全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（6）：1175–1182 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–01–14；修回日期：2014–04–09
基金项目：国家自然科学基金项目（31360475，31060257）；贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目（黔省专合字 201012）；贵州
省重大科技专项（黔科重大专项字 20136006-1）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：anhuaming@hotmail.com）
刺梨 GDP-L–半乳糖磷酸酶基因的表达及其与
AsA 积累的关系
孙雅蕾，杨 曼，安华明*
（贵州大学农学院，贵州省果树工程技术研究中心，贵阳 550025）
摘 要：采用 RT-PCR 和 RACE 技术，从刺梨（Rosa roxburghii Tratt）果实中扩增出 GDP-L–半乳糖
磷酸酶（GDP-L-galactose pyrophosphatase，GGP）基因的全长 cDNA 序列，并分析其在不同组织和果实
不同发育阶段的表达特点及其与 AsA 积累的关系。结果表明：刺梨 GGP 基因 cDNA（RrGGP，GenBank
登录号：HM998753）包含 1 个长度为 1 341 bp 的开放阅读框（ORF），编码 445 个氨基酸；其氨基酸序
列与苹果、猕猴桃等的相似性均在 80%以上。RT-PCR 分析表明，该基因在刺梨不同器官中的表达差异明
显：在果实中的表达量最强，叶中次之，而花和茎中只能检测到极微弱的表达。在果实不同发育时期都
能检测到 RrGGP 的表达，在发育初期（花后 50 d 内）表达较弱，花后 60 ~ 100 d 呈高水平表达，而后随
着果实成熟而下调。刺梨中 RrGGP 的表达特点与 AsA 积累高度一致，意味着该基因可能是果实发育过程
中 AsA 合成的关键基因。
关键词：刺梨；GDP-L–半乳糖磷酸酶；基因表达；AsA
中图分类号：S 661 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1175-08

Expression of GDP-L-galactose Pyrophosphatase and Its Relationship with
Ascorbate Accumulation in Rosa roxburghii
SUN Ya-lei，YANG Man，and AN Hua-ming*
（Guizhou Engineering Research Center for Fruit Crops，Agricultural College，Guizhou University，Guiyang 550025，China）
Abstract：A full length cDNA encoding GDP-L-galactose pyrophosphatase（GGP），a key enzyme in
the putative L-ascorbic acid（AsA）biosynthetic pathway of higher plants，was obtained from Rosa
roxburghii Tratt fruits using RT-PCR and RACE technology. This cDNA，designated RrGGP（accession
number，HM998753），contained an open reading frame（ORF）of 1 341 bp，encoding a protein of 445
amino acids. Sequence analysis indicated that its deduced amino acid showed over 80% identities with the
corresponding proteins from other plant species. Semi-quantitative RT-PCR showed that the expression of
RrGGP in fruits was significantly abundant than that of in leaves，flowers or stems，respectively，
contributing to parallel accumulation of AsA. Transcript abundance of RrGGP in developing fruits showed
a development-specific profile，in which RrGGP transcript levels were lower in young（10–50 days after
anthesis，DAA）and nearly ripe（110–120 DAA）fruits，and higher in fruit in mid-development（60–

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100 DAA）. This expression pattern showed a well correlation with AsA level，suggesting an important role
of this gene in regulating AsA biosynthesis in the fruits.
Key words：Rosa roxburghii；GGP；gene expression；ascorbic acid

抗坏血酸（AsA）不仅是果实品质的重要组分，而且还参与植物诸多生理过程。业已证实 L–
半乳糖途径是高等植物 AsA 合成的主要途径（Wheeler et al.，1998；Hancock & Viola，2005；Linster
et al.，2007），而 GDP-L–半乳糖磷酸酶（GDP-L-galactose pyrophosphatase，GGP）在该途径中催
化 GDP-L–半乳糖生成 L–半乳糖–1–磷酸，是该途径中最后一个被鉴定的酶（Laing et al.，2007；
Linster et al.，2007）。目前该酶的基因已从苹果（Li et al.，2010a）、猕猴桃（Bulley et al.，2009）、
桃（Imai et al.，2009）等果树中鉴定和克隆。在拟南芥和猕猴桃上的研究表明，GGP 对高等植物中
AsA 的合成与积累起着关键性的作用，并且很可能是 L–半乳糖途径的限速酶（Dowdle et al.，2007；
Bulley et al.，2009）。遗传转化研究表明 GGP 过量表达能够提高转基因植物中的 AsA 含量（Bulley et
al.，2009）。但在草莓（Cruz-Rus et al.，2011）、猕猴桃（Li et al.，2010b）和桃（Imai et al.，2009）
等的果实以及番茄（Ioannidi et al.，2009）、苹果（Li et al.，2010a）等的叶片中发现 GGP 基因与
AsA 合成并未表现出明显的一致性。表明不同植物可能具有不同的 AsA 合成调控机制。以高积累
AsA 的刺梨（Rosa roxburghii Tratt）为材料，从果实中克隆了 GGP 基因的全长 cDNA 序列，并对其
时空表达特点及其与 AsA 积累的关系进行了分析，为阐明 GGP 基因在果实合成 AsA 过程中的作用
提供科学依据，也为完善这一特色果实合成 AsA 的分子机制提供更进一步的信息。
1 材料与方法
1.1 材料
5 年生优良无性系刺梨‘贵农 5 号’（樊卫国 等，2011）种植于贵州大学刺梨种质资源圃。于
2011 年 7 月采集刺梨幼果用于基因克隆。5 月上旬采取开放的花朵，7 月下旬刺梨 AsA 积累量最大
时采取绿色果实、幼嫩茎和叶样品用于不同器官中表达特点的研究。从 5 月中旬（花后 20 d）开始
采果实，以后每隔 10 d 于上午 10 时定期随机取样，用于不同发育时期基因表达研究。所采样品迅
速放入 0 ℃左右的保温箱内立即带回实验室，用液氮速冻后于–80 ℃超低温冰箱中保存。
1.2 方法
1.2.1 RrGGP的 cDNA克隆及生物信息学分析
采用 CTAB-LiCl 法（Chang et al.，1993）提取总 RNA，按照 RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit（Fermentas）进行 cDNA 第一链的合成。根据 GenBank 中已登录的苹果、猕猴桃、葡
萄等植物的 GGP 基因保守序列设计引物（表 1）进行 PCR 扩增。扩增产物回收后连接到 pMD18-T
载体（TaKaRa）上，转化大肠杆菌 TG1 感受态细胞，阳性克隆经 PCR 和酶切验证后由上海生工生
物工程技术服务有限公司测序。按照 TaKaRa 试剂盒分别进行 3′和 5′端扩增并测序，根据所得序列
设计特异引物扩增全长 cDNA 并测序验证。
用 BLASTN、BLASTP、CLUSTALX 和 MEGA4.1 等分子生物学软件进行序列分析及系统树构
建；用 ProtParam tool（http：//au.expasy.org/tools/protparam.html）分析氨基酸基本成分、相对分子
量、等电点等理化性质；利用软件 TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）
预测蛋白质跨膜区段；利用 Signal P 程序分析 N–末端的信号肽序列（http：//genome.cbs.dtu.dk/
services/Signal P）；通过 PSIPRED 预测蛋白质的二级结构，SWISS-MODEL 预测蛋白质三级结构。
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图 1 RrGGP 的 RT-PCR 扩增结果
M：DL2000 DNA marker；1：cDNA 片段；2：3′端扩增产物；
3：5′端扩增产物；4：全长扩增结果。
Fig. 1 The RT-PCR amplification results of RrGGP
M：DL2000 DNA marker；1：cDNA fragment；2：3′ terminal
fragment；3：5′ terminal fragment；4：Full-length cDNA of RrGGP.
表 1 试验所用引物序列
Table 1 Sequence of primers involved in the experiment
用途 Purpose 引物 Primer 引物序列（5′–3′） Primer sequence
刺梨 GGP cDNA 的 RT-PCR 扩增 GGP1 TCGCTATGATGTCACTGCTTG
RT-PCR for RrGPP fragment GGP2 AGCATTCACTTCTTGGAACCT
RACE 引物 GGPf TCGAGATGTTGAGGATCAAGAGGGTTCC
RACE primers GGPi AGGACTATGATGAGGCTTCTG
GGPo AGATCTCTGAGCTTCTGAACT
RrGGP 全长 cDNA 扩增 GGPu TGCCATGGTCGAGATGTTGAGGATCAAG
RT-PCR for full-length RrGPP cDNA GGPd GCTCTAGAACCACTGATCTGCTCATTACT
内参基因扩增 18SF CAAATTTCTGCCCTATCAAC
RT-PCR for 18S as internal control 18SR CAAAATCCAACTACGAGCTT
1.2.2 RrGGP的表达分析
分别取刺梨果实和不同器官的总 RNA 样品 2 µg，用 Oligo(dT)18 作为反转录引物，按照 1.2.1
的方法合成 cDNA 第一链。以跨内含子引物 GGP1 和 GGP2 扩增 RrGGP 的 cDNA 片段，以 18S rRNA
作内参基因。对 cDNA 定量和循环数优化至线性期后进行半定量 RT-PCR 扩增，分析目的基因在不
同器官和组织中的表达量。
1.2.3 AsA含量的测定
参考张雪等（2012）的方法提取 AsA：取 2 g 组织置于预冷的研钵中，加 5 mL 5 mg · mL-1 的偏
磷酸研磨成匀浆。将匀浆全部转入离心管中，于 12 000 r · min-1 离心 15 min 后，取上清液。以上操
作均在 4 ℃下进行。AsA 含量采用高效液相色谱法（HPLC）测定，以峰面积外标法计算其含量。
AsA 标样购于 Sigma 公司。4 种器官和 11 个不同发育时期的果实样品至少 3 次生物学重复。
2 结果与分析
2.1 RrGGP 克隆及生物信息学分析
以刺梨果实总RNA为模板进行RT-PCR和
RACE 扩增，分别获得 886、832 和 1 132 bp
的预期片段并测序，在此基础上设计全长引物，
PCR 扩增出与预期长度一致的约 1.4 kb 特异条
带（图 1）。经回收纯化后连接到 pMD18-T 载
体，经鉴定后测序。
将测序所得到的 1 375 bp cDNA 序列用相
关分子生物学软件进行分析，其包含一个长度
为 1 341 bp 的开放阅读框（ORF），编码 445
个氨基酸。将其命名为 RrGGP，GenBank 登录
号为 HM998753。其推导的蛋白质分子式为
C2206H3462N606O666S16，分子量 49.64 kD，等电
点 5.20。该蛋白中相对含量较多的氨基酸是 Leu（48 个，10.8%）、Glu（39 个，8.8%）和 Ala（34 个，
7.6%）；含量较少氨基酸有 Trp（3 个，0.7%）和 Met（5 个，1.1%）等；根据其亲水性推测该蛋白可
能是水溶性蛋白质。TMpred 预测分析表明，RrGGP 是跨膜蛋白，有 1 个胞内至胞外方向的跨膜螺
旋区：226 ~ 245 氨基酸，其中心位于 236 位氨基酸残基。经 SignalP 分析发现 RrGGP 蛋白不存在信
号肽序列。经 PSIPRED 在线预测刺梨 GGP 蛋白的二级结构以 β–折叠为主、α–螺旋为辅，并通过
长链转角连接。利用 GenBank 提供的保守结构域数据库对其氨基酸序列比对分析（图 2）发现，
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图 2 植物 GGP 基因推导氨基酸序列比对分析（Clustal X）
星号表示所有序列具有相同的氨基酸残基，下划线处表示 NLS 序列，方框内表示 HIT 结构域。
Fig. 2 Alignment of the deduced amino acid sequences of plant GGPs by Clustal X
The asterisks show the consensus amino acid residues in the seven enzymes.
A sequence thought to be a NLS region is underlined and a HIT domain is boxed.

6 期 孙雅蕾等：刺梨 GDP-L–半乳糖磷酸酶基因的表达及其与 AsA 积累的关系 1179

图 5 刺梨不同器官内 AsA 的含量
Fig. 5 AsA accumulation in R. roxburghii different organs
图 4 RrGGP 在刺梨不同器官中的表达
Fig. 4 RrGGP expression in R. roxburghii different organs

该基因在 119KKRP122 部位含有一个 NLS（核定位序列，nuclear localization sequence），在 240 ~ 244
氨基酸残基位置有一个 HIT（histidine triad，组氨酸三联体）结构域。以上生物信息与前人在其他同
源基因上的研究结果（Dowdle et al.，2007；Laing et al.，2007；Linster et al.，2007；Linster & Clarke，
2008；Müller-Moule，2008）基本一致。
氨基酸同源性比对结果表明，RrGGP 与苹果（ACN88681.1）、蓖麻（XP002530359.1）、猕猴桃
（ADB85572.1）、毛果杨（XP002298816.2）、大豆（NP001240984.1）和西印度樱桃（ACG75920.1）
等同源基因的相似性分别达到了 87%、81%、81%、78%、78%和 77%，其 N 端序列相对保守，而
C 端序列保守性相对较低。
在此基础上构建的系统分析树（图 3），结果表明刺梨 GGP 基因与苹果、大豆同属一大族，而
猕猴桃、西印度樱桃、蓖麻、毛果杨属另一族。


图 3 植物 GGP 基因氨基酸序列的系统分析树
Fig. 3 Phylogenetic tree of the full-length deduced amino acid sequences of seven plant GGPs

2.2 RrGGP 在刺梨不同器官中的表达
通过半定量 RT-PCR 检测刺梨不同器官（果、花、叶、茎）中 RrGGP 的表达模式（图 4）发现，
在这 4 种器官中均能检测到 RrGGP 的表达，在果实中的表达最强，叶中次之，而花和茎中只能检
测到极其微弱的表达信号。
这种 RrGGP 表达水平的差异与相应器官中的 AsA 含量（图 5）高度一致：在表达最强的果实
内 AsA 的积累量最高，表达较弱的叶片内 AsA 含量则相应较低，茎中只有极微量的 AsA，而花中
则几乎检测不到。这种一致性在一定程度上表明 AsA 的合成可能受 RrGGP 表达的调控。








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2.3 RrGGP 在果实不同发育时期的表达及其与 AsA 积累的关系
在刺梨整个发育时期的果实中均能检测到 RrGGP 的表达并呈现有规律的变化：发育初期（20 ~
50 d）表达量较弱，之后随着果实的不断发育表达不断增强，在果实接近成熟时（开花后 110 d）表
达量下调。开花后 60 ~100 d 是该基因表达最强的时段（图 6），同时也是刺梨果实积累 AsA 最多的
时期（图 7）。果实整个发育期间 RrGGP 表达与 AsA 积累之间的这种高度一致性，并结合之前在刺
梨果实上发现的生物合成过程（而不是循环代谢过程）对 AsA 积累起主要作用的结果（安华明 等，
2005a），表明 RrGGP 可能是刺梨果实发育过程中 AsA 合成的关键位点。

图 6 刺梨果实不同发育时期 RrGGP 的表达
上栏为 RrGGP 表达的 RT-PCR 分析（30 个循环），中栏表示用相同方法扩增的 18S rRNA 内参基因（20 个循环），
下栏表示等量的总 RNA 电泳图。
Fig. 6 RrGGP expression in R. roxburghii fruits during development
RrGGP show GGP expression levels during development；18S rRNA show 18S rRNA expression levels were examined as an internal
control for the RNA amounts；RNA show equal amounts of RNA loading.

图 7 不同发育时期刺梨果实 AsA 积累量
Fig. 7 AsA accumulation in R. roxburghii fruits during development

3 讨论
本试验中克隆得到刺梨果实 RrGGP 基因的全长 cDNA 序列，其编码的氨基酸序列与已知的其
他植物的同源基因具有很高的相似性，说明该基因在高等植物中是比较保守的。生物信息学分析发
现该基因含有一个代表 HIT 超基因家族特点的典型结构域（HφHφH/Q，φ 代表疏水性氨基酸），表
明 RrGGP 基因属于 HIT 超基因家族成员；根据其亲水性平均数推测该蛋白可能是水溶性蛋白质。
利用 GenBank 提供的保守结构域数据库对其氨基酸序列进行分析发现，RrGGP 虽无明显的信号肽
序列，但存在一个跨膜螺旋区，说明该基因属于跨膜蛋白；并含有一个 NLS（核定位序列），这与
之前在拟南芥上发现绿色组织的细胞质和细胞核都检测到 GGP 蛋白的结果是一致的，意味着该蛋白
是具有催化和调控两种功能的双功能蛋白质（Dowdle et al.，2007）。
6 期 孙雅蕾等：刺梨 GDP-L–半乳糖磷酸酶基因的表达及其与 AsA 积累的关系 1181

目前高等植物合成 AsA 的途径、尤其是 L–半乳糖途径已基本清晰，但尚不清楚其调控机制和
调控位点。较早的研究认为该途径较为上游的 GDP–D–甘露糖–3′,5′–差向异构酶（GDP-D-
mannose-3′,5′-epimerase，GME）可能是 L–半乳糖途径的调控位点和限速酶（Wolucka & van
Montagu，2003），但后来在拟南芥和猕猴桃上的研究表明 GGP 似乎才是 AsA 合成的重要调控位点
（Dowdle et al.，2007；Bulley et al.，2009）。然而，有意思的是，最近西北农林科技大学马锋旺课
题组利用‘秦美’猕猴桃（A. deliciosa‘Qinmei’）为材料却发现 L–半乳糖–1–磷酸磷酸酶
（L-galactose-1-phosphate phosphatase，GPP）基因的表达与 AsA 积累速率呈良好的一致性（Li et al.，
2010b），而非 GGP；李超汉等（2011）采用农杆菌介导法获得了 GDP-D–甘露糖焦磷酸化酶基因
（GMPase）超表达的转基因番茄植株，在常温及低温下其 AsA 含量显著增加；对番茄和苹果叶片
的研究还发现 GPP 在调控番茄果实和苹果叶片 AsA 积累方面起着主要控制点的作用（Ioannidi et al.，
2009；Li et al.，2010a）；而在桃果实中，L–半乳糖途径基因的表达水平与 AsA 生物合成之间并未
表现出明显的一致性关系（Imai et al.，2009）。草莓果实中，L–半乳糖途径之外的半乳糖醛酸途
径（GalUA pathway）对 AsA 合成的作用更为显著（Agius et al.，2003；Cruz-Rus et al.，2011）。以
上研究结果表明，不同植物具有不同的 AsA 合成和调控机制，即使同一基因，它们在不同植物种类
中对 AsA 合成的作用效率也不相同。本研究对 RrGGP 的时空表达模式进行分析发现，不同器官中
RrGGP 的表达表现出明显的差异：果实中的表达量最强，叶片中次之，而花和茎中只能检测到极其
微弱的表达信号，其转录水平与相应器官中 AsA 积累量完全一致；同时，刺梨果实不同发育时期
RrGGP 的表达量变化也与其中 AsA 的积累规律保持高度一致，尤其是在 AsA 的积累速率最快的 60 ~
100 DAA 期间，RrGGP 的转录量也达到整个发育期的最高水平。有趣的是，结合之前安华明等
（2005b）、An 等（2007）以及最近的研究（数据暂未发表）发现仅有 GGP 和位于 L–半乳糖途径
最末位置的 L–半乳糖酸–1,4–内酯脱氢酶（L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase，GalLDH）基
因表现出类似的规律，但前者的表达量要远远高于后者。以上结果表明 RrGGP 极有可能是刺梨果
实高含量 AsA 合成的关键基因。
下一步拟通过遗传转化研究进一步验证 GGP 对 AsA 合成的调控作用、与 GalLDH 和其他合成
基因之间的协同机制以及对环境因子的响应特点等方面的研究有望提供更多信息。

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