全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（12）：2354–2364 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–05–20；修回日期：2013–11–26
基金项目：江苏省科技支撑计划项目（BE2011415）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：qscnj@njau.edu.cn）
MhRAR1 和 MhSGT1 基因转化苹果提高轮纹病
菌诱导的抗氧化酶活性
屠煦童，张仕杰，吕 东，陈小云，章 镇，渠慎春*
（南京农业大学园艺学院，南京 210095）
摘 要：RAR1 和 SGT1 是植物 R 基因（抗病基因，resistance genes）介导的抗病防卫途径中的两个重
要信号元件，在 R 蛋白下游和活性氧产生之间发挥作用。为了研究湖北海棠 MhRAR1 和 MhSGT1 基因在
感病苹果品种植株内的表达特性及其抗病功能，利用农杆菌介导法将两种基因分别转入富士苹果。对 Hyg
阳性植株进行 PCR 和 RT-PCR 检测，6 个转 MhRAR1 株系和 3 个转 MhSGT1 株系呈阳性；两种转基因苹
果株系被苹果轮纹病病原菌侵染后，与对照相比都表现出抗氧化酶（SOD/POD/CAT）活性迅速升高、MDA
含量变化较平缓的趋势，进一步说明 RAR1 和 SGT1 基因能够作用于苹果体内的活性氧反应和细胞膜活动
进程，对植株受到外部侵害后的抗性反应有促进作用。
关键词：苹果；湖北海棠；MhRAR1；MhSGT1；转基因；轮纹病；抗氧化酶活性
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）12-2354-11

Transformation of Malus × domestica with MhRAR1 and MhSGT1 Genes
from Malus hupehensis for Resistance of Botryosphaeria berengeriana
TU Xu-tong，ZHANG Shi-jie，LÜ Dong，CHEN Xiao-yun，ZHANG Zhen，and QU Shen-chun*
（College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）
Abstract：RAR1 and SGT1 were identified as required components in some signaling pathways
mediated by disease resistance（R）genes in many plant species，and they function between the downstream
of R protein and reactive oxygen. To understand the expression characteristics and resistant function of
MhRAR1 and MhSGT1 in susceptible variety，the two genes were transferred respectively into the Fuji
apple by Agrobacterium tumefaciens-mediated method. After PCR and RT-PCR amplifications on Hyg
positive plants，6 MhRAR1 strains and 3 MhSGT1 strains were screened. Infected by Botryosphaeria
berengeriana， the transgenic plants displayed more rapidly increase on all antioxidant enzymes
（SOD/POD/CAT）activities and gentle changing waves of MDA content. It further illustrated that RAR1
and SGT1 act on the reaction of reactive oxygen species and the process of membrane reaction，as well as
promote the resistant to external infringed reaction in apple.
Key words：apple；Malus hupehensis；MhRAR1；MhSGT1；transgenic；Botryosphaeria berengeriana；
antioxidant enzymes activity

12 期 屠煦童等：MhRAR1 和 MhSGT1 基因转化苹果提高轮纹病菌诱导的抗氧化酶活性 2355

RAR1（required for Mla-specified resistance）和 SGT1（supressor of G2 allele of SKP1）是植物 R
基因（抗病基因，resistance genes）介导的抗病防卫途径中的两个重要信号元件，在 R 蛋白下游和
活性氧产生之间发挥作用。在大麦 MLA 类基因介导的抗白粉病途径中发现，不同基因对 RAR1 或
SGT1 需求量存在差异，说明 RAR1 或 SGT1 的表达水平必须达到某一阈值时，才能使植株 R 蛋白
介导抗性表达。推测在植物体内增加 RAR1 或 SGT1 的表达量会增加植株抗病能力。RAR1 蛋白的
CHORD-Ⅱ与 SGT1 蛋白的 CS 基元可以参与相互作用（Schulze-Lefert & Vogel，2000）。大麦 RAR1 和
SGT1 共沉默增加了对白粉病的感病性（Azevedo et al.，2002），拟南芥 SGTl/RARl 双突变体高感霜霉病，
超敏反应及活性氧积累下降。推测 RAR1 与 SGT1 可能以 3 种形式（SGT1/RAR1，RAR1，SGT1）参与植
物的防卫反应（Austin et al，2002；Muskett et al.，2002）。李为民等（2004）将海岛棉（Gossypium
barbadense）GbRAR1 和 GbSGT1 基因分别在烟草中超量表达，可以使其对赤星病抗性增强。因此，
利用 RAR1、SGT1 类基因来增强植物的对病害的抗性有较好的发展前景。在多种大田作物和模式植
物中，已经进行了很多关于 RAR1 和 SGT1 类基因在其中转化和表达的研究，发现这两类基因在植
物体内表达后能够产生广谱的抗病性提高（Muskett & Parker，2003；Bieri et al.，2004；Jarosch et al.，
2005；Azevedo et al.，2006；Bhaskar et al.，2008）。但是这两类基因在木本植物，尤其是苹果中的研
究还比较少。
苹果轮纹病，又名粗皮病、轮纹褐腐病，是由苹果轮纹病病原菌[Botryosphaeria berengeriana de
Not f. sp. piricola（Nose）]引起的真菌性病害，是危害苹果产业化生产的主要病害之一。由于能够
在苹果的多个部位发病，所以常被用于苹果的抗病性检测和抗病品种的筛选。‘长富 6 号’（Nagafuji
6）是富士系苹果品种，综合性状优良，但与其他富士苹果品种一样，属于轮纹病高感品种，对多种
病害、虫害抵抗能力较差。
湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp.）Rehd.]是原产于中国的种质资源，对多种病虫害具有较强
的抗性，因此被广泛用作苹果砧木。本研究中利用从湖北海棠中克隆出的 MhRAR1 和 MhSGT1 基因，
采用农杆菌介导法将两种基因分别转入富士苹果，探索两种基因的表达特性及其抗病功能，为其作
为苹果广谱抗性育种的潜在重要基因资源提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
遗传转化材料为‘长富 6 号’苹果的组培苗，由陈秀孔于 2010 年建立，保存于南京农业大学
园艺学院果树分子生物技术实验室。
组培苗 25 ~ 30 d 继代 1 次，继代培养基为 MS + 6-BA 1.0 mg · L-1 + NAA 0.04 mg · L-1；生根苗
在接入培养基后先经过 14 d 的暗培养，再转到光下培养以便于生根，生根培养基为 l/2MS + IAA 0.5
mg · L-1 + IBA 0.3 mg · L-1；选择生长发育良好，整齐一致的植株为试材。培养条件为（25 ± 2）℃、
光照强度 2 000 lx、光暗周期 16 h/8 h（下同）。
1.1.2 基因材料
目的基因 MhRAR1（FJ593502）和 MhSGT1（FJ598134）由张计育博士于 2009 年在南京农业大
学园艺学院果树生物技术实验室从湖北海棠中克隆。选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶（hpt）基因。
载体 pCAMBIA-S1300+，见图 1。

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图 1 pCAMBIA-S1300+质粒
Fig. 1 pCAMBIA-S1300+ plasmid

农杆菌菌株 EHA105。
根据两种目的基因设计酶切位点特异引物，用 SpeⅠ和 KpnⅠ进行双酶切，扩增片段的长度分
别为 628 个核苷酸和 1 023 个核苷酸（表 1）。

表 1 PCR 检测用引物
Table 1 Primers for PCR detection
目的基因
Target gene
引物类别
Primer category
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
片段长度/ bp
Fragment length
上游 Up MhRaF1 5′-CCACTAGTGGATGGAGGGTC-3′MhRAR1
下游 Down MhRaR2 5′-GGTACCTTAAGATACCGGGT-3′
628
MhSGT1 上游 Up MhSgF2 5′-ACTAGTATGGCTTCCGATCTCG-3′ 1 023
下游 Down MhSgR1 5′-GGGTACCCTAGAACTCCCATT-3′

1.1.3 主要生化试剂
各种限制性内切酶、PMD18-T Vector、rTaq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶购自大连宝生物工程
公司。凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。ReverTra Ace qPCR RT
kit（TOYOBO，中国）由于博飞科技有限公司，SYBR® Premix Ex Taq™（Perfect Real Time）（TaKaRa，
中国）购于皓嘉有限公司。
1.2 方法
1.2.1 农杆菌介导转化苹果
挑取含有目的基因的菌株，在 YEB 固体培养基（含 Km 50 mg · L-1 + Rif 50 mg · L-1）上划板，
28 ℃、暗培养 3 d。然后挑取单菌落，接种到 YEB 液体培养基中（含 Km 50 mg · L-1 + Ref 50 mg · L-1），
12 期 屠煦童等：MhRAR1 和 MhSGT1 基因转化苹果提高轮纹病菌诱导的抗氧化酶活性 2357

28 ℃、250 r · min-1 摇床培养 12 ~ 16 h，至菌液 OD600 ≈ 0.5。将菌液 5 000 r · min-1 离心 10 min，菌
体用 50 mL MS0 液体培养基（MS 基本培养基，不含激素，不调 pH，含 75 μmol · L-1 的乙酰丁香酮
AS）在摇床上重悬浮培养 1 h。
取苗龄 40 d 左右已经生根的苹果组培苗，从顶部剪取 4、5 片完全展开叶，每片叶顺叶脉横剪
两至三刀，但不使叶片分离，将剪后的叶片放入盛有少量 MS0 液体培养基（含 AS）的三角瓶中浸
泡。重悬浮的菌液活化好后，将三角瓶中的 MS0 倒掉，倒入菌液浸染 4 min，其间不断轻轻摇晃三
角瓶使菌液与叶片伤口充分接触。经菌液侵染后，取出叶片放在无菌滤纸上吸去多余菌液，远轴面
向下放置（正放）在苹果共培养培养基（MS + NAA 0.6 mg · L-1 + TDZ 4.0 mg · L-1）中，25 ℃黑暗
共培养 3 d。
共培养结束后，首先将叶片用 MS0（加入 200 mg · L-1 羧苄青霉素 Cb）清洗 1 遍，再放入不含
Hyg 的选择培养基（MS + NAA 0.6 mg · L-1 + TDZ 4.0 mg · L-1 + Cb 200 mg · L-1）上，25 ℃黑暗条件
下培养 7 d。将经过延时筛选后的叶片转入附加 Hyg 的苹果筛选培养基（MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 +
NAA 0.6 mg · L-1 + TDZ 4.0 mg · L-1 + Cb 200 mg · L-1 + Hyg 1.0 mg · L-1）中，继续暗培养 7 d。暗培养
结束后，转换 1 次培养基（叶片正、反面交替放置），转到光暗周期 16 h/8 h 的条件下培养，分化愈
伤组织，每 15 d 转换 1 次培养基，直至分化出抗性芽。
待抗性芽长至 1 ~ 2 cm 时，剪下，转入苹果继代筛选培养基（MS + 6-BA 1.0 mg · L-1 + NAA 0.04
mg · L-1 + Hyg 1.0 mg · L-1）中促进抗性芽伸长，每 30 d 继代 1 次。继代 3 次后，统计存活下来的抗
性芽数，计算再生率（再生不定芽的外植体数/接种总外植体数 × 100%）、平均再生芽数（外植体再
生不定芽总数/接种总外植体数）、抗性芽诱导率（4 次筛选后形成 Hyg 抗性芽的外植体数/接种外植
体总数 × 100%）、平均抗性芽数（4 次筛选后外植体形成 Hyg 抗性芽总数/接种总外植体数）。并将
其转到苹果生根筛选培养基（l/2MS + IAA 0.5 mg · L-1 + IBA 0.3 mg · L-1 + Hyg 1.0 mg · L-1）中，暗培
养 14 d 后，转到光暗周期（16 h/8 h）条件下，促进生根。
1.2.2 转基因植株的分子检测
对照及 Hyg 阳性苹果转基因植株基因组 DNA 的提取采用常规 CTAB 法（Clark，1998）。苹果
叶片总 RNA 提取采用 CTAB 法（蔡斌华 等，2008），略有改动。消化总 RNA 中 DNA 后，按照 ReverTra
Ace-a-TM 反转录试剂盒（ToYoBo 日本）合成 cDNA 第一链。
PCR 扩增以 DNA 为模板，采用两基因各自的上下游引物；25 μL PCR 总反应体系中含模板 1 μL
（20 ~ 50 ng），上下游引物各 1 μL（10 μmol · L-1），dNTPs 2 μL（2.5 mmol · L-1），MgCl2 1.5 μL，
rTaqDNA 聚合酶 0.125 μL，10× Buffer 2.5 μL，其余用 ddH2O 补充。PCR 反应条件为：94 ℃ 4 min；
（94℃ 30 s，退火 30 s，72℃ 1 min）× 35 个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。退火温度：53 ℃（MhRAR1），
56 ℃（MhSGT1）。
RT-PCR 以 cDNA 为模板进行扩增，引物、反应条件和反应体系同 PCR 扩增。
扩增产物在 1× TAE 缓冲条件下，用 1%琼脂糖凝胶分离，0.5 μg · mL-1 的溴酚蓝溶液染色，电
泳后的凝胶在上海复日科技生产的 FR-200 紫外与可见分析装置上进行照相，电泳谱带分析。
1.2.3 转基因植株的抗病性分析
将苹果轮纹病病原菌（Botryosphaeria berengeriana）接种于 PSA 培养基上，在恒温培养箱内离
体培养，温度设定（28 ± 2）℃，24 h 日光灯照射。培养 7 d 后，待菌丝长满平板将其轻轻刮除，转
到黑光灯（12 h）与日光灯（12 h）交替光照条件下继续培养 20 d，以促进分生孢子囊的生长和萌
发。待分生孢子囊成熟后，用镊子轻轻摘取下来并溶于无菌水，轻轻研磨后用无菌水制成苹果轮纹
病病原菌孢子悬浮液（浓度约为 1 × 105 个 · mL-1）。
生根培养生长 40 d 后，分别选取 3 个株系的转基因苹果和非转基因苹果已生根的组培苗，用 2
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mL 轮纹病病原菌孢子悬浮液（浓度 1 × 105 个 · mL-1）和清水对瓶内植株进行喷施处理，然后在原
条件下继续培养组培苗。在处理后 0、24、48、72、96 和 120 h 分别进行叶片取样，并分别测定与
苹果抗病性相关的抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD、过氧化物酶 POD、过氧化氢酶 CAT）活性及丙
二醛（MDA）含量（李合生，2000）。
2 结果与分析
2.1 苹果遗传转化
通过农杆菌介导法分别转化 MhRAR1 和 MhSGT1 两种基因，转基因植株的不同时期生长发育情
况见图 2。





























图 2 转 MhRAR1 基因苹果不同时期组培苗（A）和转 MhSGT1 基因苹果不同时期组培苗（B）
Fig. 2 Transgenic apple plant of MhRAR1 in different culture stages（A）and transgenic apple plants of MhSGT1
in different culture stages（B）
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在转化两种基因过程中，虽然转化后产生不定芽的外植体数较高，但是经过 4 次低浓度 Hyg（1.0
mg · L-1）筛选后，能够存活下来的抗性芽数却相对较少，说明使用该方法转化效率较低。转化MhRAR1
基因的苹果叶片，其不定芽再生率和抗性芽诱导率均高于转化 MhSGT1 基因的苹果叶片（表 2）。

表 2 苹果转化效率统计
Table 2 The average transformation frequency of apple
目的基因
Target gene
外植体总数
Total explants
regenerated buds
平均再生芽数
Average adventitious
buds
再生率/%
Regeneration frequency
平均抗性芽数
Average Hyg-resistant
buds
抗性芽诱导率/%
Induction frequency
MhRAR1 400 2.64 56.77 0.31 2.47
MhSGT1 500 1.76 41.25 0.22 1.53

2.2 转基因植株分子检测
2.2.1 PCR 分析
以经过 4 次 Hyg 抗性筛选和非转基因苹果组培苗叶片为材料，提取基因组 DNA，以基因特异
引物 MhRaF1/MhRaR2 或 MhSgF2/MhSgR1 进行 PCR 扩增，检测目的基因是否整合到苹果基因组中。
分别以携带有 MhRAR1 或 MhSGT1 基因的质粒为阳性对照，以非转基因苹果叶片的 DNA 为阴性对
照。将 PCR 产物进行凝胶电泳分析（图 3）。
图 3，A 显示：阴性对照中没有扩增产物，在 8 个转 MhRAR1 基因的苹果株系中全部扩增出与
阳性对照大小一致的条带，初步证明 MhRAR1 已整合到 8 个株系苹果基因组中。图 3，B 显示：在
8 个 Hyg 阳性株系中，有 7 个株系扩增出比较清晰的与阳性对照大小一致的条带，可以初步证明
MhSGT1 基因已整合到这 7 个株系苹果的基因组中。















图 3 Hyg 阳性苹果株系的 PCR 检测
A：转 MhRAR1 苹果株系；B：转 MhSGT1 苹果株系。M：Marker；CK+：阳性对照；CK-：阴性对照；1 ~ 8：转基因苹果株系。
Fig. 3 PCR analysis of the Hyg positive apple plants
A：Transgenic apple plant of MhRAR1；B：Transgenic apple plants of MhSGT1. M：Marker；CK+：Plasmid；
CK-：Non-transgenic plants；1–8：Hyg positive apple plants.

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2.2.2 RT-PCR 分析
以上述转基因株系为材料，提取总 RNA，以特异引物 MhRaF1/MhRaR2 和 MhSgF2/MhSgR1 进
行 RT-PCR 扩增，检测两种目的基因是否分别能够在转录水平表达。分别以携带有 MhRAR1 或
MhSGT1 两种基因的质粒为阳性对照，以非转基因苹果叶片的 cDNA 为阴性对照，将 RT-PCR 产物
进行凝胶电泳分析（图 4）。
图 4，A 显示：在 8 个 Hyg 抗性株系中，有 6 个转 MhRAR1 基因的苹果株系扩增出与阳性对照
大小一致的条带，阴性对照和株系 5、8 中没有扩增产物。说明 MhRAR1 基因在 1、2、3、4、6、7
等转基因苹果株系中成功转录。图 4，B 显示：在 8 个 Hyg 抗性株系中，仅有 4 个株系可以扩增出
与阳性对照大小一致的条带；阴性对照和株系 4 ~ 7 中没有扩增产物。说明 MhSGT1 基因在转基因
苹果株系 1 ~ 3 和 8 中在转录水平上成功表达。

图 4 转基因苹果株系的 RT-PCR 检测
A：转 MhRAR1 苹果株系；B：转 MhSGT1 苹果株系。M：Marker；CK+：阳性对照；
CK-：阴性对照；1 ~ 8：转基因苹果株系。
Fig. 4 RT-PCR analysis of the PCR positive apple plants
A：Transgenic apple plant of MhRAR1；B：Transgenic apple plants of MhSGT1. M：Marker；CK+：Plasmid；
CK-：Non-transgenic plants；1–8：Transgenic plants.

2.3 转基因株系的抗病性分析
结果（图 5，图 6）表明：使用清水处理的转基因苹果株系和非转基因苹果的组培苗的叶片的
SOD、POD、CAT 及 MDA 含量均未出现明显变化。
使用苹果轮纹病菌孢子悬浮液侵染两种转基因苹果株系，前期（0 ~ 72 h）SOD 活性呈现上升
趋势，而非转基因株系被侵染后，体内 SOD 活性经过前期（0 ~ 48 h）小幅波动后才有一个较大幅
度的上升，且转基因株系的 SOD 酶活性始终高于非转基因对照株系。
同时 POD 和 CAT 的活性变化都总体呈现“先上升、后下降”的趋势。但是在侵染前期（0 ~ 48
h），转化两种基因的苹果株系，其 POD 活性的上升速度明显比非转基因对照快，而且后期下降的幅
度也相对较小。而转基因株系的 CAT 活性的上升速度也明显比非转基因对照快，且峰值出现更早。
被轮纹病孢子侵染后，体内 MDA 含量迅速升高，随后又恢复到接近正常的水平，其 MDA 含
量上升幅度比较平缓，之后下降的幅度却比对照明显。
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图 5 轮纹病病原菌侵染后转 MhRAR1 基因苹果株系的
抗氧化酶活性和丙二醛含量变化
RY1、RY2、RY3：转 MhRAR1 基因苹果株系；
CK：非转基因；W：清水。
Fig. 5 The activity of defense enzymes and content of MDA
in apple plants of MhRAR1
RY1，RY2，RY3：Transgenic apple plant of MhRAR1；
CK：Non-transgenic；W：Water.
图 6 轮纹病病原菌侵染后转 MhSGT1 基因苹果株系的
抗氧化酶活性和丙二醛含量变化
SY1、SY2、SY3：转 MhSGT1 基因苹果株系；
CK：非转基因；W：清水。
Fig. 6 The activity of defense enzymes and content of MDA
in apple plants of MhSGT1
SY1，SY2，SY3：Transgenic apple plants of MhSGT1；
CK：Non-transgenic；W：Water.
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3 讨论
对模式植物抗病机制的研究表明，大部分寄主植物通过 R 基因产物与相应病原致毒基因产物直
接或间接作用，来感受某种病原物的入侵，进而激活寄主自身的防御反应（Belkhadir et al.，2004），
产生一系列信号分子、活性氧中间体（reactive oxygen intermediates，ROI），使被侵染部位细胞程序
化死亡（programmed cell death，PCD）、局部发生超敏反应（hypersensitive reaction，HR）（Hammond-
Kosack & Jones 1997；Dangl & Jones，2001），从而使病原菌在侵染点不易获取养分。一般伴随着活
性氧的产生和病程相关基因的表达，HR 可以限制病原菌的生长繁殖；而产生 HR 的细胞也可能同
时向侵染点附近组织释放调节防御反应的信号分子（Shirasu et al.，1999；Austin et al.，2002），进
而诱发整个植株的防卫基因表达，产生系统获得抗性（SAR）。
研究植物 R 蛋白防卫反应信号系统的一条有力途径，是辨认与所抗病原相亲和的突变体，通过
鉴定大量与植物防卫反应相关的拟南芥突变体，已经发现 NDR1、EDS1、RAR1（required for Mla-
specified resistance）、SGT1（supressor of G2 allele of SKP1）和 HSP90（Heat shock protein 90）等几
种 R 基因下游的信号元件，并对这几个基因的相关功能和作用模式进行了研究。RAR1 和 SGT1 分
别作用于不同类型的 R 蛋白下游与活性氧激发之间（Horseh et al.，1985；Tor et al.，2002）；NDR1
定位于活性氧激发与随后的水杨酸（SA）合成之间（Shapiro & Zhang，2001）；EDS1 作用于 SA 介
导的防卫反应上游（Falk et al.，1999）；NPR1 功能定位于 SA 合成与 SAR 发生之间，是 SAR 的一
个重要调控因子。这些蛋白质本身对病原物并无抑制作用，但作为信号元件可以参与不同植物防卫
反应途径的调控，并具有广泛的抗病效应。
近年来，随着转基因技术的进步，苹果抗真菌病害的转基因研究成为热点之一。如张丽丽（2007）
将 β–1,3–葡聚糖酶基因成功转入嘎啦苹果中；王英（2009）将相同基因转入了富士苹果，并利用
苹果轮纹病病原菌对转基因植株进行了抗病性分析以验证基因功能；徐凌飞等（2007）将几丁质酶
基因和 β–1,3–葡聚糖酶基因转入嘎啦苹果中。Flachowsky 等（2008）将山荆子中 mbr4 基因过量
表达提高了转基因苹果植株对火疫病的抗性。陈秀孔等（2011）对长富 6 号苹果不定芽再生技术进
行了摸索，本实验室也对富士苹果高效转化体系的建立进行了长期的研究，这些都为本研究的开展
奠定了良好的基础。但是在实验中，发现利用已有的苹果转化体系，仍旧不能快速得到较高的转化
效率，需不断完善、优化转化体系。
本研究中利用农杆菌介导的叶盘法，将从抗病性较高的苹果砧木湖北海棠中克隆的 MhRAR1 和
MhSGT1 基因分别转入易感病的富士苹果。对 Hyg 筛选后的植株进行 PCR 和 RT-PCR 检测后初步确
定了目的基因在阳性株系中的转录表达。由于 PCR 扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩增，因此对
通过 PCR 检测的阳性株系进行 RT-PCR 检测，又从这些转基因株系中筛选出多个在反转录水平上失
败的株系。推测这种现象可能是发生了 PCR 假阳性或出现了转录水平的基因沉默，由启动子 DNA
序列发生甲基化或是导入的基因发生异染色质化所造成。
植物在与病原物长期共存进化的过程中形成了一整套防御机制。病原菌的侵染可激发植物体的
系统获得抗性反应机制，使其对之后病原菌的持续性侵染表现出很强的抗性（Jones & Dangl，2006）。
苹果轮纹病病原菌的侵染途径主要是皮孔侵入。附着在皮孔周围的孢子可直接萌发形成侵染菌丝侵
入皮孔形成病瘤，接着产生许多生理生化反应，影响植株的正常生长。对转化两种基因的苹果植株，
分别使用苹果轮纹病分生孢子及清水进行处理，并在处理后 120 h 内测定抗氧化酶（SOD、POD、
CAT）活性和 MDA 含量的变化。在孢子悬浮液侵染前期（0 ~ 72 h）两种转基因苹果株系内的 SOD
活性始终呈现上升的趋势，说明这段时期内经侵染过程产生的超氧阴离子会激发植株体内 SOD 合成
12 期 屠煦童等：MhRAR1 和 MhSGT1 基因转化苹果提高轮纹病菌诱导的抗氧化酶活性 2363

酶基因的表达，表现为 SOD 活性上升。而非转基因株系被侵染后，体内 SOD 活性经过前期（0 ~ 48
h）小幅波动后才有一个较大幅度的上升，可能是因为植株内的超氧阴离子刚开始积累较多，SOD
酶反应体系需要更长时间才能逐步歧化超氧阴离子。而 POD 和 CAT 的活性上升速度均明显快于对
照，说明转基因苹果经病菌侵染后体内 H2O2 的转化速度要比对照快。由于刚侵染轮纹菌时植物细
胞膜脂过氧化程度迅速加剧；但随着保护酶活性的升高可以有效地减少轮纹菌浸染对植物的伤害，
MDA 含量逐渐下降。转化两种基因的苹果株系，其 MDA 含量上升幅度比较平缓，之后下降的幅度
却比对照要明显，说明细胞膜系统受到的损伤会相对较小。而无论是转基因或非转基因苹果植株在
喷施清水处理后，叶片 SOD、POD 和 CAT 活性和 MDA 含量均未出现明显变化，表明植株体内 SOD、
POD、CAT 活性和 MDA 含量的变化是由苹果轮纹病分生孢子侵染引起。由此推测，MhRAR1 或
MhSGT1 基因的过量表达可能激发转基因苹果的某些防卫途径，使 R 蛋白能够利用组成型表达的相
关蛋白调动植物的防卫机制，迅速做出应答。也可以进一步说明说明 RAR1 和 SGT1 类基因能够作
用于苹果体内的活性氧反应和细胞膜活动进程中，对植株受到外部侵害后的抗性反应有促进作用。

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