝数
Copies of CsRCA
WT –3.278 –3.027 0.923 1
T0-1 –2.749 –5.397 1.963 2
T0-2 –2.398 –4.871 2.031 2
T0-3 –2.228 –4.837 2.171 2
T0-4 –2.461 –5.013 2.037 2
T0-5 –2.499 –4.715 1.887 2
T0-6 –2.915 –4.728 1.622 2
T0-7 –2.509 –4.978 1.984 2
图 4 T0 代转基因黄瓜的 PCR 检测
M：分子量标记；1：野生型；2 ~ 8：转基因植株。
Fig. 4 PCR detection of T0 transgenic cucumber plants
M：DNA Marker（DL2000）；1：Wild type；2–8：Transgenic cucumber
plants.
5 期 刘培培等：黄瓜 Rubisco 活化酶基因 CsRCA 表达载体构建与遗传转化 875

2.4 CsRCA 在转基因植株中的表达
在黄瓜 12 叶期提取叶片总 RNA，进行 real-time PCR 和 Western 杂交，检测 CsRCA 表达量。结
果表明，转基因黄瓜中 CsRCA 表达量较野生型明显增加（图 5），其中转基因植株 T0-2 的 mRNA
表达量最高，为野生型的 1.98 倍；T0-3 和 T0-6 其次，分别为野生型的 1.83 和 1.78 倍；T0-5，T0-7
略低，为野生型的 1.62 ~ 1.70 倍；T0-4 为野生型的 1.33 倍，T0-1 的表达量与野生型无明显差异。
各株系在蛋白水平的表达信号的差异与 mRNA 表达量一致。

图 5 T0 代转基因黄瓜的实时荧光定量（A）和 Western 杂交检测（B）
WT：对照；T0-1、T0-2、T0-3、T0-4、T0-5、T0-6、T0-7：转基因黄瓜株系。
Fig. 5 Real-time PCR（A）and Western blot（B）of T0 transgenic cucumber plants
WT：Wild type；T0-1，T0-2，T0-3，T0-4，T0-5，T0-6，T0-7：Transgenic cucumber lines.

2.5 CsRCA 过表达对黄瓜光合速率与叶绿素和类胡萝卜素含量的影响
2.5.1 对光合速率的影响
选择 3 个转 CsRCA T0 代株系后代 T1-2、T1-3 和 T1-7，于播种后 70 d 测定功能叶 Pn。结果表
明，转基因株系 T1-2、T1-3 和 T1-7 的 Pn 分别比野生型提高 34.3%、22.2%和 10.0%（表 2），即随
着 CsRCA mRNA 表达量的增加而增加。可见 T1 代转基因株系 Pn 与 CsRCA mRNA 表达量呈正相关。
2.5.2 对色素含量的影响
由表 2 看出，3 个转正义 CsRCA 黄瓜株系 T1-2、T1-3、T1-7 的叶绿素 a 含量分别比野生型的增
加 29.1%、23.4%和 14.9%；类胡萝卜素含量也明显高于野生型，而叶绿素 b 含量与野生型的差异不
显著，表明转基因黄瓜 Pn 的升高与叶绿素 a 含量增加有关。
表 2 野生型和转基因黄瓜叶片的净光合速率和叶绿素、类胡萝卜素含量
Table 2 The photosynthetic rate（Pn）and chlorophyll and carotenoids contents of wild type and transgenic cucumber leaves
株系
Lines
Pn/
（μmol · m-2 · s-1）
Chl.a/
（mg · g-1 FW）
Chl.b/
（mg · g-1 FW）
Chl.a + Chl.b/
（mg · g-1 FW） Chl.a/Chl.b
Car/
（mg · g -1 FW）
WT 9.9 ± 0.28 d 1.41 ± 0.03 d 0.34 ± 0.01 a 1.75 ± 0.01 d 4.18 ± 0.18 d 0.39 ± 0.02 c
T1-2 13.3 ± 0.10 a 1.82 ± 0.02 a 0.39 ± 0.03 a 2.21 ± 0.03 a 4.72 ± 0.38 a 0.47 ± 0.02 a
T1-3 12.1 ± 0.26 b 1.74 ± 0.02 b 0.38 ± 0.04 a 2.12 ± 0.06 b 4.66 ± 0.46 b 0.44 ± 0.01 ab
T1-7 10.9 ± 0.21 c 1.62 ± 0.04 c 0.37 ± 0.03 a 1.99 ± 0.07 c 4.39 ± 0.31 c 0.42 ± 0.01 b
注：图中数据为均值 ± 标准差，不同字母表示差异达显著水平（P < 0.05）。
Note：All values shown are mean ± SD. The different letters indicate that mean values are significantly different among samples（P < 0.05）.
876 园 艺 学 报 39 卷
2.6 CsRCA 过量表达对黄瓜叶片糖和淀粉含量的影响
图 6 显示，3 个转 CsRCA 黄瓜株系的可溶性糖含量均显著高于 WT，其中 T1-2 的最高，T1-3
其次，T1-7 略低，分别比 WT 高 25.4%、19.4%和 10.8%。转基因黄瓜株系的淀粉含量也明显高于
WT，T1-2、T1-3 和 T1-7 增加量分别为 39.3%、27%和 13.7%。可见，CsRCA 过量表达有利于黄瓜
叶片中碳水化合物的形成和积累。

图 6 野生型和转基因黄瓜叶片可溶性糖含量（A）和淀粉含量（B）
WT：野生型；T1-2、T1-3 和 T1-7：T1 代转基因株系。
Fig. 6 The soluble sugar content（A）and the starch content（B）of wild type and transgenic cucumber leaves
WT：Wild type；T1-2，T1-3 and T1-7：T1 progeny transgenic lines.
3 讨论
农杆菌介导法广泛应用于植物的遗传转化，是当前最常用最有效的转化方法，但是在黄瓜中的
应用技术还不成熟。虽然人们已对黄瓜子叶、真叶、下胚轴等进行了再生体系的研究（杜胜利 等，
2000；何晓明和林毓娥，2001；梅茜和张国兴，2002）。但因选用激素种类和浓度不一致，抗生素选
择压难以确定等问题，黄瓜体细胞离体培养仍较困难，尚未建立一个固定高效的遗传转化体系，多
数人认为转化难度较大。
本试验结果表明，影响黄瓜幼芽再生和转化的因素主要有 3 个方面：（1）用 4 ~ 5 d 苗龄的子叶
节作为再生体，不定芽发生频率较高。（2）MS 培养基中同时添加 2.5 mg · L-1 6-BA、0.5 mg · L-1 ABA
和 2 mg · L-1 AgNO3，可使外植体不经愈伤组织直接分化成芽，可显著提高芽的诱导率和再生率，这
与王艳蓉等（2006）的研究结果相似。（3）抗生素浓度是遗传转化体系的关键因素。本试验结果表
明，培养初期用低浓度的潮霉素，之后随着幼苗的生长，逐渐提高浓度，既避免了初期由于选择压
过高而出现假阴性，又防止后期选择压过低出现过多的假阳性植株。崔波等（2008）研究发现，KT
对幼芽伸长的促进作用优于 6-BA。本研究中在培养后期用 0.2 mg · L-1 KT 代替 6-BA，并与 0.5
mg · L-1 IAA 配合，发现再生苗的伸长与生根可同时进行，从生根到开始炼苗只需两周，大大缩短了
培养周期，最终成功建立了一个快速高效的黄瓜子叶节再生和转化体系。
外源基因的稳定遗传和表达是利用基因工程培育新品种的关键。转基因植株中外源基因的拷贝
数常影响目的基因的表达水平和遗传稳定性。一般单拷贝或低拷贝基因作为显性基因遗传给后代
（Bavage et al.，2002；Pacurar et al.，2008），而多拷贝基因易在转基因植物当代或后代受到抑制，
表现为外源基因沉默（Stempak et al.，2005）。Southern 杂交是一种传统的检测外源基因拷贝数的方
法，但其工作量大，需要的 DNA 材料较多。Real-time PCR 法是一种新的 DNA 定量方法。研究发
现，这两种方法检测转基因拷贝数时结果十分接近，而且前人认为，用 Real-time PCR 法检测的结
5 期 刘培培等：黄瓜 Rubisco 活化酶基因 CsRCA 表达载体构建与遗传转化 877

果可能更接近客观事实（Song et al.，2002；Weng et al.，2004；王育花 等，2007）。本试验中采用
Real-time PCR 法测得转基因株系中 CsRCA 的拷贝数均接近 2，说明该基因以单拷贝插入转基因黄
瓜中（非转基因植株中的 CsRCA 拷贝数为 1），这有利于 CsRCA 的稳定遗传。通过对 T1 代转基因
植株的 PCR 检测，也初步证实目的基因已稳定遗传（数据未列出）。
Martínez-Barajas 等（1997）研究发现，玉米低产品系中 RCA 含量很低，若人为提高 RCA 水平，
则 Rubisco 和 Pn 都随之上升，产量也增加。Yin 等（2010）指出，在大豆重组自交系中，GmRCAα
的表达水平与光合能力和种子产量呈显著正相关，GmRCAβ 为极显著正相关，认为 RCA 基因在调
节大豆光合能力和种子产量中发挥重要作用。本研究结果显示，CsRCA 过量表达可显著提高黄瓜叶
片的 Pn，可溶性糖及淀粉含量明显增加，且 Pn、可溶性糖和淀粉含量均随着 CsRCA 表达量的增加
而增加，表明 CsRCA 过量表达对黄瓜生长发育及光合作用具有明显的促进效应。CsRCA 过表达植
株叶片的光合酶活性及其互作机理有待进一步研究。

Reference
Bavage A D，Buck E，Dale P，Moyes C，Senior I. 2002. Analysis of a backcross population from a multi-copy transgenic Brassica napus line.
Euphytica，124 (3)：333–340.
Cui Bo，Liang Fang，Cheng Xi-mei，Yuan Li-jie，Ye Yong-zhong. 2008. The establishment of regeneration system in vitro from cotyledonary nodes
of Cucumis sativus L，Henan Science，26 (3)：288–290. (in Chinese)
崔 波，梁 芳，程喜梅，袁丽洁，叶永忠. 2008. 黄瓜子叶节离体再生体系的建立. 河南科学，26 (3)：288–290.
Du Sheng-li，Wei Hui-jun，Wei Ai-min，Wang Yan-fei，Ma De-hua，Huo Zhen-rong. 2000. Effects of seedling stage，genotype and explant type on
in vitro somatic organogenesis of cucumber. Tianjin Agricultural Sciences，6 (4)：1–5. (in Chinese)
杜胜利，魏惠军，魏爱民，王艳飞，马德华，霍振荣. 2000. 苗龄、基因型和外植体类型对黄瓜离体器官发生的影响. 天津农业科，6 (4):
1–5.
Gao Jun-feng. 2006. Experimental guide of plant physiology. Beijing：Higher Education Press：144–148. (in Chinese)
高俊凤. 2006. 植物生理学实验指导. 北京：高等教育出版社：144–148.
He Xiao-ming，Lin Yu-e. 2001. In vitro culture of cotyledon and hypocotyl in Cucumis sativus. Plant Physiology Communications，37 (5)：423–424.
(in Chinese)
何晓明，林毓娥. 2001. 黄瓜子叶和下胚轴的离体培养. 植物生理学通讯，37 (5)：423–424.
Li Hai-xia，Wang Zhen-mei，Zeng Han-lai. 2010. The research progresses in Rubisco activase in plant. Plant Physiology Communications，46 (11)：
1092–1100. (in Chinese)
李海霞，王真梅，曾汉来. 2010. 植物 Rubisco 活化酶的研究进展. 植物生理学通讯，46 (11)：1092–1100.
Li Shu-jie，Zhang Zheng-ying. 2010. Using Real-time PCR to determine transgene copy number in wheat. China Biotechnology，30 (3)：90–94. (in
Chinese)
李淑洁，张正英. 2010. Real-time PCR 方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数. 中国生物工程杂志，30 (3)：90–94.
Mei Qian，Zhang Xing-guo. 2002. Studies on tissue culture of cucumber. Journal of Southwest Agricultural University，24 (3)：266–267. (in
Chinese)
梅 茜，张兴国. 2002. 黄瓜组织培养研究. 西南农业大学学报，24 (3)：266–267.
Martínez-Barajas E，Molina-Galán J，de Jiménez E S. 1997. Regulation of Rubisco activity during grain-fill in maize：Possible role of Rubisco
activase. The Journal of Agricultural Science，128：155–161.
Portis A R Jr，Li C S，Wang D F，Salvucci M E. 2008. Regulation of Rubisco activase and its interaction with Rubisco. Journal of Experimental
Botany，59：1597–1604.
Preisig-Muller R，Kindl H. 1992. Sequence analysis of cucumber cotyledon ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase activease cDNA.
Biochim Biophys Acta，1171：205–206.
Pacurar D I，Thordal C H，Nielsen K K，Lenk I. 2008. A high-throughput Agrobacterium-mediated transformation system for the grass model species
878 园 艺 学 报 39 卷
Brachypodium distachyon L. Transgenic Research，17：965–975.
Rundle S J，Zielinski R E. 1991. Organization and expression of two tandemly oriented genes encoding ribulose bisphosphate carboxylase/
oxygenase activase in barley. The Journal of Biological Chemistry，266：4677–4685.
Salvucci M E，Portis A R Jr，Ogren W L. 1985. A soluble chloroplast protein catalyzes ribulosebisphosphate carboxylase/oxygenase activation in vivo.
Photosynthesis Research，7：193–201.
Salvucci M E，van de Loo F J，Stecher D. 2003. Two isoforms of Rubisco activase in cotton，the products of separate genes not alternative splicing.
Planta，216：736–744.
Sharma A，Komatsu S. 2002. Involvement of a Ca2+-dependent protein kinase component downstream to the gibberellin-binding phosphoprotein,
Rubisco activase，in rice. Biochemical and Biophysical Reserarch Communications，290：690–695.
Stewart J，Curtis J，Spurck T P，Garami，A，Baldwin，T，Courret N，McFadden G I，Davis A，Handman E. 2005. Characterisation of a Leishmania
mexicana knockout lacking guanosine diphosphate mannose pyrophosphorylase. International Journal for Parasitology，35：861–873.
Stempak J M，Sohn K J，Chiang E P，Shane B，Kim Y I. 2005. Cell and stage of transformation-specific effects of folate deficiency on methionine
cycle intermediates and DNA methylation in an in vitro model. Carcinogenesis，26 (5)：981–990.
Song P，Cai C Q，Skokut M，Kosegi B D，Petolino J F. 2002. Quantitative real-time PCR as a screening tool for estimating transgene copy number
in WHISKERSTM-derived transgenic maize. Plant Cell Reports，20：948–954.
To K Y, Suen D F，Grace-Chen S C. 1999. Molecular characterization of ribulose-1，5-bisphosphatec-arboxylase/oxygenase activase in rice leaves.
Planta，209：66–76.
Werneke J M，Chatfield J M，Ogren W L. 1989. Alternative mRNA splicing generates the two ribulosebisphosphate carboxylase/oxygenase activase
polypeptides in spinach and Arabidopsis. Plant Cell，1：815–825.
Wu H R，Li L B，Jing Y X，and Kuang T Y. 2007. Over- and anti-sense expressions of the large isoform of ribulse-1，5-bisphosphate carboxylase/
oxygenase activase gene in Oryza Sativa affect the photosynthetic capacity. Photosynthetica，45 (2)：194–201.
Wang Yan-rong，Chen Li-mei，Pan Jun-song，He Huan-le，Cai Run. 2006. Establishment of high effective regeneration system in Cucumber（Cucumis
sativus L.）and Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation. Journal of Shanghai Jiao Tong University：Agricultural Science，
24 (2)：152–164. (in Chinese)
王艳蓉，陈丽梅，潘俊松，何欢乐，蔡 润. 2006. 黄瓜子叶高效再生体系的建立和遗传转化. 上海交通大学学报：农业科学版，24 (2)：
152–164.
Weng Hai-bo，Pan Ai-hui，Yang Li-tao，Zhang Cheng-mei，Liu Zhi-li，Zhang Da-bing. 2004. Estimating number of transgene copies in transgenic
rapeseed by real-time PCR assay with HMG I/Y as an endogenous reference gene. Plant Molecular Biology Reporter，22：289–300.
Wang Yu-hua，Zhao Sen，Chen Fen，Xiao Guo-ying. 2007. Estimation of the copy number of exogenous gene in transgenic rice by real-time
fluorescence quantitative PCR. Life Science Research，11 (4)：301–305. (in Chinese)
王育花，赵 森，陈 芬，肖国樱. 2007. 利用实时荧光定量 PCR 法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究. 生命科学研究，11 (4)：
301–305.
Yin Z T，Meng F F，Song H N，Wang X L，Xu X M，Yu D Y. 2010. Expression quantitative trait loci analysis of two genes encoding rubisco activase
in soybean. Plant Physiology，152：1625–1637.
Zhang Guo，Wang Wei，Zou Qi. 2004. Molecular biology of rubisco activase. Plant Physiology Communications，40 (5)：633–637. (in Chinese)
张 国，王 玮，邹 琦. 2004. Rubisco 活化酶的分子生物学. 植物生理学通讯，40 (5)：633–637.
Zhang N，Kallis R P，Ewy R G，Portis A R Jr. 2002. Light modulation of Rubisco in Arabidopsis requires a capacity for redox regulation of the larger
Rubisco activase isoform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，99：3330–3334.
Zhao Shi-jie，Shi Guo-an，Dong Xin-chun. 2002. Experimental guide of plant physiology. Beijing：China Agricultural Science and Techonlogy Press：
55–57. (in Chinese)
赵世杰，史国安，董新纯. 2002. 植物生理学实验指导. 北京：中国农业科学技术出版社：55–57.