全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（7）：1361–1368 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–01–14；修回日期：2014–05–28
基金项目：国家自然科学基金项目（31171964，31101552）；‘十二五’农村领域国家科技计划项目（2012AA100102-5）；农业科研杰出
人才培养计划项目；河北省自然科学基金项目（C2010000677，C2014204093）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20101302120006）；
河北省高等学校科学技术研究项目（Z2010149）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yywyh@hebau.edu.cn）
利用小孢子培养创建大白菜—结球甘蓝易位系
胡永霞，李晓峰，轩淑欣，申书兴，王彦华*
（河北农业大学园艺学院，河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室，河北保定 071001）
摘 要：为创建大白菜—结球甘蓝易位系，以大白菜—结球甘蓝 3 号单体异附加系（AA + C3）为试
材，进行了游离小孢子培养，利用结球甘蓝 C02 连锁群相对于大白菜的特异 InDel 标记对获得的小孢子植
株进行鉴定，从 17 个小孢子植株中筛选出 1 个具有结球甘蓝特异条带的植株。通过对 InDel 标记的加密
设计，明确了该植株中外源甘蓝片段的大小为 1.03 Mb。利用大白菜 A 基因组 10 个连锁群上均匀分布的
100 个 InDel 标记对其进行分子鉴定，初步确定了该植株中甘蓝染色体片段位于大白菜 5 号染色体上。花
粉母细胞减数分裂观察结果显示，该植株染色体数为 20 条，为添加结球甘蓝 3 号染色体片段的大白菜—
结球甘蓝易位系。
关键词：大白菜；结球甘蓝；小孢子培养；易位系；InDel 标记
中图分类号：S 634.1；S635.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1361-08

Obtaining of One Chinese Cabbage–Cabbage Translocation Line by
Microspore Culture
HU Yong-xia，LI Xiao-feng，XUAN Shu-xin，SHEN Shu-xing，and WANG Yan-hua*
（College of Horticulture，Agriculture University of Hebei，Key Laboratory for Vegetable Germplasm Enhancement and
Utilization of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China）
Abstract：In order to create Chinese cabbage–cabbage translocation lines，isolated microspores of
Chinese cabbage–cabbage monosomic addition lines 3#（AA + C3）were cultured. Through identifying the
obtained microspore plants by specific InDel markers located on Linkage group C02 of cabbage，one plant
which has cabbage specific bands was identified from seventeen microspore plants. By designing multiple
InDel markers around the targeted region，the exogenous cabbage fragment size is clarified as 1.03 Mb in
this plant. Using one hundred InDel markers uniformly distributed on ten A genome linkage groups of
Chinese cabbage，the chromosome fragment of cabbage was preliminary determined on the 5# chromosome
of Chinese cabbage. Meiosis behavior of this translocation line showed that the chromosome number of
this plant is twenty，which is identified as one translocation line introduced one segment of chromosome
3# in cabbage.
Key words：Chinese cabbage；cabbage；microspore culture；translocation line；InDel markers


1362 园 艺 学 报 41 卷
通过染色体易位将近缘种中的有益基因导入目标作物是作物改良最有效的途径之一（Li et al.，
2013）。异源易位系具有携带非目的 DNA 片段少、遗传稳定、利用价值高的突出优点。自从 Sears
（1956）首次将小伞山羊草的抗叶锈病基因易位到小麦 6B 染色体上以来，仅小麦近缘植物的易位
系就有 60 多个（Luan et al.，2010；Li et al.，2012；Wang & Chen，2012；An et al.，2013）。在蔬菜
作物上，南京农业大学已创建了抗霜霉病（曹清河 等，2005）和枯萎病（钱春桃 等，2006）的黄
瓜异源易位系；吴进义等（2013） 用 60Co-γ 射线辐照西瓜种子诱变培育了染色体易位系。
大白菜（Brassica compestris ssp. pekinensis，AA）育种一直存在着遗传基础单一的主要瓶颈，
利用易位系导入携带有益基因的某条外源染色体或片段，成为改良品种的重要手段。结球甘蓝
（Brassica oleracea var. capitata，CC）与大白菜同属十字花科芸薹属，具有抗逆性强、耐抽薹、耐
旱等优良特性。研究表明，大白菜 A 基因组与结球甘蓝 C 基因组具有部分同源关系，为引进甘蓝
有益基因提供了机会（Mason et al.，2012）。
本实验室自 2008 年起开展大白菜—结球甘蓝异附加系的选育与鉴定，先后获得整套大白菜—
结球甘蓝异附加系（吕文欣 等，2011）。本研究中以大白菜—结球甘蓝 3 号单体异附加系为材料，
进行游离小孢子培养，并对获得的小孢子植株进行细胞学、形态学及 InDel 标记鉴定，筛选出携带
有甘蓝优良性状基因并且能够稳定遗传的纯合异源易位系，为加速大白菜的品种改良奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为大白菜—结球甘蓝 3 号单体异附加系（AA + C3）及其大白菜亲本‘85-1’（AA，2n =
20）和结球甘蓝亲本‘11-1’（CC，2n = 18）。以上材料由农业部蔬菜分子染色体工程与新品种选育
团队提供。
1.2 异附加系植株的小孢子培养
大白菜—结球甘蓝 3 号单体异附加系组培苗于 2012 年 1 月移栽到温室，3 月定植到田间，常规
管理。在异附加系开花初期，挑选适宜大小的花蕾进行小孢子培养（申书兴 等，2006），每次取花
蕾 30 个，在生物倒置显微镜下观察胚状体发生的过程，3 周后统计出胚情况。胚状体发育到子叶期，
将子叶胚接种于MS固体培养基上，在 25 ℃条件下进行植株再生。将获得的小孢子植株移接到1/2MS
生根培养基上，于 2013 年 1 月将小孢子植株定植于温室。
1.3 小孢子植株的 InDel 标记鉴定
DNA 提取采用改良的 CTAB 法，并用 0.8%的琼脂糖对提取的 DNA 进行检测。
与结球甘蓝 3 号染色体对应的 C02 连锁群特异 InDel（insertion-deletion）标记序列由中国农业
科学院蔬菜花卉研究所提供，大白菜A基因组10个连锁群的100个 InDel标记来源于http：//brassicadb.
org/brad/（高颖，2012）。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
采用本实验室筛选出的 22 个结球甘蓝 C02 连锁群特异的 InDel 标记（表 1）对试验材料进行
PCR 扩增：94 ℃变性 3 min，94 ℃变性 45 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，此后每个循环退火温
度降低 0.5 ℃，共计 10 个循环；94 ℃变性 45 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，25 个循环；72 ℃
延伸 5 min，4 ℃保存。
扩增产物用 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后利用银染的方法进行检测，照相。

7 期 胡永霞等：利用小孢子培养创建大白菜—结球甘蓝易位系 1363

表 1 甘蓝 C02 连锁群特异 InDel 标记
Table 1 Specific InDel markers from C02 linkage groups of cabbage
InDel 标记
InDel marker
物理位置/bp
Physical location
5′引物序列
5′ primer sequence
3′引物序列
3′ primer sequence
C02-2 1 148 019 GACACTTGTTTCTTTCTCGC TGTTTTAACCAGTGTTGCTG
C02-3 2 127 233 ACAAGAAACCATTGGATCAG TGTGATTGGAACTCAGTCAA
C02-4 3 944 891 TCTATCGGTTGGACCTAAAA GACTAGGCAGGAAGCACTAA
C02-5 5 387 293 ACGCAATGTAGACAAGAACC TTGGATCCTCTTCTTGATTC
C02-6 6 761 923 ATGAGCAAAATAGAAGGCAC CAAATCTCCCACACATTTCT
C02-7 8 410 397 ATAAAAGGCCATACAGTCCA ATGTCTAGCCGTGTTGTCTC
C02-8 9 259 575 TGATACGCCTCAATACTGGT TGGAATTGCTAAAGTATGGG
C02-9 10 672 209 GCACCACTAAAAACTTCCAC GATCCATCACTTGTCGATTT
C02-10 12 440 349 CTCACACACACCAAACACAT GTCATACGGACCTAATCTGAA
C02-12 14 909 364 TGCCGGTAGAGAATAAAGAA CAAAGATAGCACAAAAACCC
C02-13 15 574 918 AGGGATGTTCCCATTCTACT AAGTTGTGTCTCTTTTTGGC
C02-14 18 096 496 GTAATTTAACCGGAAATGGC CTTCCATGCAGAACTCTGTT
C02-15 18 786 494 ACCTAACGTTGTGGATTTGT TATTTCAGTTTCCCGACACA
C02-16 19 965 249 ACATTCCATTTACCTGTTGC GTTTATGCTCGAAGTTGGTC
C02-17 26 147 801 GTTCTGAACAAAACAGCTCA GTTCATCTTGCTGATAAGGC
C02-18 32 286 015 TTTCTGGAAGTATTGTGCCT GGGTTGTCGACTATGTTTGT
C02-19 34 568 194 TAAATTGTATACCCGAACCG TACTATTTCAAGTGCCCGTT
C02-20 36 732 119 GCAACCACCTATTCACTGTT TGAAAGTGTTATACGGGAGG
C02-22 38 349 354 AGCAACTCTTACATGACGCT ACCACACTGCTCAGGTAAAT
C02-23 40 978 471 GATTTTGTGGTTAGCTTTGG AACACTGTTCAAAATGGGTC
C02-24 42 101 407 CAACAACCACTAAATTCACC CCTAATAGAGATCTTTTGCGTG
C02-25 42 739 836 CCGGTTTATAAAACTCCACA AGATTCACATGGTACAAGGG

1.4 小孢子植株的细胞学鉴定
在小孢子植株开花初期，于 9—11 时采集大小适宜的花蕾，并将其用卡诺固定液固定 48 h，转
至 70%的乙醇中，置于 4 ℃冰箱中保存。选取雄蕊长度是雌蕊的 1/2 ~ 2/3 的花蕾，剥取花药，用丙
酸—铁—水合三氯乙醛—苏木精染色，观察花粉母细胞减数分裂过程并显微照相（雷孟平 等，2013），
从中获得染色体数为 20 的大白菜—结球甘蓝异源易位系植株。
1.5 大白菜—结球甘蓝易位系植株的田间性状观察
以二倍体大白菜和结球甘蓝亲本为对照，对大白菜—结球甘蓝易位系植株进行营养生长时期田
间性状观察，主要包括株高、株展、球高、球粗、球形指数、株形、外叶形状、叶缘、叶色、叶面
茸毛、叶球抱合情况和叶球形状等。
2 结果与分析
2.1 异附加系小孢子植株的获得
对大白菜—结球甘蓝 3 号单体异附加系植株进行了游离小孢子培养，对小孢子植株再生过程进
行观察，结果表明，培养约 20 d 后绝大多数小孢子胚发育成子叶形胚，但存在球形胚、心形胚、鱼
雷形胚和畸形胚并存的不同步现象（图 1，A）。成熟的子叶形胚接种到固体培养基上，一般能够再
生出芽，进而成苗（图 1，B），最后转接到 1/2MS 培养基促其生根成为完整的再生植株（图 1，C）。
共接种花蕾 105 个，出胚数为 104 个；共接种子叶形胚 70 个，最终获得再生植株 17 株。

1364 园 艺 学 报 41 卷
图 3 结球甘蓝 InDel 标记 C02-5-18（A）、C02-5-19（B）、C02-5-20
（C）和 C02-5-21（D）在小孢子植株的扩增
1：大白菜；2：结球甘蓝；3：11 号小孢子植株。
Fig. 3 Amplification results of cabbage InDel markers C02-5-18
（A），C02-5-19（B），C02-5-20（C）and C02-5-21（D）
in the microspore derived plant
1：Chinese cabbage；2：Cabbage；3：The No.11
microspore derived plant.
图 2 结球甘蓝 InDel 标记 C02-5 在小孢子植株中的扩增
1：大白菜；2：结球甘蓝；3 ~ 19：小孢子植株。
Fig. 2 Amplification results of C02-5 InDel marker of cabbage
in the microspore derived plant
1：Chinese cabbage；2：Cabbage；
3–19：The microspore derived plant.

图 1 AA + C3 异附加系小孢子植株再生过程
A：发育不同步的胚状体；B：成熟的胚状体转接生长；C：再生植株。
Fig. 1 Plant regeneration with microspore culture in AA + C3 monosomic alien addition lines
A：Microspore-derived embryos at different development stages；B：Regenerated shoots；C：Regenarated plant.

2.2 小孢子植株的分子鉴定
利用结球甘蓝 02 连锁群的 22 个特异 InDel 标记（表 1）分别对二倍体大白菜亲本‘85-1’，结
球甘蓝亲本‘11-1’，以及获得的小孢子再生植株进行 PCR 扩增。结果表明，仅有 InDel 标记 C02-5
在 11 号小孢子植株中扩增出与甘蓝亲本一致的片段（图 2），而其它标记在小孢子植株中扩增结果
均与大白菜亲本相同，表明 11 号小孢子植株插入了甘蓝 C02 连锁群 5 387 293 bp 位置的片段。针对
C02 连锁群 5 387 293 bp 位置进行了上下游标记的加密设计，然后利用 5 387 293 bp 上下游的 28 个
InDel 标记（表 2）对其进行进一步鉴定，结果表明，标记 C02-5-18、C02-5-19、C02-5-20 和 C02-5-21
在 11 号小孢子植株能扩增出特异条带（图 3），其它标记没扩增出特异条带，从而确定插入的甘蓝
片段的位置为 5 280 822 bp 与 6 314 397 bp 之间，大小约为 1.03 Mb。


为了探明甘蓝染色体片段插入大白菜染色体的具体位置，利用均匀分布于大白菜 A01 ~ A10 连
锁群的 100 个 InDel 标记对该植株进行了分子鉴定。结果表明，100 个 InDel 标记中 99 个标记在 11
号小孢子植株中的扩增结果均与大白菜亲本相同，只有标记 A05-1（片段物理位置为 57 480 bp）在
该植株中仅扩增出与甘蓝亲本一致的条带，未扩增出大白菜亲本的片段（图 4），表明 11 号小孢子
植株在大白菜 A05 连锁群（即 5 号染色体）的 57 480 bp 位置插入了甘蓝片段。
7 期 胡永霞等：利用小孢子培养创建大白菜—结球甘蓝易位系 1365

表 2 甘蓝 C02 连锁群特异 InDel 标记
Table 2 Specific InDel primer pairs from C02 linkage groups of cabbage
InDel 标记
InDel markers
物理位置/bp
Physical location
5′引物序列
5′ primer sequence
3′引物序列
3′ primer sequence
C02-5-1 4 848 973 ATGAATCTAGCCAGAAAGCA AGTACTGGAGCAAGAATCCA
C02-5-2 4 877 318 CTATCACTCATCATGCCAAA TGACACACAAGCCACTAAAA
C02-5-3 4 881 492 TCCATTAACGAGTGTTTAGG TACAAAAACAGTTTGCCCAC
C02-5-4 4 898 593 GAGACAGTGCATGCGTAATA TGTACCCAACAACCTCATAA
C02-5-5 4 898 625 AATCTCGATATCCGATTGTG AACATAGCATAAGAGGCACG
C02-5-6 4 909 813 ACACTCAAGTTAATGGGTTG TGTTAGTTATGAATTCCCCG
C02-5-7 4 984 793 CCAGGGTATTTCCAAGGC GGTTCAGGTGGCAAGTAGT
C02-5-8 4 985 209 GGGGGTTTTCTTAATGGTT ATGAACACTAGGCTCTCGTT
C02-5-9 4 985 338 TGCAAGTTTTGTCTAGGTTC CTACCAAACTTGTTCTTCGC
C02-5-10 4 992 675 TGTACGTACGTGCGTGTAT ACGCTCTTTCTGTTTCTGTC
C02-5-11 5 095 313 CTCGTAAATCTCGCAATTCT TTGCCTTCCACTACACCTTA
C02-5-12 5 112 994 GCCTTGTATTGACCAATTTC CCGTTAATGGGTAATGTGAA
C02-5-13 5 114 208 TTTAACTCGCTCGTACCTTC TGTTCTGTAGTCGTTGATGC
C02-5-14 5 128 331 AAGAAGAAGGACGTTGAACA CTCTAATGCAAAAGACACCC
C02-5-15 5 130 369 TTGTCGTCAGCAATAACAAG CATGCCTTGGAGTTACATAAG
C02-5-16 5 131 088 CATTGCCAAGAAAATGCAC TTTGGATTCCTTTAGCAGAG
C02-5-17 5 142 055 ACGTTAAAATGGGACTGATG TGTGGCTTTGACTATGAATG
C02-5-18 5 280 822 ACGTTTCCTGAACCTAATAGAC GTGGGAATGAGATGAGATTG
C02-5-19 5 383 113 ACATACAGAAAATGGTGGCT GAGTACTGCCAGAAGAGGAG
C02-5-20 6 266 734 TCAACCACTTATCGTCACAA AAGACTCCTTCCTCTCTTGG
C02-5-21 6 314 397 GCACACTGCTTTTTCTCTCT GCAGAGAATCAGAGTCCAAG
C02-5-22 6 346 462 TGGTGATCCTCTTTGATACC CCTGAAGAGGTAACTTCTGGT
C02-5-23 6 351 001 GTTCGAGCTGATATTGATGA CCAGAAGCCAAGAAGAAAC
C02-5-24 6 408 615 CGATGGTTGATGATTCTCTT GAGAAGGAAAGTCACACGAG
C02-5-25 6 481 348 CGGAGCATAATTTTCCTGT TAACAAACAAGTACCACCCC
C02-5-26 6 482 871 CCCAACATCTCTTTTTGTTC GTTTGTCTGAATCCACCAAT
C02-5-27 6 493 866 GTTGTAATATGTGGGTGGGA AAGATTCATCTACCCAAGCA
C02-5-28 6 515 878 TTCTGAGGAAGTGGAGGTC CACTGTCAGAACCTTCATCA




图 4 大白菜 InDel 标记在小孢子植株中的扩增
1：大白菜；2：结球甘蓝；3：11 号小孢子植株。
Fig. 4 Amplification results of Chinese cabbage InDel markers in the microspore derived plant
1：Chinese cabbage；2：Cabbage；3：The No.11 microspore derived plant.

2.3 小孢子植株的细胞学鉴定
对具有结球甘蓝条带的 11 号小孢子植株进行花粉母细胞减数分裂观察，在减数分裂终变期，
花粉母细胞以 10 个二价体（10II）的联会形式存在（图 5，A）；中期Ⅰ大部分细胞的染色体排列
于赤道板（图 5，B）；后期Ⅰ染色体以 10-10 的分离方式分离（图 5，C）；后期Ⅱ染色体以 10-10-10-10
形式的分离（图 5，D）。说明该植株染色体数为 2n = 20，为大白菜—结球甘蓝整倍体异源易位系。
1366 园 艺 学 报 41 卷

图 5 小孢子植株的减数分裂观察
A：终变期；B：中期Ⅰ；C：后期Ⅰ；D：后期Ⅱ。
Fig. 5 Miosis of the microspore plant
A：Diakinesis；B：MetaphaseⅠ；C：AnaphaseⅠ；D：AnaphaseⅡ.
2.4 易位植株的田间性状观察
田间性状调查结果表明，该易位植株营养生长期表现出外叶近圆形、叶缘钝锯、叶面有少量的
刺和茸毛（图 6，A）等与二倍体大白菜亲本‘85-1’（图 6，B）相似的性状，叶色表现为与结球
甘蓝亲本‘11-1’（图 6，C、F）相似的灰绿色。此外，还表现出株形平展、开展度变小、叶面稍
皱、叶球舒心、叶球直径变小（图 6，D）等不同于大白菜亲本‘85-1’（图 6，E）的独特性状。


图 6 易位植株的田间性状
A、D：易位植株；B、E：大白菜；C、F：结球甘蓝。
Fig. 6 Field characters of translocation lines
A，D：The translocation plants；B，E：Chinese cabbage；C，F：Cabbage.
3 讨论
自 20 世纪 50 年代以来，在小麦上广泛开展了异源易位系创制方法的研究，先后建立了利用远
缘杂交、辐射诱变、Ph 基因突变体、组织培养和杀配子染色体等诱导易位系的程序（陈升位 等，
2008）。为了解决传统创制易位系方法育种周期较长、效率不高的难题，石丁溧等（2008）提出了
一种以单体异附加系为起始材料创制易位系的方法，该方法可利用异源单价体遗传不稳定性和在减
数分裂中出现高频断裂和重融等现象，使破碎的外源染色体小片段随机整合到受体染色体上的不同
位置，形成各种小片段易位系。李瑞芬等（2006）采用单体异附加系花药培养方法创制了小麦—中
间偃麦草纯合易位系。与花药培养相比，游离小孢子培养具有不受母体组织影响，一次培养产胚量
大等优点，能够显著提高纯合易位系的获得率。但到目前为止，利用单体异附加系小孢子培养技术
7 期 胡永霞等：利用小孢子培养创建大白菜—结球甘蓝易位系 1367

创建易位系新种质的研究国内外鲜有报道。
目前，麦类作物易位系中外源染色体片段的鉴定方法主要采用基因组原位杂交（Genomic in situ
hybridization，GISH）（Song et al.，2013）。已有研究表明，芸薹属中 A、C 染色体组间亲缘关系较
近，采用常规的GISH很难区分，而以 rDNA为探针的荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，
FISH）只能区分 A 和 C 基因组的部分染色体（孔芳 等，2008）。尽管 Howell 等（2008）在甘蓝型
油菜中利用 45S rDNA 及甘蓝染色体特异的 BAC 作为探针连续进行了 FISH 和 GISH 两次重复杂交，
但仍有两条 C 基因组的染色体无法区分。SSR 标记作为一种共显性的标记，不仅多态性高，稳定性
好，且操作简单，广泛应用于麦类作物易位系的鉴定中（Cseh et al.，2011；徐皖彬 等，2012；Kruppa
et al.，2013）。目前本实验室已建立了结球甘蓝相对于大白菜的连锁群特异 SSR 标记，并成功用于
大白菜—结球甘蓝异附加系中外源染色体的鉴定（顾爱侠 等，2009）。但由于获得的结球甘蓝每个
连锁群特异性 SSR 标记较少，无法精确鉴定大白菜—结球甘蓝易位系中外源染色体片段。随着芸薹
属植物基因组学的发展，各种新型的分子标记被开发应用，如基于基因组测序的 InDel（insertion-
deletion）标记，具有数量多，扩增产物稳定和易于检测等优点，基本可以满足精细定位外源染色体
片段的需要。本研究利用实验室筛选出的结球甘蓝 C02 连锁群特异 InDel 标记，对大白菜—结球甘
蓝 3 号单体异附加系小孢子植株进行鉴定，从中筛选出 1 个添加结球甘蓝 3 号染色体片段的大白菜
—结球甘蓝纯合易位系，利用加密设计的甘蓝 C02 连锁群特异 InDel 标记明确了外源甘蓝片段的大
小为 1.03 Mb。为了探明甘蓝染色体片段插入大白菜染色体的具体位置，利用大白菜 A 基因组 10 个
连锁群上均匀分布的 100 个 InDel 标记进行分子鉴定，初步确定了甘蓝染色体片段位于大白菜 5 号
染色体上。
本研究中首次采用单体异附加系小孢子培养技术创建易位系新种质，并利用 InDel 标记对易位
系中外源染色体片段的大小及位置进行分子鉴定，建立了大白菜—结球甘蓝异源易位系的高效诱导
及鉴定方法。目前，对于该易位系中外源甘蓝片段对大白菜基因表达的影响正在做进一步的研究。

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