全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（1）：127–134 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–08–01；修回日期：2011–11–30
基金项目：国家自然科学基金项目（30900115，31070275）；中央高校基本科研业务费专项基金项目（DL09BA08）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lanxingguo@126.com；lyhshen@126.com）
羽衣甘蓝 Exo70A1 基因的分离及表达分析
杨 佳，蓝兴国*，郝艾馨，李玉花*
（东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）
摘 要：以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）自交不亲和系（S13-bS13-b）为试材，从柱头中
分离 Exo70A1 基因，命名为 BoExo70A1，GenBank 登录号为 JF919716。BoExo70A1 全长 cDNA 序列为
2 184 bp，包含 56 bp 的 5′非编码区，211 bp 的 3′非编码区和一个长度为 1 917 bp 的开放读码框（ORF），
对应编码一个含有 638 个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列比对分析表明，羽衣甘蓝 BoExo70A1 与油菜
BnExo70A1、拟南芥 AtExo70A1 的一致性分别为 99%和 94%；BoExo70A1 基因结构含 12 个外显子和 11
个内含子，内含子 5′供体位点和 3′受体位点边界序列符合 GU-AG 规则；Southern 杂交结果显示，BoExo70A1
在羽衣甘蓝基因组中存在多拷贝；Northern 杂交结果显示 BoExo70A1 在茎、叶、花瓣、花药、柱头、花
柱和子房中表达，而且在叶中的表达量最低。
关键词：羽衣甘蓝；Exo70A1；序列分析；表达分析
中图分类号：S 681.9 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）01-0127-08

Isolation and Expression Analysis of Exo70A1 of Ornamental Kale
YANG Jia，LAN Xing-guo*，HAO Ai-xin，and LI Yu-hua*
（College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）
Abstract：The Exo70A1 gene（BoExo70A1）was isolated from stigma of ornamental kale（Brassica
oleracea var. acephala）S13-b homozygotes，whose GenBank accession number is JF919716. BoExo70A1
cDNA was 2 184 bp in the full length，which contained a 5′-untranslated region（5′-UTR）of 56 bp，a
3′-UTR of 211 bp，and an opening reading frame of 1 917 bp encoding a 638 predicted amino acids residue
protein. The deduced amino acid sequence of BoExo70A1 shared 99% and 94% identity with Brassica
napus Exo70A1 and Arabidopsis thaliana Exo70A1，respectively. The genomic structure of BoExo70A1
contained 12 exons and 11 introns with boundary sequences of GU at 5′ site and AG at 3′ site，which
complied with the typical‘GU-AG rule’in plants. Southern hybridization analysis showed that there were
multiple copies of BoExo70A1 gene in genome. Northern hybridization analysis showed that the
BoExo70A1 was ubiquitous expressed in stem，petal，anther，stigma，style and ovary，as well as a relative
low expression in leaf.
Key words：Brassica oleracea var. acephala；Exo70A1；sequence analysis；expression analysis

真核生物的内膜系统和质膜间的囊泡运输是由栓留因子（tethering factors）参与调节的。栓留因

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子能够与 SNARE 蛋白（soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment protein receptor）和小
GTPase 相互作用，在囊泡运输过程中使囊泡和内膜区室联系起来，在囊泡的锚定和停靠过程中发挥
重要的作用（Sztul & Lupashin，2006；Cai et al.，2007；Bröcker et al.，2010）。动物细胞含有两类
栓留因子：一类是含有大量卷曲螺旋（coiled-coil）结构域的蛋白，另一类是大的多亚基复合体
（Kümmel & Heinemann，2008；Brown & Pfeffer，2010）。其中研究最为深入和进展最快的是 Exocyst
复合体，它在细胞胞吐和囊泡转运过程中发挥重要作用（Munson & Novick，2006；He & Guo，2009；
Bendezú & Martin，2011）。
Exocyst 复合体的功能在酵母和动物细胞中被广泛的研究（Hsu et al.，2004），主要在细胞需要
大量胞外分泌来维持快速的极性生长的过程中发挥作用，如酿酒酵母的出芽生殖（TerBush &
Novick，1995），白色念球菌菌丝的顶端生长（Li et al.，2007），哺乳动物神经轴突的生长等（Pommereit
& Wouters，2007）。Exocyst 复合体由 Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10、Sec15、Exo70 和 Exo84 组
成，这 8 个亚基在真核生物中保守存在（TerBush et al.，1996；Guo et al.，1999；Matern et al.，2001；
Elias et al.，2003；Zárský et al.，2009；Zhang et al.，2010）。目前的研究表明植物的 Exocyst 复合体
与酵母和哺乳动物的 Exocyst 复合体具有相似的功能，在植物的生长发育过程中起到重要的作用
（Cole et al.，2005；Hála et al.，2008；Fendrych et al.，2010；Kulich et al.，2010；Wang et al.，2010；
Zárský & Potocký，2010；Pecenková et al.，2011）。在酵母和哺乳动物细胞中，Exocyst 复合体的各
亚基的基因拷贝数是单一的，而植物中的 Exocyst 复合体各亚基含有的拷贝数相对复杂，如拟南芥
含有 23 个 Exo70 基因，水稻含有 41 个 Exo70 基因（Synek et al.，2006；Chong et al.，2010）。这些
Exo70 基因家族中的成员，可能通过不同的表达活性和结构特征，参与调控不同的生物学过程（Li et
al.，2010）。
目前，Exo70A1 是 Exo70 基因家族中研究较为深入的，拟南芥 Exo70A1 突变体的植株矮小，各
器官比野生型小，顶端优势减弱，表现为无序生长，植株不育（Synek et al.，2006）。此外还发现
Exo70A1 在根毛和柱头乳突细胞的极性生长、下胚轴的伸长、花粉—柱头间的相互作用等过程中都
起到重要的作用（Synek et al.，2006；Samuel et al.，2009）。最近 Exo70A1 在油菜中被鉴定出来并
且被认为是自交不亲和性（Self-incompatibility，SI）反应的负调控因子，参与调控授粉反应（Samuel
et al.，2009）。因此，对 Exo70A1 基因的克隆和表达特性的研究有着重要的意义。本研究中以羽衣
甘蓝自交不亲和系（S13-bS13-b）为研究试材，利用 RT-PCR 和 RACE 技术分离羽衣甘蓝 Exo70A1 基
因并对其序列及表达进行分析，为进一步探讨羽衣甘蓝 Exo70A1 基因的生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
羽衣甘蓝自交不亲和系（S13-bS13-b）于 2009 年 6 月—2010 年 5 月种植于东北林业大学花卉生物
工程研究所（蓝兴国 等，2009，2011）。2010 年 2—4 月为羽衣甘蓝开花时期，取当天的花蕾，用
镊子剥取花瓣、花药、柱头、花柱和子房，并取植株的茎和嫩叶，液氮速冻后–80 ℃保存备用。
1.2 羽衣甘蓝 Exo70A1 基因的分离
1.2.1 羽衣甘蓝 Exo70A1全长 cDNA的分离
利用 CTAB 法提取羽衣甘蓝柱头总 RNA（蓝兴国 等，2009）。以 DNaseⅠ酶（RNase free）消
化处理后的柱头总 RNA 为模板，采用 AMV 反转录酶（TaKaRa）和锚定引物 Oligo (dT)18 进行 RNA
1 期 杨 佳等：羽衣甘蓝 Exo70A1 基因的分离及表达分析 129

反转录，程序为：42 ℃孵育 30 min，99 ℃变性 5 min，4 ℃孵育 5 min。根据油菜 BnExo70A1 的 5′
和3′末端编码区设计Exo70A1特异性引物BoExo70A1-S和BoExo70A1-X（表1）（Samuel et al.，2009），
以反转录产物 cDNA 第 1 链为模板，利用 LA Taq DNA 聚合酶（TaKaRa）进行 PCR 扩增。扩增条
件为：94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，共 35 个循环后，72 ℃
延伸 7 min。PCR 产物用 E.Z.N.A.TM Gel Extract kit 回收，与 pGEM-T 载体连接，转化到 Top10 菌株
中，通过蓝白斑筛选，挑选阳性克隆并进行核酸序列测定（北京华大基因）。
根据所得的 Exo70A1 cDNA（BoExo70A1）序列设计 5′RACE 特异引物 BoExo70A1-5′GSP1 和巢
式引物BoExo70A1-5′GSP2，及 3′RACE特异引物BoExo70A1-3′GSP1和巢式引物BoExo70A1-3′GSP2
（表 1），按照 RACE 试剂盒 MarathonTM cDNA Amplification Kit 说明书进行 cDNA 末端快速扩增。
利用试剂盒接头引物 AP1 和 AP2，采用 Touchdown PCR 和嵌套 PCR 程序进行扩增。将获得的中间
序列和末端序列拼接 cDNA 全长序列，在 NCBI 网站上 BLAST 比对，利用在线软件 ProtParam
（http：//www. expasy. org）预测所编码蛋白的分子量、理论等电点及保守结构域等。

表 1 羽衣甘蓝 BoExo70A1 基因克隆及表达分析所用引物
Table 1 Primers used to clone and expression analysis of BoExo70A1 from ornamental kale
引物名称
Primer name
引物序列（5′–3′）
Primer sequence
作用
Function
AP1 CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC 3′RACE和5′RACE接头引物 Adaptor primers for 3′RACE and 5′RACE
AP2 ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC
BoExo70A1-D1-S CAACTTCGCTAATCGACGGC DNA片段扩增及BoExo70A1的Southern和Northern分析 For the DNA
fragment amplification and Southern blot analysis and Northern analysis of
BoExo70A1
BoExo70A1-D1-R GTCCCGCATTATCTCATACAT DNA片段扩增 For the DNA fragment amplification
BoExo70A1-D2-S ATGTATGAGATAATGCGGGAC DNA片段扩增 For the DNA fragment amplification
BoExo70A1-D2-R CAAGAAGCTAAATACAGACAG DNA片段扩增及BoExo70A1的Southern分析 For the DNA fragment
amplification and Southern blot analysis of BoExo70A1
BoExo70A1-P1-R CTGAGTGGGACGCATGGC BoExo70A1的Southern及Northern分析 Southern blot analysis and
Northern analysis of BoExo70A1
BoExo70A1-P2-S GCCTCTGGTTGAGAGTGGG BoExo70A1的Southern分析 Southern blot analysis of BoExo70A1
BoExo70A1-S ATGGCCGTCGATAGCGGAATG 编码区片段扩增 For the coding region fragment amplification
BoExo70A1-X GTTGACAGAAGAGACAGAAGAG
BoExo70A1-3′GSP1 GGTTGACAAAGCGGCTGGCGCAGAC 3′端巢式扩增 Nest amplification of 3′ end
BoExo70A1-3′GSP2 ACAGCAGCGGAGTTTCGAGAGGGTTAC
BoExo70A1-5′GSP1 CGCCAGCCGCTTTGTCAACCCCGTA 5′端巢式扩增 Nest amplification of 5′ end
BoExo70A1-5′GSP2 CGTGGGCTTTTCCATTACCCTCACCGTC

1.2.2 基因组 BoExo70A1的分离
取羽衣甘蓝新鲜的嫩叶，用CTAB法提取基因组DNA（蓝兴国 等，2009）。根据所得的BoExo70A1
全长 cDNA 序列，分两段设计特异性引物 BoExo70A1-D1-S、BoExo70A1-D1-R 和 BoExo70A1-D2-S、
BoExo70A1-D2-R（表 1），分别用 LA Taq DNA 聚合酶（TaKaRa）进行 PCR 扩增。反应条件：94 ℃
变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，35 个循环后，72 ℃延伸 7 min。PCR 产物回收后，插
入到 pGEM-T 载体中，连接产物转化大到肠杆菌 Top10 中，选择阳性克隆进行测序。
1.3 羽衣甘蓝 BoExo70A1 的 Southern 杂交分析
提取叶片组织基因组 DNA 40 µg，分别用 BamHⅠ、EcoRⅠ、XbaⅠ、Hind Ⅲ限制性内切酶进
行消化后，用 0.7 g · L-1 琼脂糖凝胶电泳分离；然后将 DNA 片段转移到 HybondTM-N 尼龙膜上。分
别根据BoExo70A1序列的 5′末端和 3′末端设计两对探针引物：BoExo70A1-D1-S和BoExo70A1-P1-R；
BoExo70A1-P2-S 和 BoExo70A1-D2-R（表 1）。用地高辛标记，凝胶在变性液（0.5 mol · L-1 NaOH
130 园 艺 学 报 39 卷
和 1.5 mol · L-1 NaCl）中处理后，65 ℃水浴锅中过夜杂交。杂交后，用 2% SSC 和 0.1% SDS 的溶液
室温下洗膜两次，每次 5 min；再用 0.1% SSC 和 0.1% SDS 溶液 65 ℃洗 30 min，进行 X 光片显影。
1.4 羽衣甘蓝 BoExo70A1 的 Northern 杂交分析
分别提取羽衣甘蓝茎、叶、花瓣、花药、柱头、花柱和子房的总 RNA 10 µg，用 0.7 g · L-1 琼脂
糖凝胶电泳分离；然后将 RNA 片段转移到 HybondTM-N 尼龙膜上；探针是利用 BoExo70A1 序列的
5′末端设计的引物 BoExo70A1-D1-S 和 BoExo70A1-P1-R（表 1），地高辛标记获得；尼龙膜在 65 ℃
水浴锅中过夜杂交；杂交后，用 2% SSC 和 0.1% SDS 的溶液在室温下洗膜两次，每次 5 min；再用
0.1% SSC 和 0.1% SDS 溶液在 65 ℃洗 30 min，进行 X 光片显影。
2 结果与分析
2.1 BoExo70A1 基因的克隆与序列分析
根据已知油菜 BnExo70A1 的核酸序列设计引物，以羽衣甘蓝柱头总 RNA 为模板，通过 RT-PCR
的方法获得一个长为 1 917 bp 的 cDNA 序列。然后通过 5′RACE 和 3′RACE 的方法分别获得长度为
215 bp 的 5′末端序列和 363 bp 的 3′末端序列。将 RT-PCR 和 RACE-PCR 的扩增片段进行序列拼接，
获得了 2 184 bp 的全长 cDNA 序列，命名为 BoExo70A1，GenBank 登录号为 JF919716。BoExo70A1
全长 cDNA包含一个长度为 56 bp的 5′非翻译区、211 bp的 3′非翻译区和 1 917 bp的开放阅读框（open
reading frame，ORF），对应编码一个含 638 个氨基酸残基的蛋白质（图 1）；相对分子质量约为
72.3 kD，理论等电点（pI）为 7.75。


图 1 羽衣甘蓝 BoExo70A1 全长 cDNA 核苷酸序列及其推测的氨基酸序列
Fig. 1 The full-length cDNA sequence of BoExo70A1 and its deduced amino acid sequence

1 期 杨 佳等：羽衣甘蓝 Exo70A1 基因的分离及表达分析 131

通过氨基酸序列比对分析显示，BoExo70A1 的序列与油菜 BnExo70A1 的序列具有 99%的一致
性，与拟南芥 AtExo70A1 的序列具有 94%的一致性（图 2）。蛋白结构域分析结果显示，BoExo70A1
蛋白的 C 末端含有一个典型的 Exo70 结构域。


图 2 羽衣甘蓝 BoExo70A1 与油菜 BnExo70A1、拟南芥 AtExo70A1 氨基酸序列比对
灰色背景显示不一致的氨基酸序列。
Fig. 2 Alignment of predicted amino acid sequences among BoExo70A1，BnExo70A1 and AtExo70A1
Different residues are shaded gray.

2.2 BoExo70A1 的基因结构
为了分析 BoExo70A1 基因的结构，提取羽衣甘蓝叶片基因组 DNA，根据所获得的 BoExo70A1
cDNA 片段设计两组引物对 BoExo70A1 的基因组序列进行扩增，分别得到长度为 2 193 和 1 904 bp
的片段，将两者拼接起来获得 BoExo70A1 的基因组序列（BoExo70A1 gDNA）。BoExo70A1 gDNA
序列全长 4 076 bp，与 BoExo70A1 cDNA 序列进行比对发现，BoExo70A1 gDNA 含有 12 个外显子和
11 个内含子（图 3），内含子的大小范围在 74 bp（intron5）到 453 bp（intron2）之间，内含子 5′供
体位点和 3′受体位点边界序列都符合 GU-AG 规则。在拟南芥 AtExo70A1（At5g03540）基因结构中
也同样含有 12 个外显子和 11 个内含子（图 3），这说明 Exo70A1 基因的结构在这两个物种中是保守
的。
132 园 艺 学 报 39 卷
图 5 BoExo70A1 的表达分析
Fig. 5 Expression analysis of BoExo70A1

图 3 羽衣甘蓝 BoExo70A1 与拟南芥 AtExo70A1 基因外显子和内含子结构示意图
“-”代表外显子，“V”代表内含子，“■”代表编码区，起始密码子和终止密码子分别用 ATG 和 TAA 标注。
Fig. 3 Exon-intron structures of BoExo70A1 and AtExo70A1
The exons are indicated by“-”，and the introns are indicated by“V”. Coding regions are indicated by“■”，
and the putative initiation and stop sites are indicated by ATG and TAA，respectively．

2.3 BoExo70A1 的 Sourthern 杂交分析
为了分析 BoExo70A1 在基因组中的拷贝数，基因组 DNA 经 BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、XbaⅠ
限制性内切酶酶切消化，分别用 BoExo70A1 序列的 5′末端和 3′末端设计的探针进行杂交分析。结果
显示，利用 BoExo70A1 序列的 5′末端设计的探针进行杂交，4 种限制性内切酶酶切基因组 DNA 后
分别检测到 4、4、3 和 3 条阳性杂交带（图 4，a）；而用根据 BoExo70A1 序列的 3′末端设计的探针
进行杂交，4 种限制性内切酶酶切基因组 DNA 后分别检测到 5、11、6 和 3 条阳性杂交带（图 4，b），
表明 BoExo70A1 在羽衣甘蓝基因组中至少存在 3 个拷贝。

图 4 BoExo70A1 的 Sourthern 杂交分析
a：5′末端探针杂交结果；b：3′末端探针杂交结果。
Fig. 4 Sourthern blot analysis of BoExo70A1
a：Sourthern blot analysis with 5′ end probe；b：Sourthern blot analysis with 3′ end probe.

2.4 BoExo70A1 的表达分析
为了分析BoExo70A1在植物组织中的表达
情况，分别提取羽衣甘蓝花瓣、柱头、花柱、
子房、花药、茎和叶的总 RNA，利用 Northern
杂交的方法进行检测。
结果（图 5）表明，BoExo70A1 在检测的
组织中都有表达，但 BoExo70A1 在各组织中的
表达水平不同，在叶中表达量最低；在茎和花
瓣中表达量较高。
1 期 杨 佳等：羽衣甘蓝 Exo70A1 基因的分离及表达分析 133

3 讨论
本研究中从羽衣甘蓝自交不亲和系（S13-bS13-b）中分离出 BoExo70A1 基因。羽衣甘蓝 BoExo70A1
全长 cDNA 序列为 2 184 bp，包含 56 bp 的 5′非翻译区、211 bp 的 3′非翻译区和 1 917 bp 的开放阅
读框，对应编码一个含 638 个氨基酸残基的蛋白质。在羽衣甘蓝 BoExo70A1 基因中含有 12 个外显
子和 11 个内含子，内含子 5′供体位点和 3′受体位点边界序列都符合 GU-AG 规则。通过上述研究对
Exo70A1 基因的结构有了进一步的认识。此外，Southern 杂交的结果显示出，羽衣甘蓝基因组中可
能存在多个拷贝的 Exo70A1 基因，这暗示羽衣甘蓝基因组中可能含有复杂的 Exo70 基因家族系统。
在拟南芥中，AtExo70A1 通过基因芯片及 RT-PCR 分析表明它在植株各组织中均存在表达（Synek
et al.，2006；Chong et al.，2010），但通过 RNA 原位杂交以及 GUS 转基因获得的结果却表明其在木
质部中特异性表达（Li et al.，2010）。在本研究中，通过 Northern 的方法检测到 BoExo70A1 在茎、
叶、花瓣、花药、柱头、花柱和子房中表达，说明它可能是一个组成型表达的基因，但仍需通过其
他试验方法进一步检测该基因的表达情况。
在油菜中，Exo70A1 被认为是 ARC1 下游底物，过量表达 Exo70A1 的植株具有部分打破自交不
亲和性的现象；Exo70A1 功能的丧失干扰了亲和花粉管的生长，这表明 BnExo70A1 在自交不亲和反
应及促进亲和花粉的水和、萌发和花粉管延伸的过程中起到重要作用（Samuel et al.，2008，2009）。
本试验中，通过氨基酸的序列比较发现 BoExo70A1 的序列与油菜 BnExo70A1 的序列具有 99%的一
致性，这说明 BoExo70A1 和 BnExo70A1 可能具有相同的功能。由于 Exo70A1 作为 Exocyst 复合体
的一个亚基，可能在柱头乳突细胞极性分泌亲和花粉所需物质的过程中发挥作用，但 Exo70A1 调控
花粉—柱头间的相互作用是否与胞吐作用有关及其所运输的物质是什么仍有待研究。
总之，本试验中对羽衣甘蓝 BoExo70A1 基因进行克隆，序列分析及基因组拷贝数的分析，并对
该基因的组织表达特异性进行了分析，不仅丰富了对芸薹属植物 Exo70A1 基因的认识，而且为进一
步探讨 BoExo70A1 与 ARC1 间的相互作用以及 BoExo70A1 的生物学功能奠定了基础。

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