全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（2）：343–352 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–08–06；修回日期：2011–01–11
基金项目：国家‘863’计划项目（2006AA10Z170）；教育部博士点基金项目（20092103110001）；国家博士后科学基金项目（200902551，
20080441101）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：fenghuiaaa@263.net）
大白菜核雄性不育相关基因 BrLTP1 的克隆及
特征分析
刘志勇，叶雪凌，李承彧，冯 辉*
（沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110866）
摘 要：利用 cDNA-AFLP 技术分析大白菜核雄性不育两用系‘AB02’可育株（msms）和不育株（Msms）
花蕾的基因表达谱，在可育株混合花蕾 cDNA 中扩增出 1 条特异条带 TDF-25，通过 RACE 和 RT-PCR 技
术克隆了该基因的全长 cDNA 序列。序列分析表明，该基因编码脂质转移蛋白，命名为 BrLTP1。BrLTP1
全长 cDNA 序列为 750 bp，推测编码 1 个包含 183 个氨基酸残基的前体蛋白。BrLTP1 蛋白含有典型的脂
质转移蛋白 N 端信号肽，保守的 AAI 结构域和半胱氨酸位点。预测 BrLTP1 蛋白含有多种修饰性位点，
包括 1个PKC磷酸化位点，2个N–糖基化位点和 10个N–端豆蔻酰基化位点。基因表达模式表明，BrLTP1
在两用系不育株花蕾中受到强烈抑制，在可育株的大花蕾、成熟花药以及花瓣中高水平表达。
关键词：大白菜；核基因雄性不育；脂质转移蛋白
中图分类号：S 634.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）02-0343-10

Cloning and Characterization of a Genic Male Sterility-related Gene
BrLTP1 in Chinese Cabbage
LIU Zhi-yong，YE Xue-ling，LI Cheng-yu，and FENG Hui*
（Department of Horticulture，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）
Abstract：The gene differential expression analysis was performed by cDNA-AFLP in the genic male
sterile line‘AB02’of Chinese cabbage，and a differentially expressed cDNA fragment，TDF-25，was
only found in fertile plants. The full-length cDNA of BrLTP1，coding lipid transfer protein in Chinese
cabbage，was amplified by RACE and RT-PCR. The BrLTP1 gene was 750 bp long in cDNA and
hypothetical protein BrLTP1 included 183 amino acids with a signal peptide of 22 amino acids. Sequence
analysis revealed that the BrLTP1 protein has ten N-myristoylation sites，two N-myristoylation sites，and
one PKC phosphorylation site. Gene expression characteristics indicated that BrLTP1 was highly
expressed in big flower buds and mature anthers of fertile plants，with a extremely low expression level in
sterile buds.
Key words：Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour.）Olsson；genetic male sterility；lipid transfer
protein


344 园 艺 学 报 38 卷
雄性不育是农作物杂种优势利用的重要途径，也是研究植物雄性器官发育分子机制的理想系
统。在前期研究中，本课题组发现了大白菜复等位核雄性不育现象，其育性由一个位点的 3 个复等
位基因控制：“Ms”为显性不育基因；“ms”为“Ms”的等位隐性可育基因；“Msf”为“Ms”的
等位显性恢复基因，三者之间的显隐关系为 Msf > Ms > ms（Feng et al.，1998）。目前已成功实现了
核不育复等位基因在不同生态型大白菜品种间及亚种间的转育交流，创制出多个不育株率和不育度
均为 100%的芸薹属 A 基因组蔬菜作物雄性不育系（冯辉 等，2007；Li et al.，2009；辛彬 等，2009）。
由于该不育源败育彻底，无不良性状伴生，且能够配制出 100%雄性不育系，其育性控制分子机制
研究更显重要（Feng et al.，2009，王丽丽 等，2010）。
植物雄性器官发育受复杂基因网络的精细调控，其中一些关键基因的突变可能引起下游众多育
性相关基因的表达发生改变，干扰花粉或花药的发育进程，从而导致雄性不育。通过比较突变株和
野生型花蕾的基因表达谱，克隆雄性不育相关基因并研究其特征特性，对于深入了解植物雄性器官
发育的分子机制具有重要意义（Kang et al.，2008；Huang et al.，2009）。
本研究中分析了不育株和可育株的基因表达差异，进而分离、克隆了1个在可育株特异性表达
而在不育株上不表达的大白菜脂质转移蛋白（Lipid-transfer protein，LTP）基因，为进一步研究脂质
代谢在大白菜花粉或花药发育过程中的作用提供素材。
1 材料与方法
1.1 试材
大白菜雄性不育两用系‘AB02’由沈阳农业大学蔬菜遗传育种课题组提供，其育性控制符合复
等位遗传模式，群体不育株基因型为 Msms，可育株基因型为 msms，不育株雄蕊深度退化，花丝短
缩，花药瘦小，可育株和不育株的其它性状高度一致。
2008 年 9 月，经春化后播种于沈阳农业大学蔬菜育种基地日光温室。当第 1 朵花开放时，鉴定
出不育株和可育株，采用混合花蕾取样策略，收集一级分枝的所有花蕾，分别构建不育花蕾池和可
育花蕾池，用于 cDNA-AFLP 分析；分别取可育株的根、花茎、花茎叶、角果、小蕾（< 1 mm）、
中蕾（1.5 ~ 2.5 mm）和大蕾（> 3.0 mm），以及可育花的花丝、花药、雌蕊、花瓣、萼片，经液氮
速冻后保存于–80 ℃，用于基因表达模式分析。
1.2 试剂
引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成；5′ RACE和3′ RACE均为Invitrogen公司产品；
dNTP、Taq酶、DNA分子量标准、凝胶回收试剂盒均购自天根公司；第1链cDNA合成采用Invitrogen
公司SuperScript Ⅲ反转录系统；T4 DNA Ligase、RNaseH、T4 DNA Polymerase、E.coli DNA
PolymeraseⅠ、限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ均购自NEB公司；T载体、RQ1 RNase-Free DNase为
Promega公司产品；大肠杆菌TOP10为辽宁省十字花科蔬菜遗传育种重点实验室保存。
1.3 cDNA-AFLP 分析与差异条带的回收
按照产品说明书，提取总 RNA 并去除所含的痕量 DNA，继而合成单链 cDNA。采用刘志勇等
（2008）所述方法合成双链 cDNA。cDNA-AFLP 体系及程序参照 Bachem 等（1996）所述方法，酶
切组合为 EcoRⅠ和 MseⅠ。选择性扩增产物经 5%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法显示条带
（Sanguinetti et al.，1994）。从总 RNA 提取到银染同时设置两次重复。
2 期 刘志勇等：大白菜核雄性不育相关基因 BrLTP1 的克隆及特征分析 345

1.4 差异条带的回收与表达模式验证
回收测序差异表达基因片段，利用 NCBI 在线 Blast 程序预测差异表达基因的功能（刘志勇 等，
2008）。
设计 6 个差异表达基因的特异性引物，以 Elongation Factor-1α 作为内标基因（表 1），利用
QRT-PCR 技术分析其在可育池和不育池上的表达模式（刘志勇 等，2008）。反应在 iQ5 荧光定量
PCR 仪上进行，方法参照天根公司荧光定量试剂盒 Real Master Mix（SYBR GreenⅠ）说明书。PCR
反应条件：95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 20 s，68 ℃延伸 20 s，共 40 个循环，每
个样本重复 3 次。采用校正表达模式分析目的基因在不同样品中的相对表达量。

表 1 用于 QRT-PCR 分析的基因特异性引物
Table 1 Gene spesific primer for QRT-PCR analysis
转录驱使片段
TDF
引物名称和引物序列（5′–3′）
Primer number and Primer sequences
TDF-3 TDF3-L：ACTCCTACCTGGGGTTTCTTTT； TDF3-R：GATTGACTTCTTGCTTCGTGC
TDF-6 TDF6-L：CCTGAAGATACAGAAGGAAAGC； TDF6-R：TGACAATACTCCATCAAAAGCC
TDF-8 TDF8-L：CTTTTGTGGGTTTAGCATTAC； TDF8-R：TCACGCTCGTATTTATAGTCA
TDF-9 TDF9-L：TGTTATTGGCTCTTGCAGCAA； TDF9-R：TCGCATCCTCTTTGGTAACG
TDF-17 TDF17-L：GCTGCGTATTCCGATGCTA； TDF17-R：GTGTTAACGAACCCGATGTT
TDF-21 TDF21-L：GATAGCATTCACACCGCTTCAC TDF21-R：ACCATTCTCCACAGCCCTCT

1.5 大白菜脂质转移蛋白基因 BrLTP1 全长 cDNA 序列的克隆
根据 TDF-25 序列，设计用于 5′ RACE 的基因特异性嵌套引物（5RLTP-1：5′-TGAGATGTCAG
GGTTGGCG；5RLTP-2：5′-AGGGAGATCAAGAGCGTTGTC-3′）和 3′RACE 嵌套引物（3RLTP-1：
5′-GACAACGCTCTTGATCTCCCT-3′；3RLTP-2：5′-CGCCAACCCTGACATCTCA-3′）。以可育株花
蕾的混合 cDNA 为扩增模板，按照试剂盒说明书分别进行 5′RACE 和 3′RACE。
将经测序验证后的 5′RACE 和 3′RACE 片段以及 TDF-25 片段进行拼接，得到全长 cDNA 序列，
命名为 BrLTP1。根据拼接序列，设计全长扩增引物（Q-L：5′-ACAAAACATTCAAACACAAGA-3′
和 Q-R：5′-GTTGAAAATTAGAAATATTATTAGA-3′），验证拼接结果。PCR 反应条件：95 ℃预变性
3 min；95 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 30 个循环；72 ℃终反应 5 min。
1.6 BrLTP1 基因特征分析
利用 DNAStar 软件分析 BrLTP1 基因最大开放阅读框，推导氨基酸序列；利用 NCBI 的在线
BLAST 程序进行同源搜索和预测保守结构域；利用 ClustalX 2.0 软件进行多序列对齐和排序，使用
GenDOC 和 MEGA4 软件输出同源比对和进化树构建结果（Tamura et al.，2007）；使用 SignalP（http://
www. cbs. dtu. dk /services/SignalP/）预测可能存在的信号肽；利用 SOSUI（http: // bp. nuap. nagoya-u.
ac. jp/sosui/）预测蛋白质的疏水性和跨膜结构域；使用 Prosite 程序推测可能存在的修饰性位点（http://
www. expasy. ch/prosite/）；蛋白质二级结构分析在 http: // www. predictprotein. org/网站上进行。
1.7 BrLTP1 基因表达模式分析
设计基因特异引物（TDF25-L：5′-TATCATCATCTAACGCCGCAAT-3′ 和 TDF25-R：5′-GAATC
ACCGAGTGGAGAAACG-3′），利用 QRT-PCR 分析 BrLTP1 在可育池、不育池，以及在可育株根、
花茎、花茎叶、小蕾、中蕾、大蕾、花丝、花药、雌蕊、花瓣和萼片上的表达模式，反应体系同
1.4 节。
346 园 艺 学 报 38 卷
2 结果与分析
2.1 ‘AB02’可育株和不育株花蕾基因表达具有明显差异
利用cDNA-AFLP技术对雄性不育两用系‘AB02’可育株和不育株花蕾的基因差异表达进行了
分析。结果显示，cDNA-AFLP 所产生的条带表达模式重复性好，128对引物组合共产生了约6 000
条长度在50 ~ 600 bp之间的TDF，可育株和不育株花蕾转录组具有明显差异，共检测到了25条差异
TDF，均表现为在可育株上特异性或优势表达，而在不育株上不表达或表达量相对较低（图1）。
序列分析表明，25个TDF为非冗余序列。除TDF-7外，其余24个TDF序列在NCBI的公共数据库
中存在同源序列（表2）。其中，TDF-25与甘蓝型油菜的1个EST（GR451396）同源性为100%，后者
来自编码LTP的Unigene（Bna.1030），说明TDF-25所在基因很可能编码LTP。
值得注意的是，TDF-5也编码LTP，暗示可能有多个LTP家族成员参与了大白菜雄配子发育过程。
利用QRT-PCR对其中6个基因的表达模式进行了验证。结果显示，6个基因在可育池和不育池之间表
达均存在显著性差异，与cDNA-AFLP结果高度一致（图1，图2）。

图 1 利用 cDNA-AFLP 获得的部分差异表达基因
F. 可育株混合花蕾；S. 不育株混合花蕾。
Fig. 1 Differentially expressed genes abtained by cDNA-AFLP
F. Fetile bud pool；S. Sterile bud pool.


图 2 差异表达基因的 QRT-PCR 验证
F. 可育株混合花蕾；S. 不育株混合花蕾。
Fig. 2 Expression validation of differentially expressed genes by real-time RT-PCR
F. Fetile bud pool；S. Sterile bud pool.

2 期 刘志勇等：大白菜核雄性不育相关基因 BrLTP1 的克隆及特征分析 347

表 2 TDF序列同源性比较结果
Table 2 Analyses of TDF sequences similarity using Blast
转录驱使片段
TDF
长度/bp
Length
功能预测
Function characterization
E-值
E-value
一致性/%
Identity
TDF-1 244 拟南芥未知功能蛋白
Unknown protein[Arabidopsis thaliana]X
1.00e-22 86
TDF-2 102 拟南芥液泡膜内在蛋白
Delta tonoplast integral protein[A. thaliana]U
98.8
TDF-3 84 大白菜花粉 cDNA 文库 EST
EST from pollen cDNA library[Brassica. rapa]N
6e-29 100
TDF-4 246 推测的拟南芥胶质乙酰酯原酶
Putative pectinacetylesterase precursor[A. thaliana]X
2.00e-23 75
TDF-5 173 推测的拟南芥脂质转移蛋白
Putative lipid transfer protein[A. thaliana]X
9.00e-15 65
TDF-6 330 拟南芥 F-box 蛋白
F-box family protein[A. thaliana]X
3.00e-16 50
TDF-7 61 功能未知 Function unknown
TDF-8 302 拟南芥裂解酶
Lyase[A. thaliana]X
1.00e-35 82
TDF-9 75 拟南芥氨基酸转运蛋白
Amino acid transporter family protein[A. thaliana]X
93.8
TDF-10 182 拟南芥羧肽酶 Y 类似蛋白
Carboxypeptidase Y-like protein[A. thaliana]X
6.00e-22 85
TDF-11 280 甘蓝过氧物酶
Peroxidase[Brassica oleracea]X
2.00e-36 98
TDF-12 149 推测的拟南芥丝氨酸蛋白酶
Putative cysteine proteinase[A. thaliana]X
7.00e-09 81
TDF-13 286 拟南芥内在膜蛋白
Integral membrane family protein[A. thaliana]X
5.00e-16 89
TDF-14 83 大白菜花蕾 cDNA 文库 EST
EST from floral bud cDNA library[B. rapa]N
5e-35 100
TDF-15 116 拟南芥含有 PH 结构的蛋白
Pleckstrin homology domain-containing protein[A. thaliana]X
2.00e-06 86
TDF-16 85 大白菜花粉钙结合蛋白
Pollen calcium-binding protein[B. rapa]X
8.00e-08 100
TDF-17 78 拟南芥果胶甲酯酶
Pectin Methylesterase[A. thaliana]P
0 76
TDF-18 105 拟南芥丝氨酸蛋白酶
Cysteine proteinase[A. thaliana]
5.00e-13 88
TDF-19 95 拟南芥液泡膜 H+-ATPase
Vacuolar proton-ATPase subunit[A. thaliana]X
8.00e-08 93
TDF-20 104 拟南芥未知功能蛋白（AT3G48660）mRNA
Unknown protein（AT3G48660）mRNA[A. thaliana]N
1.00e-28 90
TDF-21 331 受体丝氨酸/苏氨酸激酶
Receptor serine/threonine kinase[A. thaliana]X
3.00e-52 90
TDF-22 94 甘蓝型油菜 mRNA 序列
mRNA sequence[Brassica napus]N
5.00e-41 100
TDF-23 154 拟南芥钙结合蛋白
Calcium-binding protein[A. thaliana]X
5e-19 90
TDF-24 123 拟南芥果胶甲酯酶
Pectin methylesterase[A. thaliana]X
1e-11 82
TDF-25 95 甘蓝型油菜 EST（GR451396）
EST（GR451396）[B. napus]N
2e-41 100
注：X、N和P分别代表BlastX、BlastN和BlastP分析。U代表基于Unigene的分析结果。
Note：X，N and P represented similarity analyses of TDF sequences using BlastX，BlastN and BlastP，respectively. U represented the analyses
abased on relevant unigenes.

2.2 大白菜脂质转移蛋白基因 BrLTP1 全长基因的克隆
利用 5′ RACE 锚定引物和引物 5RLTP-2 扩增出 1 条约 400 bp 的条带（图 3，A），测序表明扩
增片段中已经包括连续的 10 个胞嘧啶，且与 TDF-25 有 9 个碱基的重合（不包括引物部分），说明
已经扩增得到完整的 cDNA 5′ 端。3′ RACE 锚定引物和引物 3RLTP-2 扩增出 1 条约 400 bp 的条带
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（图 3，B），测序表明扩增片段与 TDF-25 有 35 个碱基的重合（不包括引物部分），且含有 16 个腺
嘌呤，说明已经获得了完整的 cDNA 3′ 末端序列。以上序列和 TDF-25 拼接，从而获得全长 cDNA
拼接序列。以此全长 cDNA 序列为基础设计基因特异引物，扩增得到目标基因的全长 cDNA 序列。
测序结果表明，该全长 cDNA 序列与前述 5′和 3′ RACE 片段拼接结果完全一致，全长均为 750 bp（图
3，C），命名为 BrLTP1（Brassica rapa Lipid-Transfer Protein 1）。
图 3 BrLTP1 基因的 5′ RACE（A）、3′RACE（B）以及全长 cDNA（C）扩增结果
M：DNA 标准分子量。1，2，3 分别为 5′RACE、3′RACE 以及全长 cDNA 扩增产物。
Fig. 3 PCR products of 5′ RACE（A），3′ RACE（B）and the full-length cDNA（C）of BrLTP1
M：DNA marker. 1，2 and 3 indicate the products of 5′ RACE，3′ RACE and
full length cDNA of BrLTP1，respectively.
2.3 BrLTP1 基因特征分析
2.3.1 核酸序列分析
利用 DNAStar 软件对 BrLTP1 基因序列进行分析，发现其最大开放阅读框为 552 bp，起始密码
子 ATG 始于第 80 位，终止密码子 TGA 终于第 631 位，预测编码一个含有 183 个氨基酸的蛋白质。
起始密码子 ATG 上游-3 位核苷酸为 A，+4 位为 G，是一个典型的 KozaK 结构，这一结构对于蛋白
质合成的 40S 起始复合物正确识别启始密码子具有很重要的作用。3′-UTR 的碱基组成极不平衡，A/T
含量达到 79.8%，可能与基因调控有关（图 4）。


图 4 BrLTP1 基因的 cDNA 及推导的氨基酸序列
下划线部分为信号肽；阴影加框线部分为 AAI 结构域。
Fig. 4 Nucleotide sequence of tomato BrLTP1 cDNA and deduced amino acid sequence
The signal peptide is underlined；Shaded frame indicates the conserved AAI domain.
2 期 刘志勇等：大白菜核雄性不育相关基因 BrLTP1 的克隆及特征分析 349

2.3.2 蛋白序列分析
BrLTP1 分子量为 18.23 kD，等电点（PI）为 7.534，pH 7.0 时的电荷为 0.829。BrLTP1 蛋白质
含有 8 个强碱性氨基酸（K，R），7 个强酸性氨基酸（D，E），64 个疏水氨基酸（A，I，L，F，
W，V），64 个极性氨基酸（N，C，Q，S，T，Y）。signalP3.0 预测表明，BrLTP1 存在信号肽的
可能性为 0.993，Ser22 ~ Arg23 为前体蛋白剪切位点的可能性为 0.899。经 SOSUI 分析，发现 BrLTP1
为膜蛋白，含有 1 个跨膜结构域（1 ~ 21）。
通过 Prosite 数据库查询，发现 BrLTP1 含有 10 个 N–豆蔻酰化位点（29 ~ 34、30 ~ 35、31 ~ 36、
33 ~ 38、121 ~ 126、122 ~ 127、142 ~ 147、144 ~ 149、147 ~ 152 和 168 ~ 173），2 个 N–糖基化
位点（93 ~ 96、126 ~ 129）以及 1 个 PKC 磷酸化位点（132 ~ 134）。SMART 分析表明，在 42 ~ 115
位存在 AAI 结构域。通过 PredictProtein 预测 BrLTP1 蛋白质的二级结构，表明该蛋白含有 37.6%的
α 螺旋、3.28%的 β 折叠和 59.56%的环状结构。以上分析结果表明，BrLTP1 为具有前导信号肽的膜
蛋白，其功能可能与脂质转移相关，推测出的多个修饰性位点可能对蛋白的加工或者对生物功能调
节具有重要作用。
经氨基酸序列同源搜索和多序列比对，发现BrLTP1与拟南芥protease inhibitor/seed storage/LTP
family成员NP_173264同源性达到60%，与其他LTP家族成员的同源性很低（< 30%），但BrLTP1半
胱氨酸位置符合植物LTP的保守性（图5）。
利用MEGA 4.0软件采用比邻法对大白菜拟南芥、白菜、蓖麻等植物LTPs的亲缘关系进行了分
析，结果表明BrLTP1与Boutrot等（2008）所报道的拟南芥LTP，Tian等（2009）公布的白菜LTP蛋
白（ABQ63061）的亲缘关系均较远，与拟南芥LTP蛋白 NP_173264和蓖麻XP_002530788的亲缘关
系较近，处于同一分枝（图6）。
值得注意的是，BrLTP1、XP_002530788和NP_173264分子量明显大于其它已报道的LTP蛋白，
主要在于其拥有一个延长的C–末端。


图 5 BrLTP1 和其他植物脂质转移蛋白的氨基酸序列多重比对
XP_002530788 来自蓖麻，ABQ63061 来自白菜，其余蛋白序列来自拟南芥。
Fig. 5 Multiple sequence alignment of amino acid sequence of BrLTP1 and lipid transfer proteins in other plants
XP_002530788（Ricinus communis）；ABQ63061（Brassica rapa subsp. campestris）；
Other sequences are from A. thaliana.

350 园 艺 学 报 38 卷
图 7 利用QRT-PCR检测BrLTP1在可育池和
不育池之间的表达差异
F，S分别代表可育池和不育池。
Fig. 7 Amplification of BrLTP1 in female pool and male
pool by QRT-PCR.
F：Fetile bud pool；S：Sterile bud pool.
图 8 BrLTP1基因表达模式分析
1 ~ 12 分别代表雄性不育两用系‘AB02’可育株的根、茎、叶、
大蕾、中蕾、小蕾、角果、萼片、花丝、花药、花瓣和雌蕊。
Fig. 8 Gene expression analysis of BrLTP1
1–12 represent root，stem，leaf，big floral bud，middle floral bud，
small floral bud，silique，sepal，filament, anther，petal and
pistil of fertile plants in‘AB02’，respectively.
图 6 BrLTP1和其他植物脂质转移蛋白的氨基酸序列系统进化树
XP_002530788 来自蓖麻，ABQ63061 来自白菜，其余蛋白序列来自拟南芥。
Fig. 6 Phylogenetic tree of amino acid sequence of BrLTP1 and lipid transfer proteins in other species
XP_002530788（Ricinus communis）；ABQ63061（Brassica rapa subsp.campestris）；
Other sequences are from A. thaliana.
2.4 BrLTP1 基因表达模式分析
QRT-PCR 分析表明，BrLTP1 在可育花蕾中的表达量约为不育花蕾的 30 倍，同 cDNA-AFLP 结
果一致，说明 BrLTP1 的表达在不育系中受到了强烈抑制（图 7）。
在 12 个组织和器官中，BrLTP1 在小蕾中的表达量最低，在大花蕾、花药以及花瓣中的表达量
较高，分别约为小蕾中表达量的 860 倍、235 倍和 395 倍（图 8）。以上结果表明，BrLTP1 在花器官
优势表达，是一个雄性不育相关基因。
2 期 刘志勇等：大白菜核雄性不育相关基因 BrLTP1 的克隆及特征分析 351

3 讨论
脂类不仅是细胞的主要组成成分之一，而且一些脂质分子作为第二信使参与了动植物细胞功能
的调节，在细胞信号转导中构成脂类信号通路（Raffaele et al.，2009）。非特异性脂质转运蛋白
（nsLTPs）在植物的生长发育、抗逆过程中具有广泛的生物学功能，而其在生殖发育中的作用备受
关注（Blein et al.，2002；Imin et al.，2006）。nsLTP蛋白由多基因家族编码，具有多种异构体（Boutrot
et al.，2008）。目前，研究者已经得到多个在植物雄性器官特异性或优势表达的nsLTP。Ariizumi等
（2002）发现拟南芥LTPl2表达出现在花粉发育的单核和二核花粉阶段，并进一步定位在绒毡层，它
的功能被认为在花粉发育过程中从绒毡层到花粉外壁传递脂质。在水稻、桃的生殖器官以及油菜绒
毡层和小孢子中也存在特异表达的LTP基因，可能参与了雄性生殖器官中花粉壁发育所需物质的累
积积淀（Foster et al.，1992；Botton et al.，2002；Boutrot et al.，2007）。对白菜核雄性不育mmc突变
体与其野生植株花蕾差异表达分析中，发现了1个推测的LTPs基因BcMFl5，该基因在野生型植株花
蕾和嫩角果中特异表达，而在mmc突变体没有任何表达，这表明它与白菜花粉发育密切相关（Tian et
al.，2009）。Chen等（2009）利用拟南芥ATH1芯片分析了甘蓝型油菜雄性不育系S45AB可育株和
不育株花蕾的基因表达谱，其中1个LTP基因在不育株上受到强烈抑制。
作者通过比较分析大白菜复等位核雄性不育系统可育株（msms）和不育株（Msms）花蕾的基
因表达谱，共获得25个差异表达基因片段，其中2个编码LTP，暗示了‘AB02’雄性不育性的形成
可能与脂质代谢的异常有关。进一步的序列分析和基因表达表明，BrLTP1为花器官优势表达基因，
推测的BrLTP1蛋白含有典型的N端信号肽、保守的AAI结构域和半胱氨酸骨架，但与以前所报道的
LTP有很大的不同。首先，BrLTP1分子量远远大于以往报道的植物LTP；其次，LTPs往往含有保守
的钙调素结合位点，可能参与钙调素所介导的信号转导（Tian et al.，2009），但BrLTP1并不含有此
位点。由于在复等位核不育系统中，不育株和可育株在转录组上存在明显差异，BrLTP1只是其中之
一，它在雄性不育性形成中的角色尚未得知。与BrLTP1同源性最高的蛋白为拟南芥NP_173264。在
Pfam数据库中，NP_173264被归为独立的基因家族（protease inhibitor/seed storage/LTP family) ，目
前该家族成员的功能还是未知的。作者已从ABRC购买了NP_173264的T-DNA插入突变体，欲通过
分析野生型与突变体的育性差异，进而推测BrLTP1的可能功能。同时，构建了BrLTP1的RNAi载体，
拟在正常可育品系中沉默该基因，研究其在植物雄配子发育过程中的具体功能。

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