全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（1）：87–94 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–04–06；修回日期：2010–12–07
基金项目：国家自然科学基金项目（30671319）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：huangsanwen@yahoo.com.cn）
马铃薯抗晚疫病基因 RB、R3a 过表达及 R3a 特
异性识别关键结构域的确定
梁春波 1,2，陈伊里 1，李 颖 2，黄三文 2,*
（1 东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：通过将马铃薯抗晚疫病基因 RB、R3a 编码区克隆到具有组成型 CaMV35S 强启动子的双元
表达载体上，结合农杆菌介导的瞬时表达，分析过表达条件下 RB-AvrB，R3a-Avr3a 的特异性识别情况。
并利用重叠延伸 PCR 实现 R3a 与同源序列 I2GA1 在卷曲螺旋（CC）、核酸结合位点（NBS）和富含亮氨
酸重复序列（LRR）三个结构域的互换，根据过敏性反应（hypersensitive response，HR）是否被阻断分析
各个结构域对特异性识别的影响，确定特异性识别的关键结构域。结果表明：CaMV35S 启动子驱动的 RB
基因在表达量上较自身启动子有明显提高，使 HR 反应加快; R3a 的表达量和特异性识别 Avr3a 诱导产生
HR 反应的速度在两者之间均无明显差别。另外，R3a 与 I2GA1 在 LRR 区域序列发生交换后，识别 Avr3a
诱导产生 HR 反应的能力也发生了交换，即 R3a 特异性识别 Avr3a 的关键序列位于 LRR 结构域内。
关键词：马铃薯；晚疫病；重叠延伸 PCR；结构域交换；瞬时表达
中图分类号：S 532 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）01-0087-08

Overexpression of the Potato Late Blight Resistance Genes RB and R3a and
Identification of Domains Required for Recognition Specificity of R3a
LIANG Chun-bo1,2，CHEN Yi-li 1，LI Ying2，and HUANG San-wen2,*
（1Department of Agricultural，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2 Institute of Vegetables and
Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：The potato genes RB and R3a encode coiled-coil，nucleotide binding site，leucine-rich
repeat（CC-NBS-LRR）proteins and confer specific recognition to AvrB and Avr3a effectors of the late
blight pathogen Phytophthora infestans，manifested as a hypersensitive response（HR）at the initial site of
infection. In this study，overexpression of RB and R3a were constructed by cloning coding domains to the
vector which contains CaMV35S promoter. Chimerical constructs of domain swapping between R3a and
its homolog I2GA1 in CC，NBS and LRR were generated by overlap extension polymerase chain reaction.
The recognition capability of the overexpressing and domain swapping constructs to AvrB and Avr3a were
tested by Agrobacterium transient transformation assay（ATTA）. The results showed that the expression of
RB was much higher and HR appeared almost one day earlier under the control of CaMV35S promoter
than the native one. For R3a，there was no difference of expression and HR observed under the control of
these two kinds of promoter. Domain swapping revealed that the recognition specificity of R3a is mostly

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determined by the domain of LRR.
Key words：potato；late blight；over extension PCR；domain swapping；ATTA

由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的晚疫病是马铃薯最严重的病害，每年引起数十亿
美元的经济损失（Kamoun，2001）。马铃薯抗晚疫病育种开始于 19 世纪中叶，是最早通过遗传改良
来防治农作物病害的人类实践之一（Müller ＆ Black，1952）。目前，已经克隆的抗病基因有 R1
（Ballvora et al.，2002）、R3a（Huang et al.，2005）、RB/Rpi-blb1 （Song et al.，2003；van der Vossen
et al.，2003；朱素贤 等，2010）、Rpi-blb2（van der Vossen et al.，2005）和Rpi-blb3（Lokossou et al.，2007）。
另外，R3a 和 RB 相对应的无毒基因 Avr3a（Armstrong et al.，2005）和 AvrB（Avrbibl）（Vleeshouwers
et al.，2008）也已经被克隆，R3a、RB 能够分别特异性识别 Avr3a 和 AvrB，通过农杆菌注射到本生
烟草叶片后引发过敏性反应（hypersensitive response，HR）。这两对符合基因对基因假说（Flor，1971）
的 R-Avr 基因对的克隆为进一步研究植物抗病机制奠定了良好的基础。I2GA1 是 R3a 的同源序列，
两者在 DNA 和蛋白质水平的同源性分别为 94%和 91%，I2GA1 不能够特异性识别 Avr3a，较高的序
列同源性和功能差异使通过结构域交换的方法确定特异性识别的关键序列成为可能。
由于 P. infestans 存在着有性和无性两种生殖方式，进化潜力极高，通过常规育种导入到栽培种
中的抗病基因很容易被克服，目前已经发现了能够克服全部 11 个马铃薯小种特异性抗病基因的晚疫
病菌株。在马铃薯晚疫病抗病基因中，RB 是具有相对广谱抗性的 R 基因，但目前也已发现能够克
服 RB 的晚疫病菌株。因此利用已经克隆的抗病基因探索抗病机理，了解寄主植物和病原菌的互作，
对于筛选新的功能性植物抗病基因，提高抗病育种效率都具有十分重要的意义。
本研究通过对马铃薯抗晚疫病基因 R3a 和 RB 在烟草叶片中的过表达和 R3a 与 I2GA1 结构域交
换，结合农杆菌介导的瞬时表达技术，分析过表达条件下 R3a-Avr3a，RB-AvrB 的特异性识别情况及
不同结构域对 R3a 特异性识别的影响，为进一步研究寄主植物与病原菌之间的作用机理奠定基础，
也为通过分子育种的方式选育出具有持久广谱的抗性材料提供可能。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2008—2009 年在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行。
质粒：pBinplus︰R3a，pBinplus︰I2GA1，pCLD04541︰RB 由本实验室保存；pGR106︰Avr3a23-147，
pGR106︰AvrB 和表达载体 pCB302-3（Xiang et al.，1999）由英国 The Sainsbury Laboratory 的 Sophien
Kaumoun 实验室惠赠。菌株：DH5α、GV3101 电击转化感受态细胞由本实验室自行制备。植物材料：
本生烟草（Nicotiana benthamiana）种植于光照培养室，温度 22 ℃，光照 16 h。
1.2 试验方法
1.2.1 重组质粒构建 过表达载体构建以 pBinplus︰R3a、pCLD04541︰RB 为模板，在 R3a、RB 编
码区两端设计含有 BamHI 和 SpeI 酶切位点的引物 BF、SR（表 1），扩增 R3a 和 RB 的编码区。结构
域交换参照 Higuchi（1988）和 Ho（1989）的方法，以 pBinplus︰R3a、pBinplus︰I2GA1 为模板，在
R3a、I2GA1 编码区两端设计含有 BamHI 和 XbaI 酶切位点的引物 BF、XR，在需要交换的序列处设
计引物 MF、MR（表 1），此两条引物反向重复且在中间位置包含交换位点。由 BF/MR 扩增交换位
点上游序列，MF/XR 扩增交换位点下游序列，切胶回收上、下游扩增产物，以等摩尔比混合的两种
1 期 梁春波等：马铃薯抗晚疫病基因RB 和R3a 过表达及R3a 特异性识别关键结构域确定 89

产物作为模版，BF/XR 为引物进行第 3 轮扩增，得到突变基因扩增产物。用限制性内切酶 BamHI、
XbaI 双酶切基因扩增产物和载体，切胶纯化酶切产物。用 T4 连接酶将基因酶切片段与线性化载体
进行连接。
1.2.2 转化 将连接产物脱盐后电击转化到大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，LB 固体培养基（Kan 50
mg · L-1）平板 37 ℃培养 12 h 后挑取单菌落，LB 液体培养基中振荡培养 12 h 后进行菌落 PCR 检测，
对阳性菌落提取质粒 DNA，重组部分进行序列测定。将测序无误的重组质粒电击转化到农杆菌
GV3101 感受态细胞中，LB 固体培养基（Kan 50 mg · L-1，Tet 5 mg · L-1，）28 ℃平板培养 36 h 后挑
取单菌落，LB 液体培养基振荡培养 36 h 后进行菌落 PCR 检测。
表 1 R3a和RB过表达、结构域交换引物
Table 1 Primers for overexpression and domain swapping
引物名称
Name
序列 5′–3′
Sequence
引物名称
Name
序列 5′–3′
Sequence
R3aBF GCGGGATCCATGGAGATTGGCTTAGCAGTTG 3AI2LR AAGCAATGTCCTCAGCTGCTCCAATTTGTA
R3aSR GCGACTAGTTCACATGCATTCCCTATCGATC I23ALF TACAAATTGGAGCGGCTGAGGACATTGCTT
RBBF GCGGGATCCATGGCTGAAGCTTTCATTCAA I23ALR AAGCAATGTCCTCAGCCGCTCCAATTTGTA
RBSR GCGACTAGTTTAATTATATATATTCACATT R3aRTF CTCGCATCTTGAGAGAGTGAAGA
R3aXR GCGTCTAGAGTCACATGCATTCCCTATCGATC R3aRTR TCAGAGAGGGAAGAGGGCATC
I2XR GCGTCTAGATCACATGCATTCCCCATTGATC RBRTF CTCGCATCTTGAGAGAGTGAAGA
3AI2CF CGCCTTGGCTTAAAGGAACATTTTGGTTCG RBRTR TCTAGTGCGCAACACAATTGAA
3AI2CR CGAACCAAAATGTTCCTTTAAGCCAAGGCG actinF AAGATACTCACAGAAAGAGGCTAC
3AI2LF TACAAATTGGAGCAGCTGAGGACATTGCTT actinR AGGACAATGTTTCCGTACAGA
1.2.3 农杆菌共注射 将经过检测确定含有重组质粒的农杆菌菌液 28 ℃振荡培养 36 h（OD600 ≈
1.0），4 000 r · min-1 离心 10 min，用 MMA 溶液（10 mmol · L-1，MgCl2；150 μmol · L-1 乙酰丁香酮；
1 mmol · L-1MES）悬浮菌体沉淀，室温静置 3 h。将含有重组基因与无毒基因的菌液 1︰1 混合，用
去掉针头的 2.5 mL 注射器由背面注射到 5 ~ 8 周的烟草中上部叶片之中，每个处理 3 次重复，每天
观察处理叶片情况，7 d 后照相统计结果。
1.2.4 烟草叶片总 RNA的提取及半定量 RT-PCR 在 5 ~ 8 周本生烟草叶片背面注射含有 RB、R3a、
35S+RB、35S+R3a 基因的农杆菌，每天采集经过注射处理的叶片用天根 RNAprep pure 植物总 RNA
提取试剂盒提取总 RNA。用 Promega 公司产 M-MLV 反转酶反转录成 cDNA，然后以基因的特异性
引物进行基因的扩增，以烟草的组成型表达基因 actin 为正对照，未注射的烟草叶片为负对照。
2 结果与分析
2.1 RB 和 R3a 在烟草叶片中的表达分析
以半定量 RT-PCR 法分析 CaMV35S 启动子和自身启动子驱动的抗病基因 RB、R3a 在本生烟草
叶片中的转录水平表达。结果如图 1 所示：自身启动子驱动的 RB 基因在注射后第 1 天检测不到表
达，第 2 ~ 5 天表达量逐天有所增加，到第 6 ~ 7 天又有一定程度下降；CaMV35S 驱动的 RB 基因，
在注射 1 d 后即有所表达，第 2 ~ 5 天表达量较高，第 6 ~ 7 天表达量虽然有所下降，但仍然明显高
于正常表达的 RB 基因，说明 CaMV35S 启动子使 RB 基因的表达量显著提高。而对于 R3a 而言，无
论是在自身启动子还是在 CaMV35S 启动子驱动，表达量都维持在比较高的水平上，CaMV35S 强启
动子对 R3a 表达量的提高作用并不明显。未注射叶片中没有检测到抗病基因的表达。
2.2 过表达对 RB-AvrB 和 R3a-Avr3a 特异性识别的影响
通过对共注射含有不同启动子驱动的抗病基因及其相对应无毒基因的农杆菌烟草叶片的观察
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发现，在注射后的 1 ~ 3 d 内，所有叶片均没有观察到 HR 反应产生，但在第 4 天，过量表达 RB 的
叶片上开始有 HR 坏死产生，正常表达 RB 基因的叶片则观察不到 HR 反应。第 5 天，过表达 RB 的
叶片上的坏死面积不断扩大，正常表达 RB 的叶片上则开始能够观察到坏死现象。第 6 天，坏死面
积继续扩大，到注射后第 7 天，两者产生的 HR 坏死均充满整个注射区域，这一现象说明过表达在
一定程度上加快了 RB 与 AvrB 的特异性识别诱导的 HR 反应的产生。
对 R3a 而言，无论是 CaMV35S 还是自身启动子驱动，HR 反应均是在注射后第 4 天开始被观
察到，第 5 天坏死面积有所扩大，到第 6 天整个注射区域均发生坏死，说明过表达对 R3a 特异性识
别 Avr3a 诱导产生 HR 反应的速度无明显影响（图 2）。
图 1 R3a 和 RB 在烟草叶片中半定量 RT-PCR 结果
M：DNA 分子量标记；1 ~ 7：注射后 1~ 7 d；CK-：负对照。
Fig. 1 RT-PCR amplificating product of RB，R3a in N. bethamiana
M：DNA marker；1–7：1–7 days post infection；CK-：Negative control.

图 2 不同启动子驱动的 RB 和 R3a 在烟草叶片中的瞬时表达结果
1 ~ 7：注射后 1 ~ 7 d；叶片左半部：正常表达的抗病基因 + 无毒基因；叶片右半部：过表达的抗病基因 + 无毒基因。
Fig. 2 Transient expression of RB and R3a under the control of different promoters in N. benthamiana
1–7：1–7 days post infection；Agrobacterium which contain R genes under the control of native promoters and CaMV35S were
injected into the left and right positions of the leaves，respectively.
2.3 结构域交换对 R3a 特异性识别的影响
2.3.1 R3a、I2GA1编码蛋白序列对比 R3a 与 I2GA1 均编码 CC-NBS-LRR 类抗病蛋白，R3a 编码
区全长 3 843 bp，编码一个由 1 280 个氨基酸组成的蛋白质，含有 29 个 LRR 单元。I2GA1 编码区全
1 期 梁春波等：马铃薯抗晚疫病基因RB 和R3a 过表达及R3a 特异性识别关键结构域确定 91

长 3 798 bp，编码蛋由 1 265 个氨基酸组成，LRR 单元数为 27 个。R3a、I2GA1 共有 116 个氨基酸
存在差异，在 3 个结构域内分别为 4、14 和 98 个（图 3）。
图 3 R3a 和 I2GA1 编码蛋白氨基酸序列比对
R3a，I2GA1 编码蛋白相同的氨基酸位于正常位置，特异氨基酸分别位于上、下两行，横线代表缺失，
矩形内为 30 个 LRR 单元内的 β 螺旋区域（xxLxLxx）。
Fig. 3 Alignment of the R3a and I2GA1 encoding proteins
Identical amino acid residues of R3a and I2GA1 are shown in normal script. R3a and I2GA1 specific residues
are shown at the top and bottom lines，respectively. Dashes indicate deletion. The β-sheet
（consensus xxLxLxx）of each LRR unit is highlighted with black rectangle.
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2.3.2 结构域交换对 R3a特异性识别的影响
对 R3a、I2GA1 在编码 CC、NBS、LRR 区域的序列进行互换，共获得 6 个重组基因 (表 2），
通过与含有 Avr3a 基因的农杆菌在烟草叶片中共注射，根据 HR 反应是否被阻断分析不同结构域的
改变对 R3a-Avr3a 特异性识别的影响。结果如图 3 所示，R3a 在 LRR 区域被交换后，HR 反应完全
被阻断；同时 I2GA1 在获得 R3a 的 LRR 区域的序列后也获得了识别 Avr3a 诱导产生 HR 反应的能
力；CC、NBS 的交换对 R3a 识别 Avr3a 则没有明显的影响。I2GA1 在获得 R3a 的 CC、NBS 区域后
也没有能够识别 Avr3a（图 4）。这一结果表明 R3a 和 I2GA1 特异性识别的差异是由 LRR 区域的序
列差异造成的，即 R3a-Avr3a 特异性识别的关键结构域为 LRR。
表 2 结构域交换重组基因各结构域来源情况
Table 2 Construction of domain swapping chimeras of R3a and I2GA1
重组基因名称 Name of chimeras CC NBS LRR
R3a（I2GA1-CC） I2GA1 R3a R3a
I2GA1（R3a-CC） R3a I2GA1 I2GA1
R3a（I2GA1-NBS） R3a I2GA1 R3a
I2GA1（R3a-NBS） I2GA1 R3a I2GA1
R3a（I2GA1-LRR） R3a R3a I2GA1
I2GA1（R3a-LRR） I2GA1 I2GA1 R3a

图 4 R3a 和 I2GA1 及结构域交换重组基因在烟草叶片中瞬时表达结果
Fig. 4 Transient expression of R3a，I2GA1 and domain swapping chimeras in N. benthamiana
3 讨论
通过增加基因的表达量来提高作物抗病性或抗逆性一直被认为是有效的手段（Park et al.，2001；
Kanzaki et al.，2002）。本研究发现，过表达对于自身表达量较低的 RB 基因确实可以提高表达量，
并在一定时间内使特异性识别诱导产生的 HR 反应更快出现。而对于自身表达量较高的 R3a 则没有
十分明显的作用。这一结果为将 RB 基因构建在含有组成型强启动子的载体上，结合转基因技术，
将 RB 基因转化到感病材料中高效表达，从而为提高作物抗性提供了一定的基础。

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由于推测具有结合特性以及存在大量的变异，LRR 区域一直被认为与抗病基因编码蛋白的识别
特异性有关（van der Hoorn et al.，2001）。研究表明某些 R 基因的 LRR 区域直接与病原菌的效应子
互作（Jia et al.，2000）。但也有研究发现特异性识别是由其他一些区域决定的（van der Hoorn et al.，
2001）。对于 R3a 和其同源序列 I2GA1，LRR 区域也是存在最大变异的结构域，CC、NBS 则相对保
守。从结构域交换结果也可以看出，LRR 结构域对于 R3a 识别 Avr3a 至关重要，CC、NBS 序列的
差异则没有明显的影响，但如果因此就说 CC、NBS 区域与 R3a 特异性识别 Avr3a 无关还为时尚早，
因为有可能 CC、NBS 区域内对特异性识别关键的区域在 R3a 和 I2GA1 之间没有差异，或在 R3a 中
重要的氨基酸的功能恰好能够由替换的氨基酸来弥补。
本研究中，过表达基因和结构域交换重组基因的特异性识别能力是通过与含有相应无毒基因的
农杆菌在烟草叶片中共注射后是否能够诱导 HR 反应来进行检测的。过量表达的 RB 使诱导产生的
HR 反应加快，含有 R3a LRR 区域序列的 I2GA1 特异性识别 Avr3a，但这是否就意味着 RB 的抗病
性会随着表达量的提高而提高或者 I2GA1（R3a-LRR）同样具有了 R3a 的抗病性，还需要未来接种
试验的验证。由于在瞬时表达重组基因的烟草上接种不同晚疫病小种在操作上存在一定的困难，如
要得到较为确切的结果需要将过量表达的基因或交换重组基因转化到马铃薯材料中再进行晚疫病的
接种。另外，从图片中可能看到有些叶片的注射部位也会发生一定程度的变黄，这主要是由于烟草
叶片的状态存在差异，农杆菌注射后有可能出现本底反应，并不是过敏性反应。
晚疫病致病疫霉 P. infestans 全基因组测序已经完成，共发现大约 560 个含有 RXLR 结构的效应
子候选基因（Haas et al.，2009）。马铃薯的全基因组测序也即将完成（Visser et al.，2009），将会有
大量抗病基因的候选基因被发现。如何高通量的克隆和鉴定抗病基因及其对应的无毒基因已成为当
务之急。从本研究的结果来看，利用农杆菌介导的瞬时表达能够快速高效地检测和鉴定抗病基因及
其无毒基因。同时也为进一步深入研究寄主作物对病原物的防卫机理奠定良好基础。

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